核酸含量的测定——紫外吸收法

核酸含量的测定一一紫外吸收法
［原理］
核昔、核昔酸、核酸的组成成分中都有瞟吟.嚅嗖疏基，这些戚基都具有共觇双键 (-C-C=C-C=C-),在紫外光区的250-280nm 处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm 左右。

常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。

核酸的•摩尔消光系数e (P)表示为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。

RNA 的e (P)260nm ()为7 700〜7 800, R7A 的含鱗量约孰 因此每亳升溶液含1 P g RNA 的光吸收值 相当于〜。

小牛胸腺D7A 钠盐的£ (P) 260nm ()为6 600,含磷量为％因此每亳升溶液含 lug DNA 钠盐的光吸收值相当于。

测出260nm 处的光吸收值，可计算出核酸的含量。

当核酸变性降解时，其紫外吸收强度 显著增加，称为增色效应。

蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处，在260nm 处的吸收值仅 为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。

若待测的核 酸制品中混有大疑的具有紫外吸收的杂质，则测定误差较大，应设法除去。

不纯的样品不能 用紫外吸收值作定量测定。

从也/ A 珈的比值可判断样品的纯度。

纯RNA 的 W 仏鼻；DNA 的 W A 网工。

当样 品中蛋白质含量较高时，则比值下降。

RNA 和DNA 的比值分别低于和时，表示此样品不纯。

pH 对核酸紫外吸收性有影响，所以在测定时要固定溶液的pH 值。

本实验采用常用的比消光系数法来测定核酸含量。

［方法和步骤］
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1、测定 取洁净离心管甲乙两支，分别准确加入DNA/RNA 样液，然后向甲管加入蒸馆水，向乙 管加入过氯酸-钥酸枝沉淀剂，摇匀后置冰箱内30min,使沉淀完全。

3000r/min 离心lOmin, 各吸取上清液转入相应的甲乙两容量瓶内，定容至50mLo 以蒸徭水作空白对照，使用紫外 光度计分别测定上述甲乙两稀释人缈值。

2、计算
试液中DNA / RNA 总含量按下式计算：
式中甲——被测稀释液在260nm 处的总光密度值；
乙A 卿——加沉淀剂除去大分子核酸后被测稀释液在260nm 处的光密度值;
两者之差(甲A 2eo-乙人卿)为被测稀释液的光密度值；
V n 一一被测试液总体积(inL)
D ——样液的稀释倍数。

一一脱氧核糖核酸的比消光系数，即每亳升含lugDM 钠盐的水溶液(pH 为中性)在 260nm 波长处，通过光径为lcm 时的光密度值。

—一核糖核酸的比消光系数，是浓度为lmg/L 的核糖核酸水溶液(pH 为中性)在260nm 波长处，通过光径为lcm 时的光密度值。

由于大分子核酸易发生变性，此值也随变性程度不同而异，因此一般采用比消光系数计 算得到DNA 或RNA 量是一个近似值。

DNA(pg)= 中人660 - 0.020 x V,, x D RNAQig)=
屮人60 _乙人60 0.022 x V & x D。