刺葡萄酒渣中白藜芦醇的超声辅助提取工艺优化

刺葡萄酒渣中白藜芦醇的超声辅助提取工艺优化
刘婷;欧阳梦云;王燕;吴佳;李凯;刘宾翰
【摘要】利用响应面法优化超声辅助提取刺葡萄酒渣中白藜芦醇的工艺条件.通过单因素试验选取80％乙醇为提取溶剂,选择超声温度、超声时间、料液比进行三因素三水平响应面回归分析,得出超声辅助提取白藜芦醇的最优工艺条件为:超声温度61℃,超声时间49 min,料液比1∶17(m∶V),该条件下白藜芦醇的提取率为191.53 μg/g,且以反式白藜芦醇苷的形式存在.
【期刊名称】《食品与机械》
【年(卷),期】2014(030)006
【总页数】5页(P160-164)
【关键词】刺葡萄;酒渣;白藜芦醇;超声
【作者】刘婷;欧阳梦云;王燕;吴佳;李凯;刘宾翰
【作者单位】湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学食品科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙410128;湖南农业大学东方科技学院,湖南长沙410128
【正文语种】中文
白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，具有酚和芪的特性，无味，白色针状晶体，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷、丙酮等有机溶剂。

天然白藜芦醇有顺、
反两种结构，自然界中主要以反式构象(生理活性强于顺式异构体)存在，且两种结构都可与葡萄糖结合，分别形成顺式和反式白藜芦醇糖苷［1］。

研究发现，白藜芦醇具有抗炎、抗过敏、抗病原微生物［2］、诱导肿瘤细胞凋亡［3］、提高免疫功能［4］、降低血脂、抗血小板聚集［5］等多种生理活性，已被喻为继紫杉醇后又一新的绿色抗癌药物。

白藜芦醇主要存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹、松树等21个科、31个属的72种植物中，在湖南、贵州等地的刺葡萄中含量较高［6］。

刺葡萄(V.didii.Foex)是中国南方主要野生葡萄品种之一，湖南湘西一带拥有广泛的刺葡萄野生资源。

刺葡萄具有粒小、皮厚、色深和产量高等特点，作为食用鲜果其市场受到一定限制［7］，但适宜用于葡萄酒的酿造［8］。

由于中国葡萄酒生产季节性强、生产集中，酿酒后的酒渣往往来不及处理就被随意抛弃或作为废料处理，造成了极大的环境污染和资源浪费，因此，从刺葡萄酒渣中提取有价值的活性物质，变废为宝，具有重要的经济与环保效益。

目前从刺葡萄酒渣中提取白藜芦醇未见报道，本研究拟采用超声辅助法从刺葡萄酒渣中提取白藜芦醇，并对提取工艺进行优化，以期为刺葡萄的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
刺葡萄酒渣:紫秋刺葡萄，湖南华淳庄园酒业有限公司;
反式白藜芦醇苷标准品:纯度＞98.6%，成都曼思特生物科技有限公司;无水乙醇:分析纯，国药集团化学试剂有限公司;甲醇、乙腈:色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪:Agilent 1100 Series型，安捷伦科技有限公司;
电子分析天平:CP214型，奥豪斯仪器(上海)有限公司;
电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9240A型，上海飞越实验仪器有限公司;
中草药粉碎机:FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司;
数控超声波清洗器:KQ-250DE型，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法
1.3.1 原材料预处理经电热恒温鼓风干燥箱50℃烘干，粉碎，过40目筛，4℃下
避光储藏，备用。

1.3.2 单因素试验
(1)溶剂(乙醇)浓度对白藜芦醇提取率的影响:准确称取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分别放于不同的100 mL棕色容量瓶中，在料液比1∶15(m∶V)，超声时间
40 min，超声温度55℃的条件下，分别用20%，40%，60%，80%，99.7%的
乙醇对刺葡萄酒渣中的白藜芦醇进行提取，快速滤纸过滤，再经0.22 μm有机微
孔滤膜后，用高效液相色谱测定白藜芦醇含量。

(2)料液比对白藜芦醇提取率的影响:准确称取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分别放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30(m∶V)分别加入一定体积80%的乙醇，在55℃下超声提取40 min，快速
滤纸过滤，再经0.22 μm有机微孔滤膜后，用高效液相色谱测定白藜芦醇含量。

(3)超声时间对白藜芦醇提取率的影响:准确称取6份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分别放于不同的100 mL棕色容量瓶中，用80%的乙醇在料液比1∶15(m∶V)，55℃条件下，分别超声提取 10，20，30，40，50，60 min，快速滤纸过滤，再经
0.22 μm有机微孔滤膜后，用高效液相色谱测定白藜芦醇含量。

