自然发酵生姜猕猴桃酒醅中酵母菌区系分析

自然发酵生姜猕猴桃酒醅中酵母菌区系分析
潘肇仪;周礼红;高燕燕;廖瀚峰
【摘要】采用传统培养方法、模拟环境培养方法以及寡培养的方法分析了自然发
酵期间生姜猕猴桃酒醅中酵母茵区系.根据茵落形态、大小和颜色从样品中共分离
得到265株酵母菌株.根据5.8S rDNA-ITS区序列分析比对结果显示,所分离得到
的265株酵母分属于7属11种,分别是桔假丝酵母(Candida quercitrusa citrusa)、福山假丝酵母(Candida fukuyamaensis)、葡萄酒有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii、克鲁维毕赤酵母(Pichia kluyveri)、异常毕赤酵母(Pichia anomala、东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、奥莫柯达酵母(Kodamaea ohmeri)、美极梅奇酵母(Metschnikowiap ulcherrima)、卡里比克毕赤酵母(Pichia caribbica)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranifaciens).毕赤酵母(Pichia)为生姜猕猴桃自然发酵的优势茵群.
【期刊名称】《酿酒科技》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】4页(P45-48)
【关键词】果酒;自然发酵;生姜猕猴桃酒;酵母;种群分析
【作者】潘肇仪;周礼红;高燕燕;廖瀚峰
【作者单位】贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵
州贵阳550025;青藏高原微生物国家地方联合工程研究中心,西藏拉萨850000;贵
州大学生命科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学生命科学学院,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】TS262.7;TS261.4;TS261.1;Q93-3
采用传统发酵方式生产的生姜猕猴桃酒是以生姜、猕猴桃为水果原料（氮源），添加大量白砂糖（碳源），仅利用原料自身附着的微生物在常温环境下发酵而制成。

生姜猕猴桃打浆后通过发酵，过滤，澄清取得酒液，形成果酒；果浆中的糖分在酵母的作用下转变成为二氧化碳和酒精。

发酵属于多菌种混合发酵，发酵方式采用静置发酵。

在生姜猕猴桃酒自然发酵期间，酒醅中含有极具多样性的微生物,包括细菌、酵母等。

酵母是酒类酿造过程中的重要功能微生物，影响果酒的产量和质量[1-3]。

认识自然发酵过程中生姜猕猴桃酒醅酵母菌群的变化规律是科学认识生姜猕猴桃酒酿造过程与机制的必要途径。

Maro等[4]指出在葡萄酒自然发酵过程中有孢汉逊酵母、伊萨酵母和假丝酵母在发酵初期占主导地位；而随着发酵的进行逐渐被酿酒酵母所代替。

此外，王泽举[5]和刘树文[6]都指出自然发酵过程中酒精耐性较高的酿酒酵母逐渐占据优势，并最终完成发酵。

本研究利用寡培养等方法分析自然发酵生姜猕猴桃酒醅中酵母菌菌群分布状况，使人们对自然发酵的生姜猕猴桃酒酵母区系有科学性的认识，为生姜猕猴桃酒的人工发酵生产奠定理论基础。

1 材料与方法
1.1 材料、试剂及仪器
原料：自然发酵生姜猕猴桃酒醅，由贵州大学生命科学学院真菌资源研究所提供。

试剂：引物（ITS 1/ITS 4），上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

酵母DNA提取试剂盒、（2×）Taq PCR Master Mix、4S green核酸染色剂、DNA Marker-D，购自上海生工生物工程技术有限公司。

主要设备与仪器
S1000 PCR扩增仪，美国BIO-RAD公司。

Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国
BIO-RAD公司。

ABI 3730XL全自动DNA测序仪，美国ABI公司。

采用的分离培养基共20种。

MYPG培养基、嗜渗压培养基、YEPD培养基（YEPD I）、YPD培养基、WL营养琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基、PDA培养基、孟加拉红培养基、YM培养基，以及水琼脂培养基（水琼脂I）配制方法参照
参考文献[7-9]。

除此以外，设计将YEPD培养基的三种营养成分（葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏）依次递减20%，为酵母菌种分离提供寡营养的生长环境；设计调
整YEPD培养基的pH值从7至3依次递减，来模拟酵母生长的原始酸性环境条件；设计嗜渗压培养基来模拟生姜猕猴桃酒高渗透压环境，以配合不同种类酵母菌对环境、营养条件不同程度的需要。

