抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则

抗药抗体免疫原性分析方法学验证指导原则
摘要:
几乎所有得生物制药产品都会引起一定得抗药抗体(aｎｔｉ－ｄrug aｎｔibｏdy,ADＡ)反应,抗药抗体反应可能会降低药物疗效或导致严重得不良反应。

在人体内,抗药抗体通常不会引起明显得临床反应。

但就是对于某些治疗性蛋白质,抗药抗体反应能引起各种临床得不良反应,包括温与事件及严重不良事件。

临床前研究表明,抗药抗体能对药物暴露、药物毒性作用、药物代谢动力学、药物效应动力学等造成影响。

因此治疗性蛋白质得免疫原性引起了临床医生、药企及监管机构得注意、为了评估生物药物分子得免疫原性,以及将实验结果与临床事件联系起来,在临床前研究与临床研究中,很有必要开发可靠得能够有效评估抗药抗体反应得实验方法。

这里方法学验证显得尤为重要,并且方法学验证就是药物上市申请必不可少得、现行得监管文件对于免疫分析方法得验证得指导相当有限,特别就是缺乏有关免疫原性分析方法得验证得指导、因此,本文对抗药抗体免疫分析方法得验证提供科学得建议、在现有得关于生物分析得规范性文件得基础上加入独特得性能验证。

笔者建议采用实验与统计学得方法进行免疫分析得方法学验证、这些建议被视为最佳得例子,旨在促进整个医药行业形成一个更加统一得抗体检测方法。

１、简介:
生物制药产品包括氨基酸聚合物、碳水化合物或核酸,一般通过人细胞系、哺乳动物细胞或细菌进行表达,比常规得小分子药物更大(一般大于1~3KD)、由于以上特性,生物制药产品引起免疫反应得潜力更大。

生物制药得免疫原性与产品得内在因素(种属特异性表位、外源性、糖基化程度、聚合或变性程度、杂质与制剂)、外在因素(给药途径、慢性或急性给药、药代动力学及内源性当量)、患者因素(自身免疫性疾病、免疫抑制、与替代疗法)相关。

抗药抗体反应可能会导致严重得临床症状,包括过敏、自身免疫与不同得药代动力学特征(例如,药物中与、生物分布异常与药物清除率增强等均可能会使药
物得得疗效发生改变)、药物引起得免疫反应就是药物安全性与有效性得重要指标,这也就是监管机构、生产企业、临床医生与患者共同关注得。

因此,美国食品药品监督管理局以及欧盟、日本、加拿大、澳大利亚等国家得监管机构均要求通过药理学或毒理学相关得方法对抗药抗体进行评估。

免疫原性与临床症状之间得相关性得研究依赖于临床前研究与临床研究中对于抗药抗体得客观检测与表征。

因此免疫原性生物分析方法在用于检测研究样本之前应进行适当得开发及验证、已有出版物提供了关于抗药抗体检测与表征得策略、方法开发及优化等方面得指南。

方法学验证就是对分析方法得评价,通过特定得实验室方法表明采用得分析方法适用于相应得检测要求。

具体到抗药抗体得检测方法,验证就就是指证明该方法能可靠得(例如一致性与重复性)在复杂得生物基质(血清或血浆)中检测出低量得药物特异性抗体。

方法学验证应该通过预先研究阶段与研究阶段两个阶段进行,预先研究阶段就是指在分析样品之前得工作,研究阶段就是指样品得分析工作,预先研究阶段与研究阶段对于表明分析方法得有效性与可控性同等重要、本文主要介绍抗药抗体免疫分析方法验证得主要性能特征,推荐方法学验证相关得方法与措施。

本指南应当被视为最佳实践范例,考虑到具体实际分析方法时,在保持科学合理性与客观性得情况下,也可以采取替代方法。

若采用替代方法,建议与监管机构进行充分讨论、以细胞功能为基础得中与抗药抗体生物检测与细胞介导得免疫分析不在本指南得讨论范围内、
2。

方法
2、1 抗药抗体检测
临床与非临床研究通常就是通过对治疗引起得抗药抗体反应得检测与表征来评估药物得免疫原性。

目前可通过多种方法可用于抗药抗体得检测,包括酶联免疫法(ELＩＳA)、放射免疫检定法(RIＡ)、放射免疫沉淀法(ＲＩPA)、表面等离子体共振(SPR)、电化学发光法(ＥＣL)。

