十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究

十足目甲壳动物顶体构架体及精子发生相关蛋白功能研究
甲壳经济动物的繁殖是我国水产界研究的热门话题。

而精子发生机制是繁殖生物学领域关注的重大科学问题之一。

精子发生机制的研究是人工进行水产经济物种繁殖的基础。

精子发生过程中的细胞骨架的重构、分子调控机制是目前该领域的研究热点。

与哺乳动物精子发生存在巨大差异的地方是,甲壳动物精子没有鞭毛结构。

其精子发生过程主要包含顶体形成和细胞核形变事件。

我们对甲壳纲十足目动物精子发生过程中细胞骨架结构、动力学机制以及生理学方面进行了研究。

第一部分十足目游泳亚目真虾属秀丽白虾精子发生细胞骨架及其动力学机制研究顶体架构体(AFS)是真虾类精子形成中出现的细胞骨架结构,首次发现是在日本沼虾精子发生过程中,但其组成以及功能目前尚未有报道。

我们以太湖主要的经济虾类秀丽白虾作为研究模型,研究AFS是否是真虾类精子形成中普遍存在的骨架结构。

通过免疫荧光实验对Tubulin在精子形成不同时期的定位实验,证明秀丽白虾精细胞中也存在AFS结构,其主要组分为微管,根据其形态预测还有少量微丝
以维持细胞柔韧性。

这一结果说明AFS是真虾类精子发生共同存在的细胞骨架结构。

为研究与该细胞骨架结构共同发挥功能的马达蛋白,我们克隆了驱动蛋白
kifc1基因,并对其结构、基因及蛋白的分布、运载的货物进行了研究。

通过免疫荧光实验对细胞器高尔基体标记物GM130以及线粒体标记物与KIFC1的共定位,我们发现驱动蛋白KIFC1与上述细胞物质在顶体形成部位以及
细胞核一侧边缘具有高度共定位,暗示这些细胞成分是KIFC1运输的货物。

综上所述,驱动蛋白KIFC1依赖AFS细胞骨架结构运输细胞器以形成真虾类精子发生
中出现的临时细胞器片层复合体(LCx),最终帮助成熟精子中外翻的伞状顶体的
形成和盘状细胞核的变形。

第二部分十足目爬行亚目中华绒螯蟹精子发生过程中p53参与的生精细胞凋亡研究为了研究十足目甲壳动物正常生精过程中的的保
护机制,我们从中华绒螯蟹精巢组织中克隆了p53同源基因。

对其序列分析结果显示,该p53同源基因具有保守的DNA结合区域和锌结合位点。

p53基因在不同组织中的半定量分析结果暗示p53基因的普遍存在性以及其对生命活动的必要性。

通过原位杂交实验检测了p53基因在精子形成各时期的表达特征。

其基因分布暗示p53可能会对损伤的DNA进行修复以保证正常的精子发生,或引发凋亡以去除不正常的精细胞。

但p53是如何发挥这些功能的,在未来的工作中我们还需要深入研究。

第三部分十足目爬行亚目中华绒螯蟹精子发生过程中PHB介导的线粒体泛素化研究中华绒螯蟹的精子含有杯状核,核杯开口处有数个
线粒体深陷核内,顶体囊片层结构中镶嵌有线粒体衍生物。

该线粒体分布模式的形成过程包含线粒体数量消减、结构变化及其运输过程。

精细胞中线粒体数量的消减可通过自噬和泛素化等降解途径实现。

为研究甲壳动物精子发生过程线粒体的泛素化降解机制,我们关注一种线粒体内膜蛋白Prohibitin(PHB)。

该蛋白在进化上高度保守,它与哺乳动物的精子发生过程以及精子质量控制高度相关。

在哺乳动物中它被发现作为泛素的底物,可能通过参与线粒体的泛素-蛋白酶体途径(UPP)来发挥作用。

为研究PHB蛋白是否介导精子线粒体的泛素化途径,我们通过原核表达、重组蛋白纯化、家兔免疫以及抗体纯化等技术制备了物种特异性抗体。

免疫印迹结果显示PHB蛋白在所检测组织中均有较高表达。

通过免疫荧光实验检测了PHB蛋白在精子形成各时期的分布情况,结果显示在精子形成早中期顶体形成和精核变形过程中,PHB的表达量较高,说明PHB可能是通过维持线粒体的功能发挥作用,为精子形成过程中的顶体形成和细胞核形变提供充足的能量。

PHB 和多聚泛素FK2以及线粒体与FK2的共定位实验显示：精子形成早中期,PHB、多聚泛素FK2以及线粒体均分布在细胞的一侧,FK2信号比较弱,说明此时PHB和线粒体的泛素化水平比较低；在中后期,PHB、线粒体标记物以及FK2信号主要共定位于顶体帽以及细胞核一侧,FK2信号逐渐增强,表明多聚泛素化水平在中后期升高；成熟期精子中,PHB、线粒体标记物以及FK2共定位于顶体帽处。

实验结果暗示在精子形成过程中PHB作为泛素化底物参与线粒体泛素化降解过程,或者多聚泛素链通过PHB为底物特异标记了线粒体。

为进一步证明以上结论,使用shRNA干扰技术降低PHB表达和过表达技术增加PHB的表达。

干扰组实验结果表明PHB表达量的降低,直接影响多聚泛素水平和线粒体状态。

过表达实验结果表明PHB的大量表达使得多聚泛素化水平大幅提升。

体外实验同样证明PHB作为多聚泛素的底物介导了线粒体的泛素化过程。