枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件及酶促反应动力学性质的研究_丁琳

第33卷第12期辽 宁 化 工Vol.33,No.12 2004年12月Liaoning Chemical Industry December,2004枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺
条件及酶促反应动力学性质的研究
丁　琳,王红心
(沈阳化工学院,辽宁沈阳110142)
摘 要:　以枯草杆菌为菌种液体培养制备碱性磷酸酶,研究确定了培养的最佳工艺条件,并对碱
性磷酸酶的酶促反应动力学性质进行了初步探讨。

结果表明,枯草杆菌制备碱性磷酸酶的最佳工艺条
件为:40℃,p H值7.4振荡培养10h,酶活最高。

对碱性磷酸酶的动力学性质研究表明,该酶催化底物
磷酸苯二钠水解反应的最适pH值8.8,最适温度52℃,米氏常数Km值为2.94mmol/L。

关　键　词:　枯草杆菌;碱性磷酸酶;酶促反应动力学
中图分类号:　TQ426.97 文献标识码:　A 文章编号:　10040935(2004)12069103
碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase EC3.1.3.1,简称AKP)能催化几乎所有的磷酸单脂的水解反应,产生无机磷酸。

该酶广泛存在于动物、植物、微生物体内。

在生物体内不仅直接参与磷酸基团的转移和钙磷代谢,维持体内适宜的钙磷比例,在脊椎动物的骨化作用中起着重要作用。

而且还与角蛋白等蛋白质的分泌有关[1]。

碱性磷酸酶主要应用于核酸,毒物学,医学研究,是基因工程常用的工具酶,也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。

人类血清中的碱性磷酸酶在不同疾病状态下有显著变化,临床上将血清碱性磷酸酶变化指标作为诊断某些疾病的依据,碱性磷酸酶添加到化妆品中有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢,并可用于核苷酸脱磷生产核苷[2～4]。

碱性磷酸酶可以从动物体内(如兔肝中)提取,但数量有限,而用微生物发酵方法具有繁殖速度快,生产数量大的优点,故本研究以枯草杆菌为菌种在不同条件培养制备碱性磷酸酶,确定了枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件。

并对其催化反应的动力学性质进行了研究。

1　实验部分
1.1　主要试剂和仪器
(1)菌种:枯草杆菌(沈阳化工学院微生物实验室提供,冰箱保藏);
(2)固体培养基:牛肉膏0.5%,蛋白胨1 %,NaCl0.5%,琼脂2%,(pH值7.4);
(3)Tris培养基:葡萄糖0.4%,酪蛋白水解物0.1%,NaCl0.5%,(NH4)2SO41%,KCl0.1 %,CaCl20.1mmol/L,MgCl21mmol/L,Na2HPO4 20μmol/L,溶解于0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH值7.4);
(4)三氯甲烷4-氨基安替比林(AAP),硫酸氢钠,铁氰化钾,硼酸,磷酸苯二钠,CP;
(5)数显恒温水浴锅,722型分光光度计,高速冷冻离心机,pHS-2C数字酸度计。

1.2　实验方法[5,6]
1.2.1　碱性磷酸酶的制备及提取
将枯草杆菌在固体培养基斜面上活化,接入Tris培养基于37℃振荡培养10h作为种子液。

然后将5%种量的种子液接入100mL Tris培养液基中,改变培养条件,保温振荡培养一定时间,取出加入5%甲苯,37℃保温30min,制成酶液。

1.2.2　碱性磷酸酶的活力测定
碱性磷酸酶的活性是根据在一定的pH值和温度下,碱性磷酸酶作用于底物磷酸苯二钠,使之
收稿日期:　2004-10-11
作者简介:　丁　琳(1963-),女,副教授。

水解释放出酚。

酚在碱性溶液中与4-氨基氨替比林(AAP)作用并经铁氰化钾催化,生成红色醌类化合物,在510nm波长处比色测定,利用下式计算出酶的活力。

酶活力(单位)=■OD510×1000
=(OD510反应后-OD510反应前)×1000
1.2.3　酶的动力学性质的测定
1.2.3.1　酶的最适温度的测定
以一定量的磷酸苯二钠为底物,在pH值8.8条件下,加一定量酶液,在不同温度(30、37、42、47、52、57℃)下保温15min进行酶促反应,按上述方法测定酶活力,确定最适温度。