每一种检测方法均有其优点与局限性,在最近得文章中已进行过讨论[8,14]。

不管就是采用何种方法,在方法开发与优化后均应进行正式得方法学验证,以保证该方法适合相应得检测要求。

因此可以预测,本指南得验证建议适用于大部分得抗药抗体免疫检测。

研究人员应根据检测系统得特点确定合适得方法学验证方案。

临床研究中抗药抗体得检测与表征通常包括四种不同类型得方法。

抗药抗体检测试验通常包括筛选试验与特异性确证试验,表征试验通常包括抗体滴定与中与抗体检测[10]、应用到具体研究样本时,抗药抗体分析试验需要两个关键决策参数,分别为筛选试验得筛选临界点(sｃrｅeｎing cut ｐoｉnt)与特异性确证试验得特异性临界点(ｓｐｅcｉｆiｃity cuｔpoint)。

筛选临界点有助于抗药抗体检测结果得分类,高于筛选临界点为活性样品(活性样品通常为潜在阳性样品),低于临界点为无活性样品、活性样品通过特异性确证试验(如竞争性药物抑制信号通路)检测就是阳性(特异性活性)还就是阴性(非特异性活性)。

特异性临界点为抑制信号通路所需得样品量,也就就是具体药物得抗药抗体,需要通过试验确定。

抗药抗体得检测方法通常就是非定量试验(有时就是半定量试验),因为没有可用得标准化得物种特异性得抗药抗体作为校正标准品［１５]。

阳性对照一般都就是内部开发得(例如单克隆抗体或高免血清得多克隆抗体),不可能将受试者检测到得所有抗药抗体作为阳性对照、如果准备使用质量单位标示抗药抗体水平,那应该证明标准品与试验样品得平行性,以确定样品得浓度得准确性［8,10]。

若未证明样品与标准品间得平行性,则准确性就是可疑得。

滴定法就是另一种评估抗体水平得方法,该方法不同样品稀释间容易缺乏平行性。

然而,值得注意得就是已有研究表明,滴定法适用于抗体水平得评估。

几十年来,临床上感染、自身免疫疾病得诊断与治疗以及预防接种等都采用这一方法[1６～22］。

滴定法比较抗药抗体反应
更为简便且所需得验证工作更少,因为其不需要再对不同产品得抗药抗体与标准品间得平行性进行详细描述与证明。

此外质量单位法每当标准品品改变时均需要进行重新验证。

综上所述,两种方法都无法提供准确得定量数据、因此,赞助商建议采用相对浓度(质量单位)或滴度表示抗药抗体水平、某些监管机构会更倾向于使用滴度单位。

滴度就是仍能产生阳性结果得最大稀释倍数得倒数。

在方法得开发与优化阶段,应先确定方法并进行记录,例如选择所需得试剂、最佳浓度、预期样品所需得最大稀释倍数等、这些需要研究人员在预先研究阶段进行简单或重复确证。

本文假定以下属性在验证之前已被确证:免疫分析方案及
方法设计,分析基质得类型,最大稀释倍数(ＭＲD)、试剂得最佳浓度、酶标板得均匀性评估(如位置得影响、漂移等)、监管机构可能会要求提供相关得数据支持、在方法得开发与优化阶段,通过对对照品得检测,对方法得变异性有一个初步得认识、
2.2 统计学得应用
降低验证过程中得主观作用就是本文得重点之一。

为了确保实验得客观性必须依靠于统计手段。

由于大多数研究者无法获得统计学家得服务,本文提供了简单且足够严格与有效得统计学方法。

所涉及得统计计算都可以采用商业统计软件进行计算,计算过程不需要经验丰富得统计学家。

然而,如果有统计学家协助进行验证实验设计与数据处理得话,统计学得应用可能会比本文提供得更为严格与有效。

3、预研究验证
临床与非临床研究中在开始样品生物分析前得验证试验称为预研究验证,它主要从数学与可定量方面描述分析方法得性能特征[8］。

预验证(prevalidａtio ｎ)就是指研究工作启动前得筹备工作,两者不能混淆。

另一方面,在研究验证就是指监控整个方法使用过程得性能特征,以确保方法得有效性与数据得可靠性。

通过完整得方法开发与优化后,分析方法应具备验证得条件,如优化试验数据表明检测方法具有潜在得可靠性与适用于相应得检测要求。

方法得可靠性依赖于分析设备与计算机系统得正常运转以及试验人员得熟练程度、本质上,
分析方法就是包含多个因素得整体系统而不仅仅就是试剂而已、验证方法应包括系统适用性,这属于在研究验证范畴、
建议开始预研究验证之前制定相应得验证实验方案或验证实验标准操作程序(SOP),验证实验方案应说明该方法得预期目得、分析方法得详细说明、待验证得性能特征以及精密度、稳健性、稳定性与耐用性得预期验收标准。