配制方法如下：YEPD培养基II（YEPD II）：葡萄糖16.0 g，蛋白胨16.0 g，酵母浸膏8.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH6，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基III（YEPD III）：葡萄糖12.0 g，蛋白胨12.0 g，酵母浸膏6.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH6，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基IV（YEPD IV）：葡萄糖8.0 g，蛋白胨8.0 g，酵母浸膏4.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH6，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基V（YEPD V）：葡萄糖4.0 g，蛋白胨4.0 g，酵母浸膏2.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH6，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基VI（YEPD VI）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母浸膏10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH3，定容至
1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基VII（YEPD VII）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母浸膏10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH4，定容至1L。

分装后121℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基 VIII（YEPD VIII）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母浸膏10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶
于适量水中，调节pH至5，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培养基中。

YEPD培养基IX（YEPD IX）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨20.0 g，酵母浸膏10.0 g，琼脂20.0 g，加热溶于适量水中，调节pH7，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

临用前用少量乙醇溶解氯霉素，加入培
养基中。

水琼脂培养基II（水琼脂II）：琼脂粉20.0 g，加热溶于适量蒸馏水中，调节pH6，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

水琼脂培养基III（水琼脂II）：琼脂粉20.0 g，加热溶于适量蒸馏水中，调节pH5，定容至1 L。

分装后121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法
1.2.1 酵母菌的分离
取自然发酵生姜猕猴桃酒的初、中、后3个时期（即发酵第10、45、90 d）酒醅样品10 g，放入盛有90 mL无菌水的三角瓶中，振荡5 min，充分摇匀，制成
10-1菌悬液。

将制得的菌悬液梯度稀释[10]。

分别吸取浓度梯度为10-3、10-4、10-5的菌液100 μL至倒好的平板上，用涂布棒涂布均匀。

每种培养基每个菌液
浓度梯度做3个平板。

将涂布后的平板倒置于28 ℃恒温培养箱中培养2 d，待培养基表面长出单个菌落，其中根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，挑选表型特征不同的单菌落，编号保存备用。

1.2.2 酵母菌5.8S rDNA-ITS区序列分析
DNA模版制备：菌株DNA提取按照试剂盒标准抽提步骤进行。

ITS-5.8S rDNA PCR扩增：以ITS 1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-
3’）、ITS 4（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）为引物，以酵母菌总DNA为模板进行PCR扩增。

在PCR反应管中加入DNA模版1 μL，2×Mix取13 μL，10 μM ITS1取1 μL，10 μM ITS2取1 μL，ddH2O取9 μL，混匀后进行PCR反应。

PCR扩增反应条
件为：94 ℃预变性4 min后，94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，2～4步循环30次，再72 ℃延长10 min。

测序方法：DNA测序采用双脱氧终止法。

序列分析：将待测菌株的DNA测序结果提交到GenBank数据库利用Blastn工具进行序列比对。

2 结果与分析
2.1 自然发酵生姜猕猴桃酒醅中的酵母菌种属
采用传统分离方法、寡培养方法以及模拟环境条件的分离方法从样品中共分离到265株酵母菌株。

经Blast、多序列比对以及系统发育分析发现，这265株菌株属于7属11种，分别是桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、福山假丝酵母（Candida fukuyamaensis）、葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、美极梅奇
酵母（Metschnikowia pulcherrima）、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）。

反映出在自然发酵的生姜猕猴桃酒
中酵母菌的资源非常丰富。

2.2 不同时期生姜猕猴桃酒醅中酵母菌群组成的变化
在生姜猕猴桃酒自然发酵初期，酒醅中存在的酵母包括：桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、汉逊德巴利
酵母（Debaryomyces hansenii）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）、奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）。

其中，卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）与奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）以及异常毕赤酵母（Pichia anomala）共同成为自然发酵初期生姜猕猴桃酒的优势菌群，具体见图1。

图1 生姜猕猴桃酒自然发酵初期酵母群落
在生姜猕猴桃酒自然发酵中期，酒醅中存在的酵母包括：桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、福山假丝酵母（Candida fukuyamaensis）。

其中，膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）与异常毕赤酵母（Pichia anomala）是自然发酵中期生姜猕猴桃酒的优势菌群，具体见图2。

