第1章 结构鉴定(4)CE、XA

毛细管等速电泳(Capillary Isotachophoresis，CITP)。
• 各分离模式所要求的载体电解质和分类见表。
表1-33 毛细管电泳分离模式
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8.1.2毛细管电泳与常规电泳比较 • 电泳分离是基于溶质组分在电场下的迁移率不同而进行的。 • Tiselius电泳，分离效率受对流影响，而抗对流介质如聚丙烯 酰胺或琼脂凝胶又影响速度。平板和管状凝胶主要用于生物 分子的分离。平板凝胶电泳最常用，但存在分析时间长、分 离效率低、检测灵敏度低、分析结果难以保存、自动化程度 低等缺点。
自由溶液毛细管电泳(Free Solution Capillary Electrophoresis，FSCE)
毛细管胶束电动色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography， MECC)
毛细管凝胶电泳(Capillary Gel Electrophoresis，CGE) 毛细管等电聚焦(Capillary Isoelectric Focusing，CIF)
• 6.进样体积小（1～50 nL）；
• 7.可选择约分离模式多，应用范围广； • 8.分离一般在水溶液介质中进行； • 9.方法简单，仪器自动化程度高。
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8.2毛细管电泳仪
• 毛细管电泳是基于溶质在高电场下，在装有电泳介质的毛细 管中的迁移速度不同而进行分离的技术。 • 毛细管电泳仪主要包括进样、分离、检测及数据处理系统。 典型CE实验步骤：
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• 常用Ogston模型和爬行(Reptation)模型解释大分子在聚合 物网络中的迁移行为。Ogston模型假设凝胶基质是由相互 连接的孔组成的无规网络，平均孔径为ξ，溶质为半径为
Rg的刚性小球。
Ogston模型
爬行(Reptation)模型
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图1-67 大分子在聚合物网络中的迁移行为
• 溶质在凝胶中的迁移率等于溶质在自由溶液中的迁移率乘 以ξ≥Rg的概率，即： μ = μ0Р（ξ ≥R g） • μ0 、μ溶质在自由溶液、凝胶中的迁移率；ξ凝胶的平均孔 径；R g溶质的半径；Р为ξ≥R g的概率。 • 根据凝胶孔径与浓度的关系可推出： μ ＝μ0exp[-K Cp(γ + R g )² ] • K为比例常数；Cp为凝胶或聚合物的浓度；γ为凝胶聚合 物链的厚度。一般R gγ，有： μ＝μ0exp(-KCpRg² ) • 表明㏒μ与聚合物浓度C成线性，其斜率与Rg2成正比。 • Ogston 模型中把溶质看成是刚性小球，当溶质半径大于 孔径时，溶质的迁移率为0，不能分离，但事实上，大部 分溶质都是柔性的链状分子，即使R gξ也能分离，因此 产生了爬行模型。
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• 爬行模型认为，当长链柔性大分子 通过聚合物网络时，象蛇一样头部 先通过，溶质迁移过程就象爬行运 动，运动的摩擦系数为f，可导出f 与分子体积的平方成正比： f ∝ N2
• 对DNA或SDS-蛋白质，N与电荷q成正比，因此有： μ = q/f = 1/N • 链状分子在凝胶中的迁移率反比于溶质分子体积。 • Gromssman等以不同碱基的DNA为溶质，测定了不同浓度 羟乙基纤维素(HEC)作为聚合物网络时溶质分子的迁移行 为，发现在HEC低浓度时溶质的迁移行为符合Osgton模型， ㏒μ正比于HEC浓度；当HEC％增加时，㏒μ与㏒(1/N)线性 斜率接近于1，符合爬行模型。
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• X射线的波长位于0.001 ～10nm之间，与物质的结构单元尺 寸数量级相当。X射线衍射技术是利用X射线在晶体、非晶 体中衍射与散射效应，进行物相的定性和定量分析技术。当 一束单色的X射线照射到试样上时，可观察到两种过程： （1）如果试样具有周期性结构(晶区)，则X射线被相干散射， 入射光与散射光之间没有波长的改变，这种过程称为X射线 衍射效应，若在大角度上测定，则称之为广角X射线衍射 (Wide Angle X-ray Diffraction，WAXD)。 （2）如果试样是具有不同电子密度的非周期性结构(晶区和 非晶区)，则X射线被不相干散射，有波长的改变，这种过程 称为漫射X射线衍射效应(简称散射)，若在小角度上测定， 称为小角X射线散射(Small Angle X-ray Scattering, SAXS)。 • WAXD及SAXS在高分子材料研究中应用广泛，分别叙述。
