Box-Behnken响应面优化冷榨花生粕酶解制备花生肽工艺

Box-Behnken响应面优化冷榨花生粕酶解制备花生肽工艺肖怀秋;李玉珍;林亲录;杨涛;邓靖;龚春平
【摘要】在单因素试验基础上应用Box-Behnken响应面优化技术对中性蛋白酶酶解冷榨花生粕蛋白质制备活性多肽工艺进行了响应面优化分析,建立了酶促水解二阶多项式非线性回归方程和数值模型并分析了酶解时间X1、酶添加量X2、酶解pH X3以及底物浓度X4对多肽制备的影响规律.响应面优化方案为酶解时间200 min,酶添加量0.081 g/mL,酶解pH 10.0和底物质量浓度0.083 g/mL.优化条件下验证试验结果为(0.135 6±0.001 4)％,与模型预测值0.137 7％接近,偏差为
1.55％.研究表明,单因素试验与响应面优化联用可应用于冷榨花生粕酶促水解制备活性多肽工艺的优化分析.
【期刊名称】《中国粮油学报》
【年(卷),期】2014(029)010
【总页数】7页(P106-111,117)
【关键词】冷榨花生粕;多肽;酶促水解;Box-Behnken设计;响应面优化
【作者】肖怀秋;李玉珍;林亲录;杨涛;邓靖;龚春平
【作者单位】湖南化工职业技术学院制药与生物工程系,株洲412004;湖南化工职业技术学院制药与生物工程系,株洲412004;中南林业科技大学食品科学与工程学院,长沙410004;中南林业科技大学食品科学与工程学院,长沙410004;湖南工业大学包装与材料工程学院,株洲412000;广东佛山南海宏仁食品有限公司,佛山528000
【正文语种】中文
【中图分类】TS229
花生是我国重要的油料与经济作物［1］，其加工和综合利用主要途径是榨取食用油脂，每年产生花生粕约150多万t［2］。

传统热榨法产生的花生粕由于高温蒸
炒和压榨使蛋白质变性严重，有效氨基酸破坏明显，蛋白质溶解度差，无法直接应用于食品工业，主要用作畜禽或鱼类饲料或肥料［3］，而且经高温热变性后，蛋白质的营养与生物学价值下降明显，对精深加工产生了极大的限制。

低温冷榨法由于采取低温（＜60℃）机械压榨技术对去红衣花生仁进行压榨，在实现花生油和
花生蛋白分离的同时，能较好地保持花生粕蛋白的低变性，因而能最大程度地保持花生粕蛋白质的营养价值［3］。

在花生粕中含约47%～55%的蛋白质、氨基酸配比合理，且富含人体必需氨基酸［4］，但缺乏相应的精深加工配套技术，造成了花生粕优质蛋白质资源的严重浪费［5-6］。

因此，加强低温冷榨花生粕蛋白质的精深加工具有很好社会和经济意义。

蛋白质经酶促水解产生的小分子蛋白质、多肽及氨基酸，特别是分子多肽比蛋白质营养价值更好，生物吸收利用率比氨基酸更高，可直接为小肠黏膜吸收利用［7］，且蛋白质酶促水解产物具有如抗氧化、抗菌、降血压、免疫调节、抗血栓形成以及抗菌等多种生物学活性［8-10］。

由于酶促水解反应为非线性复杂体系，认识酶
解影响因素对酶解过程的作用规律对于控制限制性酶促水解反应和保障产物特异性是极其重要的。

响应面优化技术相比传统正交优化方法更适合于多变量复杂体系的优化分析且可充分考虑因素间交互作用对响应变量的影响，通过构建经验数值模型并经过回归分析和方差分析可用于寻找最优参数组合和评价复杂体系中各因素的影响重要性［11］。

Box-Behnken设计是最有效的响应面优化方法之一，在酶促水
解制备活性多肽方面应用较为广泛［12］。

本试验在单因素试验的基础上，利用响应面优化分析方法以多肽含量为综合评价指标对冷榨花生粕酶促制备多肽工艺进行了优化分析，以期为冷榨花生粕蛋白质制备花生多肽的精深加工提供技术支持。