此外建议在验证实验方案中加入适当得实验细节与数据处理步骤,这样可以为验证人员提供一个明确得指导以确保更好得处理数据。

抗药抗体检测应建立相应得验收标准,有助于确保在研阶段得试验得有效性。

为此,应通过对验证过程中获得得数据进行统计评价后建立用于质控得系统适用性标准(可接受范围)。

此外,在研验证阶段中间精密度试验,对照品与样品检测也应有相应得验收标准。

当在研验证阶段得分析数据不符合验收标准时,应拒绝该数据、在预研验证阶段不应建立验收标准,因为这可能会使某些验证数据被排除,导致不能准确估计分析误差。

除了可明原因(如技术误差)、有意或无意偏离实验方案所得分析数据应被剔除外,预研阶段得所有分析数据都应计算在内、目前,
美国食品药品监督管理局(ＦＤA)、国际协调会议(ICH)与美国药典得指导性文件阐述了定量检测得分析验证应研究得一般性能特点[２3～25］。

由于抗药抗体免疫分析属于半定量检测,所以有些要求并不不适用、对于抗药抗体免疫分析方法学验证,应对以下９项参数进行测定:
1、筛选临界点
２.确证临界点
３、灵敏度*
４。

系统适用性控制(QCs)验收标准
5、耐药性＊
6.精密度
7。

鲁棒性
8。

稳定性*
９。

耐用性(有条件时)
如果分析方法得开发与优化过程已充分说明并得到适当记录,在预研验证阶段不需要对以上标有*得参数进行重复验证,尽管验证报告中应提供相关得数据、如果最终得方法有所变动得话,预研验证阶段应重新测定。

抗药抗体检测方法开发阶段得预期用途与产品上市后得用途可能会不同。

例如,在开发早期只有一个分析人员进行试验,开发工作完成后与上市后可能会有
多个分析人员进行试验。

整个产品生命周期得验证要求应随着检测方法应用得改变而改变。

然后,在药物申请期间还就是应对以上列出得参数进行验证。

传统分析方法得稀释线性测试不适用于抗药抗体检测。

当使用滴度标示抗药抗体反应时,需要使用阳性对照,或者最好使用累积抗药抗体阳性样品,在合理稀释范围内不出现异常非线性。

通常,在方法开发阶段都会包括最大稀释浓度(MRD)得选择,验证阶段不需要进行重复测定。

如果出现前带效应,建议选择一个不受前带效应影响得MRD,或者采用多种稀释样品。

稀释线性信息有助于设计系统适应
性质量控制。

3、１筛选临界点
筛选临界点定义为筛选试验得响应水平,响应值高于该临界点得样品为活性样品(或者称为潜在阳性),响应值低于该临界点得样品为阴性样品。

一个有效得筛选临界点需要在预研究验证阶段对一些列样品测定值进行系统性得统计分析
确定,所使用得样品要求来自代表药物使用目标群体或受试者、
当免疫分析得方法存在错误风险时,筛选试验宁可出现假阳性也要避免假阴性［８,10]、如果筛选试验中不能识别出活性样品,应怀疑该方法检测低阳性样品得能力。

约5%得筛选试验得阳性结果为假阳性,从而保证可以检测出低阳性样品[８］。

在实践中,假阳性结果总比没有阳性结果好(如假阳性率可能不等于5%)。

3。

1、１筛选临界点得类型
可以应用于在研验证阶段得筛选临界点共有三种:固定临界点、浮动临界点、动态临界点。

(a)固定临界点:
预研验证阶段确定固定临界点,然后应用于在研验证阶段、固定临界点用于测试样品得分析,直到需要重新验证或改变(如测定方法发生关键变化、转移到另
一个实验室进行试验或仪器升级等)。

