柴达木绒山羊羔羊大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

柴达木绒山羊羔羊大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验
宋春梅;宋红秀;简莹娜;李秀萍;王光华;马利青
【摘要】从送检的1份因腹泻致死的病料中分离培养得到1株菌,经生化和分子生物学鉴定和动物致死试验,鉴定该分离菌株为致病性大肠杆菌.体外药敏实验证实了分离株该菌对杆菌肽、多粘菌素E、呋喃妥因等药物敏感;对氯霉素、强力霉素等药物中敏;对青霉素、红霉素、卡那霉素等药物耐药.
【期刊名称】《青海畜牧兽医杂志》
【年(卷),期】2018(048)005
【总页数】5页(P35-38,34)
【关键词】羔羊;腹泻;大肠杆菌;药敏试验
【作者】宋春梅;宋红秀;简莹娜;李秀萍;王光华;马利青
【作者单位】海西州农牧业信息服务站,德令哈,817099;青海省海西州德令哈市畜牧兽医工作站,德令哈,817099;青海大学畜牧兽医科学院,西宁,8100161;青海大学畜牧兽医科学院,西宁,8100161;青海大学畜牧兽医科学院,西宁,8100161;青海大学畜牧兽医科学院,西宁,8100161
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61+2
大肠杆菌又名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，属革兰氏阴性短杆菌。

有鞭毛及动力，为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。

大肠杆菌为兼性厌氧菌，生长温度范围是8～
46℃，最适生长温度为37℃。

其菌体抗原为“O”型抗原，鞭毛抗原为“H”型
抗原，表面抗原为“K”型抗原，根据其抗原结构的差异被分为180多种血清型别[1]。

致病性大肠杆菌在动物间广泛流行，引起动物的多种疾病，是动物感染性疾
病的主要病原菌[2]。

近年来由于在养殖过程中抗生素等药物的不规范使用，使得
其耐药菌株逐渐增多[3，4]，为家畜防治该菌引起的疾病带来了一定的困难。

2018年3月份，海西州德令哈市怀头他拉镇的某牧户家的柴达木绒山羊新生羔羊发生以水样腹泻，部分带血，部分腥臭为症状的病例，治疗不及时会引起死亡，将濒死期的羔羊及时送检至实验室进行病原诊断，现将诊断结果报告如下，仅供参考。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料
来自青海省海西州德令哈市怀头他拉镇某牧户饲养的柴达木绒山羊新生羔羊群，因腹泻，治疗不及时，濒临死亡的1只羔羊。

1.1.2 主要试剂
营养肉汤培养基购自于北京索莱宝科技有限公司；鲜血营养琼脂平板和厌气肉肝汤(均为本实验室自制)；麦康凯培养基和伊红美蓝培养基购自于青岛高科园海博生物技术有限公司；药敏片购自于Oxoid公司；DNA提取试剂盒购自于天根生化有限公司；肠杆菌科生化鉴定管购自于杭州天和微生物试剂有限公司；PCR所用试剂
及预混酶均购自北京全式金生物工程有限公司。

1.1.3 实验动物
昆明系小鼠6只，雌雄各半，购自青海省地方病研究所实验动物中心。

1.2 方法
1.2.1 菌株的分离培养
将送检的病料的心、肝、脾、肺、肾、肠淋、肠内容物分别接种至营养肉汤、鲜血
琼脂平板和厌气肉肝汤中，经37℃培养24h，观察菌落形态及培养特性。

挑选具
有溶血现象的单个菌落，分别接种到营养肉汤、麦康凯、伊红美蓝和三糖铁培养基上继续进行37℃，24h纯化培养，观察菌株在各个培养基上的生长情况，并将培
养物涂片、染色镜检。

1.2.2 生化鉴定
对分离菌株进行糖微量发酵管(棉子糖、葡萄糖、木糖)、山梨醇、硫化氢、氨基酸生化管(鸟氨酸、赖氨酸)、半固体琼脂、葡磷胨水、尿素、蛋白胨水、枸橼酸盐管和侧金盏花醇等实验。

37℃，培养24h，观察并记录结果。

1.2.3 小鼠致死实验
将纯化的1株具有溶血现象的菌株，接种至普通营养肉汤培养24h后，经腹腔，
注射给2只实验小鼠，剂量为0.2mL/只，另取2只做阴性对照，腹腔注射0.2mL 普通营养肉汤；统一饲养，观察记录实验小鼠的精神状态及存活情况。

对死亡小鼠进行剖解，无菌采取肝和脾等组织接种至鲜血营养琼脂平板，37℃恒温培养24h，对溶血菌落进行染色镜检。

1.2.4 药敏实验
研究采用K-B纸片扩散法对分离菌株进行药物敏感性试验[5]，药敏实验所用培养基、培养时间、接种方法及判定方法参照临床实验室标准化协会制定的
CLSIM100最新标准执行。

1.2.5 分离菌株PCR扩增
提取分离菌株基因组DNA，用细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增。

引物信息及PCR扩增优化体系详见表1和表2。

PCR扩增优化条件：95℃5min；95℃35s；60℃35s；72℃2min，循环35次，最后72℃总延伸10min。

扩增后的PCR产
物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，收集条带，送往苏州金唯智测序公司进行测序。