1 材料与方法
1.1 试验材料
低温冷榨花生粕：德州宏鑫花生蛋白食品有限公司；中性蛋白酶：北京鸿润宝顺科技有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 试验仪器与设备
Labconco冷冻干燥仪：美国Labconco公司；722型可见分光光度计：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；pHS-3CpH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 试验方法
1.3.1 冷榨花生粕蛋白质提取工艺
低温冷榨花生粕→烘干→粉碎→碱溶2次（1 mol／L NaOH调 pH 8.5，料液比1∶15，50℃，2 h）→离心（4 000 r／min，15 min）→上清液酸沉（3 mol／L 柠檬酸调pH 4.5左右，室温静置30 min）→离心（4 000 r／min，15 min）→收集蛋白凝块→醇洗2次→加碱调整pH 6.5→真空冷冻干燥→花生粕蛋白粉
1.3.2 花生粕蛋白粉的酶促水解工艺
准确称取一定量花生粕蛋白粉于反应器中，根据固液比要求添加适量蒸馏水搅拌至分散均匀，酶促水解前超声波预处理10 min并于90℃预热10 min，冷却至室温后调整到预设pH值，根据［E］／［S］准确称取中性蛋白酶添加到酶解反应系统中，缓慢搅拌并维持酶解系统pH恒定。

酶解结束后迅速置于沸水浴中灭酶10 min。

冷却至室温后4 000 r／min离心10 min，收集上清液。

1.3.3 多肽测定
参考白永莲等［13］报道方法，略有改动。

精密移取酶解液1 mL，加入双缩脲试剂4 mL作为测定管；精密量取7%标准蛋白0.05 mL加0.9%NaCl 0.95 mL，再加4 mL双缩脲试剂作为标准管；精密移取0.9%NaCl溶液1 mL加双缩脲试剂4 mL作为空白管，分别于525 nm波长处测定吸光值。

多肽含量计算公式：多肽含量＝［（A测 -A空）／（A标 -A空）］×7%×0.05。

1.3.4 酶促水解制备花生粕多肽工艺优化
1.3.4.1 单因素试验
考察酶解 pH（4.0～10.0）、酶添加量（0.01～0.09 g／mL）、酶解时间（30～420 min）和底物浓度（0.01～0.13 g／mL）4个因素对酶解的影响，以产物中多肽含量为评价指标。

1.3.4.2 Box-Behnken响应面优化
在单因素试验结果基础上确定Box-Behnken响应面优化试验设计中心点。

试验因素及编码见表1。

表1 试验因素水平和编码注：xi＝（Xi-X0）／Δx（xi为自变量编码值，Xi为自变量真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，Δx为自变量的变化步长，i＝1，2，3。

xi水平酶解时间X1／min酶添加量X2／g／mL酶解pH X3底物浓度X4／g／mL-1 150 0.05 6 0.07 0 180 0.07 8 0.09 210 0.09 10 0.11 1
2 结果与分析
2.1 单因素试验
考察了酶解pH、酶添加量、酶解时间和底物浓度对酶促制备多肽的影响，结果如图1所示。

图1 酶解pH、酶添加量、酶解时间和底物浓度对多肽含量的影响
由图1a可以看出，在pH 4.0～8.0区间内随着酶解pH的增加，酶解产物中多肽
呈递增趋势，pH 8.0时酶解产物中多肽含量最高［（0.048±0.001 9）mg／mL］，当pH再增加时酶解产物中多肽含量呈递减态势；由图1b可以看出，在1%～7%g区间内随着酶添加量的增加，酶解产物中多肽呈递增趋势，最佳添加量为0.07 g／mL［（0.043±0.001 3）mg／mL］，随后呈下降趋势；由图1 c可以看出，酶解最佳时间为180 min。

在酶解时间为30～180 min区间内，随着酶解时间延长，酶解液中多肽含量呈上升态势。

酶解时间为180 min时多肽含量达到最高［（0.051±0.001 1）mg／mL］，随后呈下降趋势；由图1d可以看出，底物质量浓度为0.01～0.09 g／mL区间内，多肽含量随底物浓度的增加而增加，随后呈下降趋势，最佳底物浓度为0.09 g／mL［（0.026±0.001 2］mg／mL。