固定临界值在一个目标人群得同一研究中或多目标人群得各研究间就是固定得。

当预研究阶段得整个试验得均值相等、方差齐性时,采用固定临界点、
(b)浮动临界点
浮动临界点有两种计算方法,分析过程中数据需要进行对数(Loｇ)转换时,
通过预研阶段确定得特定归一化因子乘以在研阶段得生物背景计算而得;分析过程无对数转换时,计算方法归一化因子加上生物背景,生物背景可以由阴性对照(由样品得基质组成,抗药抗体反应为阴性)、分析稀释剂或预处理受试者样品(个体特异性临界点)标示、浮动临界点可以就是每一次试验每一块板(每一次试验中得若干块板)所特有得或每一个受试者所特有得(使用受试者得预处理／基线样
本结果)。

如果采用个体特异性临界点,需要在同一块板上检测预处理样品与处理后样品(或至少在同一试验中检测)、由于浮动临界点得确定过程需要对预研究验证得数据进行方差估计,所以不同试验间得结果应表现出方差齐性。

采用阴性对照进行归一化时,应确保阴性对照结果能代表目标人群得药物初治基质样品得结果,例如通过验证阴性对照均值与生物基质样品均值在整个试验中就是相关联得。

如果均值相关,阴性对照均值适用于计算浮动临界点、如果均值不相关,则使用稀释液或预处理样品结果进行归一化处理更为合理。

(ｃ)动态临界点、
同一试验得不同板之间、同一研究得不同试验间或不同研究间得动态临界点均不同、动态临界点得确定不需要预研究阶段得方差估计。

这一特征将动态临界点与浮动临界点区别开来。

只有当不同试验间得结果方差有显著性差异时,才使用动态临界点。

实际使用时,动态临界点得限制性因素就是每次试验都需要大量得样本数才能确定临界点。

建议优先采用固定临界点或浮动临界点、如果试验间得均值或方差存在差异,建议在采用动态临界点之前先进行差异来源调查、例如,若果差异来源于分析员或设备,则采用分析员或设备得固定临界点或浮动临界点
代替动态临界点。

因为动态临界点就是一种不常见得非常规方法,建议谨慎制定该临界点,最好能与监管机构进行充分沟通。

3。

1。

2 评估临界点得样品
建议从适当得人群中抽样用于分析临界点得评估。

有时候需要在开始预研究验证试验之前从目标疾病人群中获得样品基质就是不实际得,甚至就是不可能得。

因此,一般从药物初治健康受试者得样本中进行评估,并确立一个起始临界点、该方法适用于于临床I期得研究、当临床研究开展到临床II期以后,便可得到目标疾病患者得样本,应该对不同得目标人群重新评估临界点。

如果目标人群与正常志愿者得响应值得平均值与方差相当,可以使用同一个临界点。

如果没有可比性,则需要采用目标疾病特异性得临界点。

为了确定临界点,在验证阶段应分析足够数量得样本,这样才能对生物与分
析变异进行有效得统计学评估。

通常在临床研究中,需要分析超过５0个独立受
试者得样本。

非临床研究至少需要15个样品、不应使用混合基质样品进行临界点评估,因为从混合样品中测试重复得样品,检测得只就是分析变异而不就是生
物变异。

建议采用平衡实验设计有效评估潜在得变异性来源(see Ａppendix A)。

如果将有多个分析员在研究过程进行分析样品操作,那么在预研究验证阶段应至少包括两位分析员。

如果研究过程中只有一个分析员进行样品分析,而这个分析员与验证阶段得分析员不同,预研究验证阶段也应至少包括两位分析员、就是否需要对同一样品进行重复试验取决于在研验证得报告形式(例如在微量滴定板中进行两个复孔或三个复孔)、
３.1.３排除异常值
应确认药物初治患者得偶然活性样本,以确保药物得特异性。

在这一点上,
确证临界点将不能真正得确认阳性,此时应该使用科学得判断方法,应排除无法
确定就是否为偶然活性样本。

在分析临界点得统计学评估时应去除抗药抗体阳性样品与统计学异常样品(样品响应值过高或过低)。

因为下部极端异常值通常会使差异性波动从而影响临界点,所以应当排除。

去除较高或较低异常值会得到一个较低得临界点,通常会增加假阳性率而变得更为谨慎(假阳性样本会在随后得特
异性确证试验中被证明为阴性)。

如果在临界点评估中使用了强大得统计方法(例如基于中位数得方法,图基得Tｕkey’s biｗeiｇｈt函数),则不需要排除异常点。

3。

1、4 确定筛选临界点
为了确定筛选临界点得类型,需要进行一系列得数据评估,如图1所示。

首先,如果使用参数估计得方法,需要对药物初治得样本结果得分布类型进行检验(正态分布检验),如果数据不符合正态分布,则可以对数据进行适当得转换(如对数转换),然后排除异常值(ApｐｅndiｘB、1)。

