培养基适用性检查标准操作规程

培养基适用性检查标准操作规程
目的：明确微生物限度检查用培养基质量检查操作规程。

范围：需进行微生物限度检测的培养基
职责：QC检验员对本标准的实施负责。

1.概述
培养基质量是影响微生物检验结果的重要环节。

计数测定用培养基的促生长能力是微生物限度检查结果判断的重要影响因素，控制菌检查用培养基也可能由于其促生长能力、指示能力、抑制能力的差异，从而对菌落颜色、形态等指标存在较大差异，影响结果判断的客观性。

培养基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价拍段检验用培养基是否符合检验要求。

微生物限度检查用培养基主要分为细菌、霉菌及酵母菌计数测定用培养基和控制菌检查用培养基两部分。

2015版《中国药典》微生物限度检查法中收载了“适用性检查”对培养基质量进行控制。

2、培养基适用性检查实验的一般要求
2.1培养基适用性检查适用范围
2020版《中国药典》规定微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

培养基使用性检查试验可用于确定实验室所用培养基(包括购置的不同批号的成品培养基、不同批号的脱水培养基干粉、按处方自行配制培养基不同批次的原材料等)、制备程序（包括水质控制、配制方法、灭菌程序等）、保存条件（温度、湿度、时间及盛装培养基的容器条件等）等是否满足微生物限度检查用要求。

即上述影响培养基质量的各关键控制点应通过培养基使用性检查试验确定，如果任一控制点发生变化应重新进行培养基适用性检查。

但是影响培养基质量的关键控制点的变化应掌握在微生物实验室质量控制的一般原则内（见2.2），超过一般原则的培养及是否还能满足微生物限度检查用，无法通过培养基适用性检查确定。

当检查结果出现异常，或实验室质量控制需要，也可通过培养基适用性检查提供一定依据。

总之，培养基适用性检查是在正常条件下关于培养基质量的实验室控制措施，并不一定在每次具体的微生物限度检查样品检测试验活动中都必须同时进行培养基使用性检查试验，但每次微生物检查所用培养基均应经过适用性检查。

2.2微生物限度检查用培养基质量控制的一般原则
2.2.1不同处方培养基的替代使用不能通过培养基使用性检查试验简单确定。

2.2.2.培养基适用性检查不能取代供应商或其他法定标准对培养基的有效期、保存条件、制备方法等的更严格等的规定。

2.2.
3.如果没有特殊规定，培养基配制采用蒸馏水或纯化水均可，但应采用一定措施加以检测控制，如蒸馏水应核实PH是否为5~7；采用离子交换法制备的纯化水，电阻值应不小于2MΩ等。

2.2.4尽量临用现配。

培养基灭菌后在能取出的前提下，尽快取出，切忌在高压锅内过夜存留；固体培养基灭菌或融化后，融化状态放置不得超过8h；一般预制培养基可置洁净环境2~25℃保存，但不应超过20天；固体琼脂培养基熔化再使用应不超过一次。

2.2.5干粉培养基或培养基原料变质不应再用；预制培养基储存过程中发现浑浊、变色、长菌、严重脱水等变化不应再用。

2.3对照培养基
对照培养基应通过严格的质量研究和控制，具备性能稳定、质量优异的特点。

对照培养基作为一种标准试剂，应具备可靠的来源和保障。

2.4培养基适用性检查指标及常用方法
2.4.1检测指标：促生长能力、指示能力、抑制能力。

2.4.2常用方法：直接接种法、浇碟法、表面接种法（涂布法）。

2.4.3液体培养基通常采用直接接种法测定上述3种指标，接种时应注意接种量不得超过培养基体积的10%。

固体培养基采用浇碟法和表面接种法测定上述指标。

采用浇碟法考察固体培养基时，为了保证取样的平行性，平行测定两皿求平均数；采用表面接种法考察固体培养基时，表面接种菌液不多于0.2ml/皿，尽量控制在0.1 ml/皿，保证取样的平行性，平行测定两皿观察结果。

3.计数培养基的适用性检查
微生物限度检查中计数用培养基3种，营养琼脂、玫瑰红钠营养琼脂和酵母浸出粉葡萄糖
琼脂。

3.1计数培养基适用性检查试验菌株。

铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］
金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］
枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］
白色念珠菌［CMCC(F)98001］
黑曲霉菌［CMCC(F)98003］
菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。

3.2实验操作
3.2.1培养基制备按规定程序新鲜配置胰酪大豆胨琼脂培养基（被检培养基和对照培养基）、沙氏葡萄糖培养基（被检培养基和对照培养基），灭菌后备用。

3.2.2营养琼培养基取7个无菌平皿，分别接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照营养琼培养基，混匀，凝固后于30~35℃倒置培养48h,计数；被检培养基同法操作。

3.2.3沙氏葡萄糖培养基取5个无菌平皿，分别接种白色念球菌、黑曲霉菌各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌50~100cfu），另一平皿不接种菌作为空白对照，倾注对照沙氏葡萄糖培养基，混匀，凝固后倒置培养72h,计数；被检培养基同法操作。

3.3结果判断
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态、大小应与对照培养基上的菌落一致，则判断该培养基的适用性检查符合规定。

4.控制菌检查用培养基适用性检查
控制菌检查用成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配置的培养基均应检查。

检查项目包括培养基的促生长能力、指示和抑制特性能力。

4.1计数培养基适用性检查试验菌株。

大肠埃希菌［CMCC(B)44102］
金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］
铜绿假单胞菌［CMCC(B)10104］
乙型副伤寒沙门菌［CMCC(B)50094］
白色念珠菌［CMCC(F)98001］
生孢梭菌［CMCC(B)64941］
菌株培养基菌液制备同微生物限度检查方法验证。

4.2各种培养基需要测试的能力及判断指标
液体培养基促生长能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及不大于最短培养基时间下培养。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。

固体培养基促生长能力检查：用涂布法接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最短培养基时间下培养。

被检培养基于对照培养基上生长的菌落大小、形态特征一致。

培养基抑制能力检查：取不大于100cfu的试验菌株分别接种于液体被检培养基和对照培养基，取试验菌0.1ml液（不大于100cfu）分别涂布于固体被检培养基和对照培养基，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及最长培养基时间下培养。

试验菌应不得生长。

培养基指示能力检查：用涂布法分别接种不大于100cfu的试验菌（表1）于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养基温度（30~35℃）及不大于最短培养基时间下培养。

被检培养基上试验菌的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况应与对照培养基一致。

4.3 控制菌检查用培养基能力测试列表（表1）
表1 控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性
4.4各控制菌检查用培养基适用性检查实验操作
4.4.1供试液制备按“供试品检查”中的规定制备供试液。

4．4．2试验菌根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐草兰阴性菌检查方法时，采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。

4．4．3适用性试验按控制菌检查法取规定量供试液及不大于lOOcfu的试验菌接入规定的培养基中；采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，在最后一次冲洗液中加入试验菌，过滤后，注入规定的培养基或取出滤膜接人规定的培养基中。

依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，应能检出所加试验菌相应的反应特征口4．4．4 结果判断上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性[见非无菌产品微生物检查：微生物计数法（通则1 1 0 5）中的“抗菌活性的去除或灭活”]，并重新进行方法适用性试验。

如果经过试验确证供试品对试验菌的抗菌作用无法消除，可认为受抑制的微生物不易存在于该供试品中，选择抑菌成分消除相对彻底的方法进行供试品的检查。