表1 引物及序列引物名称引物序列产物长度参考文献16SrRNA—F5’-
AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’16SrRNA—R5’-TCAGGTTACCTTGTTACGACT-3’1486bp辛九庆[6]
表2 PCR反应体系PCR体系组成加样量(μL)2×EasyTaq PCR Su perMix12.5上
游引物1下游引物1DD water8.5DNA模板2Total25
2 结果
2.1 细菌培养特性及镜检结果
接种物在普通营养肉汤中均匀浑浊，表面有菌环，初期打开试管塞似有气体产生；24h厌气肉肝汤浑浊，48h后逐渐清亮；接种脾脏和肠淋的鲜血琼脂平板经24h
培养，打开培养皿时有浓浓的吲哚味道，呈现α溶血，菌落为圆形凸起、灰白色
菌落。

将分离菌株纯化后接种至麦康凯培养基上经24h培养后，呈现玫瑰红菌落；伊红美蓝培养基上为带金属光泽的菌落；三糖铁培养基上底部琼脂均产生硫化氢。

经革兰氏染色镜检可发现呈紫红色、着色均匀、单个或成对的无荚膜、无芽孢、两端钝圆的短杆菌，均为革兰氏阴性短杆菌。

镜检结果详见图1。

图1 分离菌为革兰氏阴性短杆菌(100×)
2.2 分离株的生化特性
分离菌株的生化特性实验结果详见表3。

表3 分离菌株的生化特性生化项目分离菌株苯丙氨酸-硫化氢-葡萄糖酸盐-蛋白胨
水+葡磷胨水(MR.VP)+枸橼酸盐-半固体琼脂(动力)+葡萄糖(产气)⊕赖氨酸+鸟氨
酸+棉子糖+山梨醇+侧金盏花醇-木糖+尿素-
注：“⊕”表示产酸产气；“+”：表示产酸或阳性反应；“-”：表示阴性反应。

2.3 小鼠致死实验结果
注射小鼠均在24h内死亡。

对照组小鼠无死亡。

剖检死亡小鼠可见肝脏肿大，脾
脏淤血肿大，小肠充盈有水样粘液，肠壁变薄，从死亡小鼠的各主要脏器中分离培养细菌，其生长特性、形态特征与接种菌株一致。

2.4 药敏实验结果
本实验对分离菌株用K-B扩散法进行药敏实验。

结果显示：该菌对杆菌肽、多粘菌素E、呋喃妥因等药物敏感；对氯霉素、强力霉素等药物中敏；对青霉素、红霉素、卡那霉素等药物耐药。

空白对照成立，详见表4。

表4 分离菌株的药敏试验结果药物抑菌圈平均直径(￠mm)活性单位/每片含药量/μg耐药(R)中敏(I)敏感(S)药物敏感度杆菌肽(B)1810-->13敏感氯霉素
(C)2730≦2526-28≧29中敏多黏菌素E(CT)2510≦1111-22≧22敏感强力霉素(DO)1630≦1111-22≧22中敏红霉素(E)015≦1314-22≧23耐药卡那霉素
(K)1310≦1415-17≧18耐药呋喃妥因(F)2730≦1415-16≧17敏感青霉素
(P)010≦28-≧29耐药磺胺甲恶唑/甲氧苄啶(SXT)2025≦1011-15≧16敏感四环素(TE)2130≦2526-28≧29耐药克林霉素(DA)02≦1415-16≧17耐药利福平(RD)155≦1617-19≧20耐药头孢吡亏(FEP)4030--≧26敏感环丙沙星(CIP)305--≧21敏感诺氟沙星(NOR)2610≦1213-16≧17敏感氧氟沙星(OFX)275--≧16敏感阿奇霉素(AZM)015≦1111-22≧22耐药
2.5 PCR扩增结果
用分离菌株基因组DNA为模板，以细菌16SrRNA通用引物进行PCR扩增，结果显示，该菌株在1500bp左右处有清晰条带，与预期条带大小相符。

通过测序获得序列信息，使用PubMed数据库，对所测得的序列片段进行“BLAST”在线软件比对分析，该株分离菌序列同源性分别与大肠杆菌(AP018802)的序列同源性达到96%以上。

判定该分离菌株均为大肠杆菌，详见图2。

图2 菌株16S r RNA PCR电泳图
3 小结与讨论
大肠杆菌的血清学十分复杂，致使其无法通过疫苗来进行有效地防治。

而近年来抗生素的大量使用使大肠杆菌耐药现象在我国每个省都很严重，其耐药范围、耐药种
类、多重耐药性都呈上升趋势[7]。

大肠杆菌的耐药机理十分复杂，主要有产生质粒型广谱和超广谱的β内酰胺酶水解β内酰胺类抗生素，产生耐药和多重耐药[8]。

另有报道称：耐药基因可以通过质粒垂直传给下一代，并且水平传给人和其他动物[4，8，9]。

为了防止动物感染病原菌，饲料中添加的大量抗生素最终使食用这些动物的人类产生耐药性[10]，希望相关部门能够采取积极有效的措施，开展致病菌株的耐药性检测。

针对此，应加强对病原菌的监控以及抗生素类用药的管理，并根据本地区菌株的耐药谱合理使用抗生素[11]，将研发新型的中成药物替代抗生素是今后工作的关键。

参考文献:
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