图2 生姜猕猴桃酒自然发酵初期酵母群落
在生姜猕猴桃酒自然发酵后期，酒醅中存在的酵母包括：桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）。

其中，克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）是自然发酵后期生姜猕猴桃酒的优势菌群，具体见图3。

图3 生姜猕猴桃酒自然发酵初期酵母群落
在生姜猕猴桃酒自然发酵期间，桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）以及奥莫柯达酵
母（Kodamaea ohmeri）在酒醅酵母菌中均占较大比例。

其中，异常毕赤酵母（Pichia anomala）是三个发酵时期共有的酵母种类，而且在数量上与比例上占
据优势地位，是自然发酵生姜猕猴桃酒的发酵主导菌群。

随着发酵时间的推移，桔假丝酵母（Candida quercitrusa）占同时期酵母总数的比例在不断增加，及至自然发酵后期，桔假丝酵母（Candida quercitrusa）与异常毕赤酵母（Pichia anomala）占同时期酵母总数的比例持平。

克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）占同时期酵母总数的比例则是在不断降低，具体见图4。

从属的层次来看，在生姜猕猴桃酒自然发酵的不同时期，发酵优势菌群的变化有一定的规律可循：分离得到的毕赤属(Pichia)酵母总量较高，占同时期分离酵母总数
的比例较大，是自然发酵生姜猕猴桃酒的发酵主导菌群；假丝酵母属（Candida）、柯达酵母属（Kodamaea）也是酒醅中占较大比例的酵母属菌群，其中假丝酵母
属（Candida）所占比例随着发酵时间的推移而增长。

图4 自然发酵期间生姜猕猴桃酒醅中酵母菌群分布情况
结果显示，在生姜猕猴桃酒长达2个月自然发酵期间，毕赤属(Pichia)酵母始终是发酵的优势菌群，而酿酒酵母没有分离到，这与前人的研究结果不一致。

造成这个结果的原因可能是：(1)为了利用高糖浓度造成的高渗透压环境来抑制有害微生物
活性，样品含糖量达到40%（w/w），高渗透压环境抑制了某些酵母的发酵；(2)样品的制作时间在 9月，发酵时期为9月-次年2月，发酵温度由高（30 ℃）到
低（4 ℃）变化可能对酒内酵母菌菌群生长产生影响，导致样品自然发酵过程中微生物的变化规律与其他酒类自然发酵微生物的变化规律产生较大差异；(3)自然发
酵属于多菌种混菌发酵,非酿酒酵母会竞争利用有限的营养物质,也会分泌代谢产物
抑制或诱导其他真菌的死亡[11,12]，对酿酒酵母的发酵性能可能存在抑制作用
[13]；（4）酿酒酵母数量太少，在平板随机选育的过程中未被选出。

3 结论
通过传统涂布平板法对生姜猕猴桃酒残渣中的酵母菌进行分离，培养基分别采用了传统的分离培养基、寡营养培养基以及模拟高渗透压条件的分离培养基，分析自然发酵的生姜猕猴桃酒残渣样品中酵母菌区系，发现在生姜猕猴桃酒自然发酵期间，酒渣中存在的酵母菌属于 7属 11种，分别是桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、福山假丝酵母（Candida fukuyamaensis）、葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、东方
伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、奥莫柯达酵母（Kodamaea ohmeri）、
美极梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、卡里比克毕赤酵母（Pichia caribbica）、膜醭毕赤酵母（Pichia membranifaciens）。

异常毕赤酵母（Pichia anomala）是三个发酵时期共有的酵母种类，在数量上与比例上占据优
势地位。

从属的层次来看，毕赤属(Pichia)酵母是自然发酵生姜猕猴桃酒的发酵主
导菌群。

在分离到的各类酵母中，葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、汉
逊德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、桔假丝酵母（Candida quercitrusa）、福山假丝酵母（Candida fukuyamaensis）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）可作为酿酒用酵母，为筛
选适合的生姜猕猴桃酒纯种发酵酵母提供了基础。

这些酵母的生理学特性及其代谢功能研究仍在进行之中。

倘若能将酵母菌生理功能与发酵过程联系起来，就有可能对生姜猕猴桃酒生产技术进行改造，提高生姜猕猴桃酒工业化生产的产量与质量。

本研究对科学认识生姜猕猴桃酒酿造过程和机制，以及丰富我国传统酿造食品微生物学的研究，具有重要的理论和实践价值。

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