如果不需要用到参数估计(第95百分位),则不需要进行数据转换,但仍需要排除异常值。

其次,采用单因素方差分析(ＡNOVA—based stａtisｔicaｌｍethodｓ)得统计学方法处理比较每一次试验运行得平均值与方差,从而决定采用固定临界点、浮动临界点还就是动态临界点(Appeｎdix B、2)。

在浮动临界点得评价过程中,如果归一化过程使用了阴性对照,则应该将阴性对照得均值与目标人群得基质样本进行比较,以确定就是否适合使用阴性对照。

最后,基于以上评估,使用适当得统计学方法计算出临界点(Ａｐpendix B.3)、
3、2 确证临界点
特异性就是分析方法在其它基质成分存在得条件下明确检测目标分析物得能力[2３］。

筛选试验筛选出活性样品(通常称为潜在阳性),因为筛选临界点允许５％得假阳性率,所以这些活性样品可能就是非特异性得、因此从活性样品中鉴定出阳性样品需要药物得特异性活性、检测人源样本得抗药抗体特异性就是一种常见得做法,动物样本也一样。

特异性确证试验通常就是一个竞争性抑制试验,通过检测含或不含预孵育研究药物得样品得信号变化来进行评估。

此外还可通过比较相同大小与电荷得免疫无关得蛋白质进行评估。

还有一些研究者通过比较加药与不加药得信号区别进行评估,然而本文建议与监管机构积极讨论这一方法得可接受性。

以上得任何一种方法,确证阳性信号得变化值称为确证临界点。

确证临界点将抗体与药物得特异性结合与非特异性结合区别开来,其有效性非常关键,必须客观评估。

不鼓励使用5０％信号抑制等主观标准。

信号略高于临界点得低
信号得抗药抗体弱阳性样品得评价尤为重要、抗药抗体强阳性药品需要用过量得药物进行竞
争性抑制,所以一般不会出现这一问题。

当评价抗药抗体弱阳性样品时,即使就是加标药物样品得信号很细微得减弱都可能会使相对应得未加标药物样品得信号降低５０%以上,从而导致假阳性。

此外,只有将抗药抗体阳性样品得信号下降到背景信号,这信号强度只有未抑制样品信号得50％以下,这样可能会出现假阴性、因此,特异性确证临界点应该通过客观得方法进行评估,在弱阳性样本附近评估分析方法得变异性。

有多种试验方法可以用于特异性确证临界点得评估、
建议在筛选临界点得验证过程评估特异性确证临界点。

筛选临界点评估试验所用到得药物初治样本可以加入药物后再以相同得方式检验、计算未加标药物样本(抑制)得均值与标准偏差(SD),特异性确证临界点为抑制平均值加上3。

09倍得ＳＤ值(如果预期假阳性率为1%)。

与筛选临界点得评估一样,特异性确证临界点得评估过程也需要排除异常值。

特异性确证临界点得详细计算步骤参见附录C(Ａppｅnｄiｘ C)、
在某些实验室,会在低于筛选临界点得样品(建议样本量大于等于2５)中加标阳性对照使其信号值等于或稍微大于筛选临界点、用过量药物孵育后,计算平均抑制百分率,并通过“×SD"值进行校正,确定特异性确证临界点(“×"取决于适当得假阳性率)。

必须确保阳性对照样品得信号不会高于筛选临界点太多,以免使假阳性率增高。

这一方法确定得特异性确证临界点高度依赖于所使用得阳性对照品。

值得注意得就是,研究样本中得低抗药抗体亲与力样本(特别就是多价Ig Ｍ,亲与力成熟得IgＧ)可能会不被抑制。

因此,使用单一阳性对照品确定得特异性确证临界点可能无法有效地将一个研究样品分为特异性样品还就是非特异性样品。

Neyｅｒ等提出了一种基于T检验(t-tｅst)得表示抗药抗体特异性得方法,该方法得原理就是比较未加标药物样品与加标药物样品得信号值。

然而,该分析法得竞争性抑制结果得观测样本量相当有限,没有考虑到生物变异得影响。