20 cm 30 cm
图1-68 毛细管有效长度对p(d A)12-18核苷酸分离的影响
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9 X射线分析
• 9.1 X射线概述
• 9.2 X射线衍射分析
9.2.1 布拉格定律 9.2.2 高聚物结晶度 9.2.3 X射线衍射仪 9.2.4 X射线衍射分析的样品制备
• 9.2.5 WAXD在高分子材料研究中的应用
表1-34 毛细管电泳与高效液相色谱比较
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8.1.4毛细管电泳特点 • 1.电泳在细内径（25～75 μ m）的石英毛细管中进行； • 2.毛细管中缓冲溶液具有高电阻，限制了焦耳热的产生； • 3.高压（10～30 kv）和高电场强度（100～500 vcm-1）的 应用； • 4.高效、快速； • 5.在柱检测；
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8.4毛细管凝胶电泳在高分子材料分析中的应用
• 毛细管凝胶电泳中常用的聚合物可分为凝胶和线型聚合物 溶液两大类。 • 凝胶又可分为共价交联型和氢键型，CGE中常用的凝胶是 交联聚丙烯酰胺，而氢键型凝胶如琼脂等使用不多。 • CGE中可以用水溶性线型聚合物溶液代替凝胶，常称之为 无胶筛分。 • 常用的线型聚合物有聚丙烯酰胺、羟烷基纤维素、聚乙烯 醇和葡聚糖等。
• 毛细管电泳是一种仪器分析方法。 毛细管本身抗对流。用毛
细管代替平板凝胶进行电泳类似于用色谱柱代替薄层色谱。 • 毛细管电泳各种分离模式的发展，扩大了电泳的应用范围， 电泳不再局限于大分子的分离，也能用于小分子离子，及阴、 阳离子和中性分子的同时分析。
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8.1.3毛细管电泳与高效液相色谱比较 • 毛细管电泳是色谱和电泳相结合的分离分析技术，与目前广 泛使用的高效液相色谱相(HPLC)相比有许多异同点。
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• 1、区带电泳(Zone Electrophoresis)：不同的溶质 在均一的缓冲溶液(或称载体电解质)系统中分离
成独立的区带，如果用光密度计扫描可得出一个
个互相分离的峰，与洗脱色谱的图形相似。电泳 的区带随时间延长扩散严重，影响分辨率。以凝 胶作为载体电解质时，抑制了组分扩散，又兼有 分子筛的作用，故分辨率大大提高，应用最广。
• 1937年，瑞典科学家Tiselius首先将电泳作为分离技术，创 造了Tiselius电泳仪，首次从人血液中分离出五种蛋白，并于 1948年获得诺贝尔化学奖。分辨率有限，而且产生的焦耳热 会引发对流，导致区带扰乱。
• 50年代以后，出现了各种抗对流支持介质：滤纸、醋酸纤维、
琼脂凝胶和淀粉凝胶的区带电泳。 • 1959年，Raymond和Weint利用人工合成的凝胶作为支持介 质，创造了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了区带电泳的 分辨率。广泛地应用于生物大分子的分离。
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• CGE中使用的毛细管内径通常50～100 μm，长度从几厘米 到1米。一般增加毛细管的长度可提高分辨率，但分析时间 也大大增加，常用的毛细管有效分离长度为15～40 cm，图 为增加毛细管有效分离长度对分离的影响。 • CE条件：MICRO-GEL凝胶毛细管柱；缓冲溶液，75 mmol/L； Tris-磷酸盐pH=7.6；电场强度，300 v/cm；检测 波长，260 nm，温度30 oC ；毛细管长度，(a)20 cm，(b)30 cm。p(d A)12-18聚腺四嘌呤脱氧核苷酸(12-18碱基)。
第一章 结构鉴定
1.1 傅里叶红外光谱 1.2 激光拉曼散射光谱 1.3 紫外光谱 1.4 荧光光谱 1.5 质谱法 1.6 气相色谱法 1.7 核磁共振波谱法 1.8 毛细管电泳 1.9 X射线分析 1.10 Xpillary Electrophoresis，CE)是80年代初迅速 发展起来的一种新型的电泳与色谱相结合的分离分析技术， 具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广 等特点，已成为现代重要的分离分析手段，在生物、化学、