1.2.3.2　酶的最适pH值的测定
以一定量的磷酸苯二钠为底物,改变pH值(8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10)条件下,加一定量酶液37℃保温15min进行酶促反应,按上述方法测定酶活力,确定最适pH值。

1.2.3.3　酶的Km的测定
将底物(磷酸苯二钠)分别稀释成不同的浓度,在pH值8.8,加一定量酶液37℃保温15min 进行酶促反应,按上述方法测定酶在不同底物浓度下的酶活力(即为反应速度),由Lineweaver-Burk作图法求出Km。

2　结果与讨论
2.1　最佳培养工艺条件的确定
2.1.1　最佳培养pH值的确定
在相同体积(100mL)不同pH值的Tris培养液中接入相同量(5mL)的种子液,于37℃振荡培养6h,测酶活力。

结果如表1所示,由表1可知, pH值7.4酶活最高,故最佳培养pH值为7.4。

表1　pH值的影响
pH值6.26.67.07.47.88.28.69.0酶活力132414921618538324
注:37℃振荡培养6h。

2.1.2　最佳培养温度的确定
在相同体积(100mL)pH值均为7.4的Tris 培养液中接入相同量(5mL)的种子液,于不同温度下振荡培养6h,测酶活力。

结果如表2所示,由表2可知,培养温度40℃酶活最高,故最佳培养温度为40℃。

表2　培养温度的影响
温度/℃29333739404145
酶活力3039219364486402159 注:pH值7.4振荡培养6h。

2.1.3　最佳培养时间的确定
在相同体积(100mL)pH值均为7.4的Tris 培养液中接入相同量(5mL)的种子液,于40℃下振荡培养不同时间,测酶活力。

结果如表3所示,由表3可知,培养10h酶活最高,故最佳培养时间为10h。

表3　培养时间的影响
反应时间/h3579101113酶活力78314507577694624525 注:pH值7.4,40℃振荡培养。

2.1.4　最佳培养条件的重复性检验
在40℃,pH值7.4振荡培养时间10h条件下,再重复做3次菌体培养实验。

得表4。

表4　重复性实验
实验序号123
酶活力697697694
由实验结果表4可见,实验重复性好,所以枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件:pH值7.4,40℃振荡培养10h。

2.2　碱性磷酸酶反应动力学特性
2.2.1　底物浓度对酶反应速度影响r max和Km测定
以磷酸苯二钠为底物,在37℃和pH值8.8,按测定酶活力的条件和方法,分别测定底物浓度为2、4、6、8、16、20mmol/L时的酶活力(即为反应速度),得表5,将测定结果分别计算1/r S和1/C S,按Lineweaver-Burk作图法求出Km。

表5　反应速度与底物浓度关系
123456
r s/(mmol/L·min-1)7839778868184 1/r s×1021.282.561.301.141.470.54
C S/(mmol·L-1)24681620
1/C S0.50.250.170.1250.0630.05
利用表5以1/r S为纵坐标,1/C S为横坐标作图,得图1,由图1求出最大反应速度r max和米氏常数Km。

由图1可知:1/r m ax=0.78×10-2,
所以r max=128(m mol/L·min)
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辽 宁 化 工 2004年12月
-1/Km =-0.34,所以Km =2.94(m mol /L
)
图1　酶促反应米氏常数的测定
2.2.2　pH 对r s 的影响
以磷酸苯二钠为底物,在37℃下,测不同pH 值时酶活力,得表6。

表6　pH 值对酶促反应速度的影响
pH 值88.48.89.29.610r S (mmol /L ·min -1)
132
193
283
225
194
173
以pH 为横坐标,r S 为纵坐标作酶的pH -活力曲线图(图2),由图可知pH 对酶活性的影响,
并可确定最适pH 值8.8。

图2　pH 对酶促反应速度的影响
2.2.3　温度对r s 的影响
以磷酸苯二钠为底物,在pH 值8.8条件下,测不同温度酶活力,得表7。

表7　温度对酶促反应速率的影响
温度/℃303742475257r S (mmol /L ·min -1)
104
132
176
220
336
291
利用表7,以温度为横坐标,酶促反应速率为纵坐标作酶的温度-活力曲线图(图3),根据此曲线,可了解温度对酶活力的影响,并确定酶反应的最适温度为52
℃。

图3　温度对酶促反应速率的影响
3　结　论
通过实验数据可得到如下结论:
(1)枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件为40℃,pH 值7.4,10h 。