2.2 酶促水解参数的响应面优化
探讨了酶解时间X1、酶添加量X2、酶解pH X3和底物浓度X4对多肽制备的影响，结果如表2（含模型预测值）。

表2 酶解参数响应面优化设计与结果（含模型预测值）序号X1 X2 X3 X4酶解液中多肽含量／mg／mL 序酶解液中多肽含量／mg／mL实测值预测值号X1 X2 X3 X4实测值预测值1 0 0 1-1 0.093 2 0.094 16-1 0 0-1 0.055 4 0.057 2 0 0 0 0 0.120 6 0.110 17-1 1 0 0 0.101 3 0.100 3 1-1 0 0 0.041 8 0.046 18 0-1-1 0 0.068 2 0.070 4-1 0 0 1 0.078 1 0.091 19 0 0 1 1 0.078 1 0.078 5 0 0 0 0 0.112 1 0.110 20 0 0 0 0 0.112 1 0.110 6 0 0 0 0 0.114 8 0.110 21-1-1 0 0 0.045 9 0.046 7 1 1 0 0 0.102 5 0.110 22 0 0 0 0 0.103 6 0.110 8 0-1 0-1 0.057 8 0.060 23 1 0 0 1 0.037 8 0.044 9 0 1 0-1 0.101 8 0.096 24 0 1 0 1 0.120 9 0.110 10 0 1 1 0 0.107 1 0.110 25 1 0-1 0 0.107 1 0.098 11 0 1-1 0 0.126 1 0.130 26-1 0-1 0 0.126 1 0.110 12 0-1 0 1 0.029 5 0.022 27 0 0-1 1 0.090 5 0.095 13 1 0 1 0 0.103 1 0.100 28 0 0-1-1 0.103 1 0.110 14 0 0 0 0 0.118 6 0.110 29-1 0 1 0 0.084 2 0.080 15 0-1 1 0 0.059 3 0.059 30 1 0 0-1
0.113 0 0.110
2.2.1 响应面模型构建序贯分析
基于方差分析和回归分析对响应面模型的构建进行序贯分析［2］，结果如表3所示。

模型序贯分析发现，一阶线性回归模型显著性分析为极显著（P＜0.001），
失拟项极显著（P＝0.003 1＜0.01）。

失拟项显著表明，若用此模型进行结果预测，出现失误的概率比较大，需用更高阶数值模型进行数据拟合［11］；二因素
交互关系模型失拟项也极显著（P＝0.003 3＜0.05），也不适宜对数据进行数值
模拟。

二阶模型显著性分析为极显著（P＜0.000 1），R2＝0.949 0，Adj.R2＝0.901 3，失拟项不显著（P＝0.129 9＞0.05），表明用此二阶模型进行数值拟合是合理的，无需再用更高阶模型。

序贯分析还发现，三阶模型显著性分析不显著（P＝0.761 6＞0.05），但由于拟合回归方程相对较为复杂，实际应用并不方便，因此，选择二阶模型对表2数据进行回归拟合。

表3 响应面模型构建序贯分析注：**表示极显著（P＜0.01）；*表示显著（P＜0.05）；ns表示不显著（P＞0.05），余同。

项目自由度平方和均方和 F值一阶线性模型20 0.011 5.667E-004二因素交互关系模型 14 7.982E-003 5.702E-004 15.84二阶模型 10 1.024E-003 1.024E-004 2.85三阶模型 2 5.388E-004 2.694E-004 7.49纯误差 5 1.799E-004 3.599E-005项目 P值R2 Adj·R2 失拟项P值一阶线性模型 0.000 9**0.512 1 0.434 1 0.003 1**二因素交互关系模型
0.304 3ns 0.654 1 0.472 1 0.003 3**二阶模型＜0.000 1**0.949 0 0.901 3
0.129 9ns三阶模型 0.761 6ns 0.969 5 0.873 8 0.873 8ns
2.2.2 数值模型的拟合与模型回归分析
表4 回归模型方差分析表?
对表2数据进行回归拟合可得方程，即y＝0．113 633+0．001 192x1+0．029 767x2-0．008 01x3-0．007 45x4+0．001 325x1 x2+0．009 475 x1 x3-
0．024 48x1 x4-0．002 53x2 x3+0．011 85x2 x4-0．000 63x3 x4-0．016 94x12-0．021 2x22+0．001 783x32-0．021 58x42。