(4)超声温度对白藜芦醇提取率的影响:准确称取5份1.000 g刺葡萄酒渣粉末，分别放于不同的100 mL棕色容量瓶中，按料液比1∶15(m∶V)加入80%的乙醇，
分别在25，40，55，70，85 ℃下超声提取40 min，快速滤纸过滤，再经0.22
μm有机微孔滤膜后，用高效液相色谱测定白藜芦醇含量。

1.3.3 响应面法优化试验在单因素试验基础上，根据Box-Behnken原理，以白藜芦醇提取率为响应值，对料液比、超声温度、超声时间进行三因素三水平的响应面试验设计，运用Design-Expert 8.0.5.0软件对数据进行分析优化，得出刺葡萄酒渣中白藜芦醇的最佳提取工艺。

1.3.4 白藜芦醇提取率的测定
(1)色谱条件:参照GB/T 15038—2006，最终确定高效液相色谱测定条件为色谱柱:Agilent，ODS C18 hypersil(250 mm ×4.5 mm，5 μm);流动相:乙腈 +重蒸
水 =30%+70%;柱温:21℃;流速:1.0 mL/min;检测波长:306 nm;进样量:10 μL。

(2)标准曲线制作:精确称取2.000 mg反式白藜芦醇苷标准品于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得浓度为200 μg/mL的反式白藜芦醇苷标准储备液。

分别准确吸取0.25，0.5，1，2，4 mL 于5 个不同的10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀得 5，10，20，40，80 μg/mL 的反式白藜芦醇苷系列
标准液。

取10 μL在1.3.4(1)条件下进样，以吸收峰面积值(Y)为纵坐标，反式白
藜芦醇苷浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线回归方程:
式中:
Y——白藜芦醇苷吸收峰面积;
X——白藜芦醇苷浓度，μg/mL。

(3)样品测定:吸取待测液10 μL，在 1.3.4(1)条件下测定，重复2次。

根据标准曲
线得出待测液中白藜芦醇苷的浓度，按式(2)计算提取率:
式中:
R——白藜芦醇苷的提取率，μg/g;
C——待测液中白藜芦醇苷的浓度，μg/mL;
V——提取溶剂的体积，mL;
M——样品的质量，g。

2 结果与讨论
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 乙醇浓度对白藜芦醇提取率的影响由图1可知，随着乙醇浓度的增加，白藜芦醇的提取率逐渐提高，当提取剂乙醇浓度为80%时，提取率达到最大值，继续增加乙醇浓度，白藜芦醇提取率反而略有下降。

这可能是因为白藜芦醇含有多个酚羟基，具有较大的极性，根据相似相溶原理，当溶剂极性与白藜芦醇极性相当时，白藜芦醇溶解性大，提取率高。

但乙醇浓度过高时，大量脂溶性色素溶出，与白藜芦醇竞争溶剂分子，从而导致白藜芦醇提取率略有下降。

故选取80%乙醇为提取剂。

图1 乙醇浓度对白藜芦醇提取率的影响Figure 1 Effects of ethanol concentration on the extraction of resveratrol
2.1.2 料液比对白藜芦醇提取率的影响由图2可知，在料液比为1∶10～
1∶20(m∶V)时，白藜芦醇的提取率随着溶剂体积的增加而增大，但当料液比小于1∶20(m∶V)后，随着溶剂体积的增大，白藜芦醇的提取率反而降低。

这是由于在提取过程中，刺葡萄酒渣粉末的质量固定，当溶剂体积较小时，随着溶剂的增加，有效成分与溶剂的接触面积增大，从而使白藜芦醇的提取率升高;但当溶剂体积过大时，超声波辐射被溶剂大量吸收，穿透能力下降，作用于物料的有效辐射降低，从而影响有效成分的提取［9］，同时溶剂体积过大会造成溶剂浪费。

故选取最佳料液比为1∶20(m∶V)。

2.1.3 超声时间对白藜芦醇提取率的影响由图3可知，随着超声时间的延长，白藜芦醇的提取率上升，且在40 min内，增幅明显。

但提取时间超过40 min后，白藜芦醇的提取率趋于平稳，甚至略有下降，这可能是由于超声时间过长，空化效应
的作用力降低，也有可能是长时间的超声破坏了白藜芦醇的结构，导致白藜芦醇部分降解。

故选取最佳提取时间为40 min。

图2 料液比对白藜芦醇提取率的影响Figure 2 Effects of solid/solvent ratio on the extraction of resveratrol
图3 超声时间对白藜芦醇提取率的影响Figure 3 Effects of ultrasonic time on the extraction of resveratrol
2.1.4 超声温度对白藜芦醇提取率的影响由图4可知，随着超声温度的升高，白藜芦醇的提取率逐渐提高，这是因为超声温度升高能使植物组织软化，提高有效成分的扩散速度;当温度为55℃左右时，提取率达到最大值，继续提高超声温度，白藜芦醇的提取率略有下降。