(2)由碱性磷酸酶催化磷酸苯二钠的水解反应动力学性质实验可知:
①在pH 值8.8,温度37℃条件下测得:
r max ≈128(m mol /L ·min )K m =2.94(m mol /L )
②碱性磷酸酶催化反应的最适pH 值为8.8,
最适温度为52℃。

参考文献
[1]　赵赣,等.鸡肝碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性质的
研究[J ].上海交通大学学报,2003.21(3):194-198[2]　陈定福,等.碱性磷酸酶的动力学研究[J ].水生生物学
报,1995.19(4):338-343
[3]　王加义,等.小儿佝偻病诊断用骨碱性磷酸酶试剂盒研
制[J ].医学研究通讯,1994,23(5):34-36
[4]　李兴暖,等.长牡蛎碱性磷酸酶的分离纯化及其部分性
质研究[J ].台湾海峡,2003.22(4):483-486
[5]　陈毓全,等.生物化学实验方法和技术[M ].北京:科学
出版社,2002.69-87
[6]　程国华.生物化学实验技术[M ].沈阳:沈阳农业大
学,1998.36-46
(下转第710页)
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第33卷第12期 丁　琳,等:枯草杆菌碱性磷酸酶制备的最佳工艺条件及酶促反应动力学性质的研究
本装置共有4台改质沥青反应釜,正常生产时,每2台反应釜为一系,各处理一半中温沥青。

2　主要工艺参数及产品质量
2.1　本钢焦化厂采用釜式加热热缩聚法生产改
质沥青
其主要工艺参数如下:
反应釜操作温度350～400℃;反应釜操作压力:常压;沥青在釜内反应时间6～12h ;加热炉操作温度650～850℃;改质沥青放料温度>210℃;中温沥青进釜温度330～370℃。

2.2　按以上操作条件生产出的改质沥青的质量
见表1。

表1　改质后沥青的质量指标
改质沥青一级二级软化点/℃100～115100～120甲苯不溶物/%28～34>26喹啉不溶物/%8～146～15β树脂/%≥
1816
灰份/%≤0.30.3结焦值/%≥5450水份/%≤
5.0
5.0
3　工艺特点
(1)采用热缩聚法生产改质沥青,不需要加其它化学试剂,反应釜中也不需要通入蒸汽和压
缩空气,操作简单、可靠。

(2)反应釜内设搅拌装置,使产品质量均匀稳定,不结焦,不堵塞,设备维修量小。

(3)本工艺仅原有沥青池排出一部分浊循环水,无其它废水、废渣产生。

生产过程中产生的废气将集中到烟气洗净装置,净化后排放,达到环保要求。

4　结　语
改质沥青从沥青自身性能上解决了普通中温
沥青的缺点,是较理想的炭素电极粘结剂。

改质沥青加温处理后的析焦量比中温沥青较高,促进了沥青的强固、致密的作用。

因此,广泛应用于冶金、化工生产中。

参考文献
[1]　库咸熙.炼焦化学产品回收与加工.冶金工业出版社,
1985
[2]　鞍山焦耐院.本钢焦化厂改质沥青的设计,2002
Production of Modified Asphalt
LI Lin
A bstract :The production of modified asphalt by a modifying process of heat polycondensation from asphalt with medium softening point
was introduced .The modified asphalt had a higher softening point ,β-resin content and coking value .the characteristics of the process ,main technological parameters and product qualit y were also introduced .Key words :Modified asphalt ;Heat polycondensation ;Softening point ;β-Resin
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Study on Preparation and Kinetic Properties of
Alkaline Phosphatase from Bacillus Subtilis
DING Lin ,W ANG H ong -xin
(Shenyang Institute of Chemical Technology ,Shenyang 110142,China )
A bstract :The preparation of alkaline phosphatase (AKP )from bacillus subtilis was introduced in this paper ,the culturing optimum tech -nological condition was studied ,and its kinetic properties was examined .The results showed that the optimal shake -flask cultivation
condition was as follow :the culturing pH value was 7.4,the culturing temperature was 40℃,the culturing time was 10h .The optimum temperature of the enzyme for the hydrolysis of disodium phen yl p hosphate was at 52℃,and its optimum pH value was 8.8.At pH 8.8,37℃,the Michaelis -Menten constant (KM )was 2.94mmol /L (on the dis odium phen yl phasphate ).Key words :Bacillus subtilis ;Alkaline phosphatase ;Kinetics of enzyme -catalyzed reaction
710 辽 宁 化 工 2004年12月。