(1)将载体电解质充满毛 细管。 (2)移去进样端缓冲溶液
瓶，用样品瓶代替
(3)用静压力或电动进样 方式进样。
(4)将进样端缓冲溶液瓶
放回。 (5)加电压分离、检测。
图1-66 毛细管电泳仪原理示意图
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8.3毛细管凝胶电泳基本原理
• 分离和分析生物高分子材料主要采用毛细管凝胶电泳(CGE) • CGE以凝胶或聚合物网络作为分离介质，基于被测组分的荷 质比和分子体积不同而进行分离。对荷质比相同而分子大 小不同的溶质如DNA和SDS-蛋白质主要是基于溶质的分子 体积不同而分离。这类溶质在自由溶液中的迁移率相近， 不能用FSCE模式分离。与FSCE一样，CGE也是采用区带电泳 技术，但由于凝胶的分子筛作用，溶质在电泳迁移过程中 受阻碍，分子越大，阻碍越大，迁移越慢。
• 9.3 小角X射线散射 9.3.1 SAXS原理
9.3.2 SAXS在高分子材料研究中的应用
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9 X射线分析
• X射线是在1895年由德国物理学家伦琴(W.C.Roentgen)发 现的，称为“X”射线。后称为伦琴射线。X 射线最初来 检查人体伤、病。其后不久，又被工程师们用来检查金属 或其他不透明物体内部缺陷。 • 1912年，劳埃(Max Von Laue)等发现了X射线的晶体衍射 现象，证实了X射线是一种电磁波。它的波长与在晶体中 发现的周期具有相同的数量级。 • 劳埃实验证明了晶体内部原子排列的周期性结构，它使结 晶学家手中增添了一种研究物质微细结构极有利的工具， 使结晶学进入了一个新时代。 • 稍后，一些科学家已经开始用X射线测定聚合物晶体结构， 最先是纤维素晶体结构的研究。
• 本章内容简单介绍毛细管电泳，主要阐述毛细管凝胶电泳在
生物高分子分析中的应用。
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8.1毛细管电泳分类及特点
8.1.1分类 • 按分离原理不同电泳可分为四种类型，分离原理见图。
表1-20 电泳的分类及与色谱的对应关系
图1-65 各种电泳分离原理示意图
(a)区带电泳；(b)移动界面电泳； (c)等速电泳； (d)等电聚焦
医药、环保、食品等领域具有很好的应用前景。
• 特点：以电泳或电渗作为分离的主要动力，以类似于色谱 柱的毛细管作为分离管，同时具有电泳的高分离效率和现 代色谱的快速、在线检测、自动操作等特点。 • 基础：电泳和色谱的技术与理论。
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• 所谓电泳就是带电粒子或离子在电场的作用下作定向移动。
• 1809年，俄国物理学家Peace首次发现电泳现象。
图也是台阶状，但异于移界电泳，它的区带没
有重叠，而是依次排列。 • 4、等电聚焦：被分离的离子和两性电解质溶 液混合装入毛细管，在电场的作用下，不同等 电点的两性载体电解质自动形成pH梯度，被分
离离子各自移至其等电点，形成很窄的区带。
分辨率很高。
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• 毛细管电泳是指所有在极细毛细管内进行的电泳，根据分离 原理的不同，分为五种不同的分离模式：
• 2、移界电泳：只能起到部分分离的作用，如将
浓度对距离作图，则得出一个个台阶状的图形， 与色谱法前沿分析的图形相似。最前面的成份是 纯的，其他则互相重叠，各界面可用光学方法显 示，这是Tiselius最早建立的电泳方法。
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• 3、等速电泳：样品离子置于前导和终末电解 质之间，在电泳达到平衡后，各迁移率不同的 离子前后相随，以等速移动。按浓度对距离作
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• 1981年，Jorgenson和Lukacs，使用75μm内径100cm长的玻璃 毛细管在30kv的高电压下进行电泳，获得了数十万理论板数 的高分离效率，使该技术有了突破性进展。
• 1989年以后，毛细管电泳商品仪器及高灵敏度在线检测器。
• 应用范围广：最初认为它主要用于生物大分子的分析，现已 经证明它能用于氨基酸、手性药物、维生素、农药、无机离 子、有机酸、染料、表面活性剂、肽和蛋白质、碳水化合物、 低聚核苷酸和DNA片段，甚至整个细胞和病毒粒子的分离。