且高温会破坏白藜芦醇的生理活性，故选取最佳超声温度为55℃。

图4 超声温度对白藜芦醇提取率的影响Figure 4 Effects of ultrasonic temperature on the extraction of resveratrol
2.2 响应面法优化试验
2.2.1 响应面分析试验结果综合单因素试验结果，选取料液比、超声温度、超声时间为响应面优化的三因素，对白藜芦醇的提取率进行分析，具体试验方案及结果见表1、2。

表1 响应面分析试验因素水平表Table 1 Factors and levels of RSM test水平 A 料液比(m∶V)B超声温度/℃ C超声时间/min－1 1∶10 40 30 0 1∶15 55 40 1 1∶20 70 50
表2 响应面分析试验设计方案及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis试验号 A B C Y白藜芦醇提取率/(μg·g－1)1－1 1 0 165.20 2 1 1 0 178.50 3 0 －1 －1 146.80 4－1 －1 0 145.60 5 0 －1 1 168.06 6－1 0 1 168.60 7 1 －1 0 158.08 8 1 0 －1 156.50－1 0 －1 149.30
10 0 1 1 184.08 11 1 0 1 186.20 12 0 1 －1 158.04 13 0 0 0 184.60 14 0 0 0 181.56 15 0 0 0 182.00 16 0 0 0 185.20 9 17 0 0 0 183.08
运用Design-Expert 8.0.5.0软件对表2中试验数据进行多元回归分析，得刺葡萄酒渣中白藜芦醇的提取率与所选3个因素的二元多次回归方程为:
对表2试验数据进行方差分析，结果见表3。

由表3可知，模型的F=86.81，P＜0.000 1，表示模型显著，且模型的失拟项P=0.175 8＞0.05，不显著，表明模型拟合度较好，残差均由随机误差引起。

模型的决定系数R2=0.991 1，表明响应值白藜芦醇提取率实际值与预测值之间具有良好的拟合度，调整系数 Radj2=0.979 7，说明该模型能用于解释97.97%响应值的变化，预测系数Rpred2=0.899 7，
说明该模型预测性良好［10，11］，所以，该模型可用于刺葡萄酒渣中白藜芦醇
提取条件的分析和预测。

且各因素的一次项和二次项的影响均为极显著(P≤0.01)，说明各因素对刺葡萄酒渣中白藜芦醇提取率的影响并非简单的线性关系［12］。

根据各因素F值的大小可得，影响白藜芦醇提取率的因素主次顺序为:超声时间＞
超声温度＞料液比。

表3 响应面结果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface results ＊＊表示影响极显著，P≤0.01;*表示影响显著，P≤0.05;N表示影响不显著，P＞0.05。

方差来源平方和自由度均方 F值 P 值显著性模型 3 448.84 9 383.20 86.81 ＜0.000 1＊＊A 319.79 1 319.79 72.45 ＜0.000 1 ＊＊
3 479.7
4 16 B 30.90 7 4.41失拟项 20.83 3 6.94 2.76 0.17
5 8 N纯误差 10.07
4 2.52总和565.82 1 565.82 128.19 ＜0.000 1 ＊＊C 1 159.21 1 1 159.21 262.61 ＜0.000 1 ＊＊AB 0.71 1 0.17 0.038 0.850 8 N AC 27.04 1 27.04 6.13 0.042
5 *BC 5.71 1 5.71 1.29 0.292 7 N A2 444.01 1 444.01 100.59 ＜0.000 1 ＊＊B2 525.72 1 525.72 119.10 ＜0.000 1 ＊＊C2 260.72 1 260.72 59.07
0.000 1 ＊＊残差
2.2.2 响应面交互作用分析根据回归方程，将其中任一因素固定在0水平。

可以得到体现另外两因素及其交互作用的响应曲面图［13］(见图5～7)。

由图5～7可知，沿时间轴向等高线变化最密集，且时间曲线最陡峭，说明超声时间对响应值的影响最显著［14］，这与表3中根据各因素的F值大小得出的结论符合;分析等高线，
结合表3中各因素的P值可知，超声时间和料液比的交互作用显著。

图5为超声时间为40 min时，温度和料液比及其交互作用对白藜芦醇提取率影响的曲面图。

由图5可知，当料液比一定时，随着温度的升高，白藜芦醇的提取率
呈先增高后降低的趋势;当温度一定时，白藜芦醇的提取率随着溶剂体积的增大而
先增大后平缓。

图5 超声温度和料液比对白藜芦醇提取率影响的响应面Figure 5 Responsive surface and contours of the effect of temperature and solid/solvent ratio
on the extraction rate of resveratrol
图6为超声温度为55℃时，超声时间和料液比及其交互作用对白藜芦醇提取率影
响的曲面图。

