形态学实验技术PPT课件

固定方法 浸泡固定 注射、灌注固定 微波固定 蒸汽固定
常用的固定剂
单纯性固定剂：甲醛（福尔马林 formalin） 乙醇；乙酸。 混合固定剂：中性甲醛pH 7.0（甲醛、磷酸
缓冲液）；A-F液 （甲醛、酒精）
三、脱水（dehydration）
将组织内的水分用某些化学试剂置换出来 的过程
脱水的目的
凡是能作抗原、半抗原的物质，如蛋 白质、多肽、核酸、酶、激素磷脂、 多糖、受体及病原体等都可用相应的 特异性抗体在组织、细胞内将其用免 疫细胞化学手段检出和研究。
乳腺导管癌 ER
细支气管肺泡癌 TTF-1
2 取材部位及切面：纵切或横切往往是显示 组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部 位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点， 原则上应在病变与正常组织的交界处取材， 避开坏死出血区。
，甚至卷曲变形，特别是神经肌肉组织，可 将其两端扎在木片或小木棍上进行固定。 3.勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切 开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结 构变形、细胞破碎。
7. 0.5-1%盐酸酒精分化数秒钟。 8. 充分水洗蓝化30分钟。 9. 0.5-1%伊红1-2分钟。 10. 80%、95%、纯酒精1、2(脱水)各5分钟。 11. 二甲苯1、2中(透明)各5－10分钟。 12. 中性树胶封固。
HE染色中二甲苯、酒精和水洗作用：
1.二甲苯的作用:二甲苯可以洗去石蜡，使染料更
3.水洗: 水洗是为了使苏木精进入细胞核内，使细
胞核着色；染色后的水洗是为洗去未与切片结合 的染液；分化后的水洗是为了除去分化液和脱下 的染料。
HE染色中分化和蓝化的作用：
1.分化作用:苏木素染色后,水洗去未结合在切 片中的染液,但细胞核内结合过多的染液和 细胞浆中吸附过多的染料必须用分化液(1% 盐酸酒精）脱去，以保证核与浆的染色分 明。将此过程称为染色的分化作用。但不 能过度。
尤其是癌基因的检测血细胞表型分析细胞分子和粘附分子的检查细胞分析细胞分子和粘附分子的检查细胞凋亡分析肿瘤相关抗原及单种细胞的纯凋亡分析肿瘤相关抗原及单种细胞的纯编辑课件ppt组织切片的制作技术属于组织病理学范组织切片的制作技术属于组织病理学范畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支持物质使组织保持一定的硬度然后利持物质使组织保持一定的硬度然后利用切片机切成薄片经染色在显微镜下观用切片机切成薄片经染色在显微镜下观察
第一章 组织切片制作技术
第一节概述
组织切片的制作技术属于组织病理学范 畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支 持物质，使组织保持一定的硬度，然后利 用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观 察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明 胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制 成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进 行染色或备用。
第一节 免疫组织化学概论
免疫组织化学是利用免疫学抗体与抗原结 合的原理及组织化学技术对组织、细胞特 定抗原或抗体进行定位和定量的技术，是 免疫学与细胞化学相结合的一个分支学科。 若想学好免疫组织化学，必须先了解与之 相关的免疫学基础。
免疫组织化学主要原理是用荧光素、 生物素或地高辛等标记的抗体（或抗 原）对细胞或组织内的相应抗原（或 抗体）进行定性、定位或定量检测， 经过组织化学的呈色反应之后，用显 微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。
第二节 苏木素—伊红染色（HE染色）
苏木素（haematoxylin）又称苏木精，一 种天然碱性染料，对细胞核具有优良的染 色能力。
伊红Y（eosin）又称曙红Y,简称伊红，属酸 性染料，是良好的细胞质染色剂。
苏木素(haematoxylin)—伊红染色法，简称 HE染色，是医学领域中最广泛应用于细胞 和组织的染色方法，也被称为常规染色。
2.蓝化作用: 当分化以后苏木精在酸性条件下 处于红色离子状态，在碱性条件下则处于 兰色离子状态。所以分化后用水洗去酸而 中止分化，也可用稀氨水或温水变蓝。此 过程称蓝化作用。
第三节 组织切片特殊染色(Masson三色染色)
为了显示组织或细胞中的正常结构或病理 过程中出现的异常物质、病变、病原体等， 需要选用相应的显示这些成分的染色方法 进行染色，这些是常规染色所不能的。故 称特殊染色。如细胞中的黑色素或含铁血 黄素的区别，用特殊染色即可做到。
固定的目的：
1.迅速防止组织细胞的死后变化,防止自 溶与腐败使之尽量保持生前的形态结 构。
2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等 成分变为不溶性物质，以保持其原有 形态及特定位置。