由图6可知，当料液比一定时，随着超声时间的延长，白藜芦醇的
提取率增大;当超声时间一定时，随着溶剂体积的增大，白藜芦醇提取率先增大再
减少，且增大的幅度并不大。

图7为料液比为1∶15(m∶V)时，超声时间和温度及其交互作用对白藜芦醇提取
率影响的曲面图。

由图7可知，当超声时间一定时，随着温度的升高，白藜芦醇
的提取先增大后略有减少;当超声温度一定时，白藜芦醇的提取率随超声时间的增
加而增加。

2.2.3 白藜芦醇最优工艺条件的确定与验证在各因素选定范围内，利用软件Design-Expert 8.0.5.0对模型进行分析优化，预测出最优提取条件为超声温度61.37℃，超声时间48.67 min，料液比1∶17.11(m∶V)，且在该条件下白藜芦
醇提取率的预测值为191.63 μg/g。

考虑到实际操作的方便，将提取工艺参数调整为:超声温度61℃，超声时间49 min，料液比1∶17(m∶V)，并在该条件下进行3次平行验证实验，白藜芦醇(以反式白藜芦醇苷的形式存在)的平均提取率为191.53 μg/g，与理论预测值191.63 μg/g 接近，表明响应面优化试验得到的提取工艺参数可靠。

图6 超声时间和料液比对白藜芦醇提取率影响的响应面Figure 6 Responsive surface and contours of the effect of time and solid/solvent ratio on the extraction rate of resveratrol
图7 超声时间和温度对白藜芦醇提取率影响的响应面Figure 7 Responsive surface and contours of the effect of time and temperature on the extraction rate of resveratrol
3 结论
本研究在单因素试验基础上，利用响应面法对刺葡萄酒渣中白藜芦醇的超声辅助提取工艺进行优化，并建立了白藜芦醇提取率与超声温度、超声时间、料液比3个因素的二次多项式回归模型，通过验证实验证明该模型是科学可靠的。

本研究经优化得出超声辅助提取刺葡萄酒渣中白藜芦醇的最优工艺为:超声温度61℃，超声时间49 min，料液比1∶17(m∶V)，此条件下白藜芦醇(以反式白藜芦醇苷的形式存在)的提取率为191.53 μg/g，与预测值相近，且高于任何一次单因素试验，证明优化得到的提取工艺准确可靠。

参考文献
1 黄卫文，黄寿恩，黎继烈，等.白藜芦醇的提取、检测技术及其生物活性研究进展［J］.食品与机械，2010，26(6):148 ～152.
2 Ndiaye M，Philippe C，Mukhtar H，et al.The grape antioxidant resveratrol for skin disorders:promise，prospects，and challenges
［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2011，508(2):164 ～170.
3 Trincheri N F，Nicotra G，Follo C，et al.Resveratrol induces cell death in colorectal cancer cells by a novel pathway involving lysosomal cathepsin D ［J］.Carcinogenesis，2007，28(5):922 ～931.
4 Cantó C，Auwerx J.Caloric restriction，SIRT1 and longevity［J］.Trends in Endocrinology＆ Metabolism，2009，20(7):32
5 ～331.
5 Ekshyyan V P，Hebert V Y，Khandelwal A，et al.Resveratrol inhibits rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation via estrogen receptor dependent nitric oxide production［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2007，50(1):83～93.
6 李洁，熊兴耀，曾建国，等.白藜芦醇的研究进展［J］.中国现代中药，2013，15(2):100 ～108.
7 邓洁红，谭兴和，王峰，等.刺葡萄皮花色苷的光热降解特性研究［J］.食品与机械，2010，26(5):56 ～61.
8 鲍瑞峰，秦丹，唐明，等.刺葡萄酒香气成分的研究［J］.酿酒科技，
2010(2):53～56.
9 孔涛，范杰平，胡小芳，等.响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸［J］.食品科学，2011，32(6):80 ～84.
10 许云章，任烨，王静霞，等.响应面法优化加拿大原产地西洋参皂苷的提取工艺研究［J］.现代食品科技，2013，29(5):1 040～1 044.
11 唐华丽，熊汉国，王玮.响应面法优化葡萄籽多酚提取工艺［J］.食品与机械，2012，28(6):147 ～149.
12 董周永，任辉，周亚军.松籽壳总黄酮超声提取工艺响应面优化［J］.食品与机械，2011，27(5):100 ～102.
13 彭芳刚，李绮丽，吴卫国.响应面法优化红莲外皮原花青素的提取工艺研究［J］.现代食品科技，2013，29(6):1 349 ～1 354.
14 纪学芳，徐怀德，张淑娟，等.响应面试验优化超声波提取光皮木瓜黄酮和多糖复合物［J］.食品科学，2013，34(6):47 ～51.。