3.能将细胞的半液体状变成半固体状， 使组织变硬以利切片。
4.可使组织内的各种成分产生不同的折 光率。
5.某些固定液可起助染作用而增进染色。
组织切片技术包括组织的取材、固定、 脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染 色等。
组织病理学标本大致可分为：手术标 本、内镜取材标本、穿刺标本、细胞 学标本
第二节 组织的处理
取材 固定 脱水 透明 浸蜡与包埋
一、取材（ tisssue processing）
1 材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最 迟不能高于30分钟。
第三节 组织切片
切片（section） 1.整修蜡块：组织四周应留有2－4 mm 蜡边，
蜡块的上下两边应平行。 2.镶装：镶装平面应尽可能与切片刀刃平行。 3.调整：切片机的进度尺常定在4－6μm，切
片刀的倾斜角在20度左右。 4.修切平面：修切的组织片不能过厚，以免
造成组织块的人为损失，标准为15μm／次。
标本经固定和水洗后，组织内有大量水份， 不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。
常用的脱水剂和脱水方法
脱水剂有：乙醇、丙酮等
80％ 酒精
30 分钟
95％ 酒精
1－2小时
95％ 酒精
1－2小时
100％酒精
1－2小时
100％酒精
1－2小时
四、透明（clearing）
为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经 过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂， 而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的 水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白 的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡 包埋前的一个特定步骤。
常用的透明方法
二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织 块 二甲苯1 二甲苯2，此二步总的时 间不超过40分钟。
氯仿透明法：彻底脱水的组织块按 3：1 氯仿、纯酒精混合液1小时 氯仿1 - 2小 时 1：1氯仿石蜡混合液1小时。
五、浸蜡与包埋
浸蜡(paraffin infiltrating)和包埋(embedding)
显示胶原纤维的方法很多，最常用的是 Masson三色染色和V.G染复情况； 区分肿瘤组织中的纤维与平滑肌成分。
Masson三色染色技术操作
Masson复合染色液：酸性复红、丽春红、橘黄G、 醋酸
亮绿染色液（可用苯胺蓝替换）：亮绿、醋酸 染色过程： 1.切片脱蜡至水 2. 苏木素染5分钟 , 水洗 3. 盐酸酒精分化, 水洗 4. 染于丽春红复红液5分钟, 水洗
易进入到细胞和组织内；染色后的二甲苯起透明 切片的作用。以利于光线的透过。
2.酒精的作用:酒精用于苏木素染色前由高浓度向
低浓度逐渐下降处理切片,洗脱用于脱蜡的二甲苯。 酒精和二甲苯互溶，二甲苯被除去。梯度酒精 (95%,80%)使水分逐渐进入切片，以免引起细胞 形态结构的人工改变。
伊红染色后的梯度酒精(80%,90%,95%,100%)是 为了逐渐脱去组织中的水分,为二甲苯进入细胞 (透明)创造条件。否则切片组织不能显示清晰的 细胞和组织结构。
5. 磷钼酸水溶液分化5分钟,水洗 6. 染于亮绿2-5分钟 7.脱水、透明、封固
结果判定: 胶原纤维呈绿色或蓝色，肌纤维、纤维 素、红细胞呈红色，胞核呈蓝黑色。
脑尼氏体
星形细胞
肾淀粉样变 刚果红染色
肝表面抗原维多利亚蓝
第三章 免疫组织（细胞）化学 (immunohistochemistry,IHC)
5.切片：要求质量，左手毛笔，右手眼科镊， 转速均匀。
6.展片、捞片：常用水温为450C左右，组织 膜与玻片附着的位置为，右手持片，玻片 的左2／3正中。
7.烘片：烘烤箱的温度为630C以下，时间常 为12小时。
第二章 石蜡切片常规染色技术
第一节概述
染色的意义及目的: 染色（stainning）是用 染液对组织切片进行处理，使组织中的不 同成分被染上相应的颜色，产生不同的折 射率，以利于光镜观察和分析。组织染色 属于生物染色的范畴。 染色种类： 包括普通染色、特殊染色、单一染色、多色 染色等。
结缔组织含有三种纤维，即胶原纤维、网状 纤维和弹力纤维。这三种纤维广泛分布于身体各 处，常见于器官与器官之间，组织与组织之间以 及细胞和细胞之间，这些纤维具有支持、连接、 营养、防御、保护和创伤修复等功能，在H.E染 色中有时难以区别，特别是在某些病理改变时， 则要借助于特染鉴别。
特殊染色的方法很多，在此仅介绍胶原纤维 染色。
激光扫描共聚焦显微镜技术（Confocal Laser Scanning Microscope）集高、精、
尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器 突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进 行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层 扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞 内pH、Ca离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞 间通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究 开辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺 少的的工具。
是指标本经过前期处理后，再置于支持 物中，使支持物透入组织内部，并将组织 埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、 石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们及时 浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。
浸蜡的方法
此法应在560C－620C的温箱内进行，液状 石蜡的量应为标本的25－30倍。
方法：透明后的组织 520C－540C（软蜡） 1小时 540C－560C石蜡1小时 580C－ 600C（硬蜡）1小时 540C－560C石蜡进 行包埋
一、HE染色的基本原理
细胞核染色的原理：细胞核主要由DNA构成， 带负电荷，呈酸性，易于带正电荷的碱性 染料结合。
细胞质的染色原理:细胞之内主要成分是蛋 白质,为两性化合物，细胞浆的染色与pH值 有密切关系，当pH调到蛋白质等电点时， 胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不 易染色。
必须将pH调至等电点以下时，再染液中加 入醋酸使胞浆带正电（阳离子），就可被 带负电荷（阴离子）的染料染色。
透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水
剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起 到桥梁作用。
大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶， 故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进 行后续程序。 常用的透明剂 二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、 易挥发；沸点1380C-1400C,长期接触对 粘膜有刺激作用。 氯仿:易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯 等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织 变脆，使大块组织的良好透明剂
伊红Y: 是一种化学合成的酸性染料，在水 中解离成带负电的阴离子，与蛋白质的带 氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染 成红色。
二、染色方法
1.自温箱中取出切片后，立即放入二甲苯 ①、②中脱蜡各5分钟。
2.入纯酒精1、2中各5分钟以洗去二甲苯。 3.入95%酒精和80%酒精中各5分钟。 4.入自来水洗涤（水化）。 5.入苏木素染液5-10分钟。 6.自来水洗。
流式细胞仪技术（Flow Microfluorimetry）
是一种单细胞定量分析和分选的新技术。 其范围包括了细胞表面或细胞内的各种抗 原、蛋白、酶以及基因表达产物；还有细 胞内的核酸定量或DNA倍体、细胞周期分 析；尤其是癌基因的检测、血细胞表型分 析、细胞分子和粘附分子的检查、细胞凋 亡分析、肿瘤相关抗原及单种细胞的纯化。
形态学实验技术
河北联合大学实验中心 李琪佳
重点介绍：
组织切片制作技术
石蜡切片常规染色技术 石蜡切片特殊染色技术
免疫组织（细胞）化学技术
免疫细胞化学的理论基础 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术
电子显微镜技术（electron microscope, EM）
1. 透射电子显微镜 2. 扫描电子显微镜 3.电镜技术与生物医学超微结构 4. 细胞超微结构与超微结构病理
4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生 收缩现象
5 组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及 质地决定了固定的效果，一般情况下，取 材大小为2×1cm，厚度为2－4mm。
二、固定（fixation）
固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需 要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中， 使其所含物质尽量保持在生活状态时的形 态结构和位置。