模型方差分析（表4）结果表明，回归模型是极显著的（P＜0.000 1），模型 R2＝0.949 0，说明该模型能够解释94.90%的总变异，仅有5.10%变异无法用该模型解释。

模型确定系数越大表示模型预测值与实测值间拟合越好，该系数必须大于0.80［14］。

模型Adj.R2＝0.901 3表明模型是显著的。

失拟项F值为2.85（P ＝0.129 9＞0.05），表明失拟项不显著，用该模型进行多肽制备预测是切实可行的。

变异系数（CV）是模型精度和可靠性的重要指标，变异系数数值越小表明模型可靠性越好。

本试验模型变异系数（CV）为9.91%，表明模型是高度可靠的。

可靠模型的信躁比（signal to noise ratio，SNR）要求数值要低于4，本模型SNR＝17.793（＞4）表明模型信躁比是合理的。

模型各系数项显著性检验如表5所示。

表5 回归方程系数显著性检验模型中的系数项系数估计值自由度标准误差95%置信度区间低端值95%置信度区间高端值P值常数项0.113 6 1 0.003 7 0.105 8 0.121 4 x1 0.001 2 1 0.002 6-0.004 3 0.006 7 0.651 6ns x2 0.029 8 1 0.002 6 0.024 3 0.035 3＜0.000 1**x3-0.008 0 1 0.002 6-0.013 5-0.002 5 0.007
4**x4-0.007 5 1 0.002 6-0.013 0-0.001 9 0.011 4*x1 x2 0.001 3 1 0.004 5-0.008 2 0.010 9 0.771 5ns x1 x3 0.009 5 1 0.004 5-0.0001 0.019 0 0.051 6ns x1 x4-0.024 5 1 0.004 5-0.034 0-0.014 9＜0.000 1**x2 x3-0.002 6 1 0.004 5-0.012 1 0.007 0 0.581 3ns x2 x4 0.011 9 1 0.004 5 0.002 3 0.021 4 0.018
4*x3 x4-0.000 6 1 0.004 5-0.010 2 0.008 9 0.890 9ns x12-0.016 9 1 0.003 4-0.024 2-0.009 7 0.000 2**x22-0.021 2 1 0.003 4-0.028 5-0.013 9＜0.000
1**x32 0.001 8 1 0.003 4-0.005 5 0.009 1 0.609 8ns x42-0.021 6 1 0.003 4-0.028 9-0.014 3＜0.000 1**
由表5可以看出，一次项x1影响不显著（P＞0．05），x2和 x3影响极显著（P ＜0．01），x4影响显著（P＜0．05）；交互作用项 x1 x2，x1 x3，x2 x3和 x3 x4交互作用不显著（P＞0．05），x1 x4影响极显著（P＜0．01），x2 x4影响显著（P＜0．05）；二次项 x12，x22和x42影响极显著（P＜0．01），x32影响不显著（P＞0．05）。

2.2.3 因素交互作用降维分析
响应面分析中若观察某两个因素同时对响应值的影响可借助降维分析［15］。

等高线图能直观反映因素交互作用对响应值的影响，圆形表示交互作用不显著，椭圆形则表示交互作用显著。

酶解时间X1和底物浓度X4的交互作用对响应值的影响以及酶添加量X2和底物浓度X4的交互作用对响应值的影响如图2所示。

由图2也可以看出，X1 X4交互作用项影响极显著，而X2 X4交互作用项影响显著。

图2 y＝f（X1，X4）和 y＝f（X2，X4）等高线图
2.2.4 响应面优化模型诊断
残差分析是借助图形分析工具并基于模型无法完全解释变异的基础上进行的［15］，可用于响应面优化模型的诊断。

在模型诊断中开展误差方差齐性检验是非常重要的。

如果预测值内部t化残差呈随机散点分布（图3），则残差方差齐性是合符要求的。

此外，残差正态分布也是检验模型准确性的重要工具，如残差呈正态概率分布，则残差拟合曲线呈线性态势（图4）［16-17］。

由图3和图4可以看出，模型预测值内部t化残差呈随机性分布，且为正态独立分布。

图3 预测值内部t化残差分布图
模型预测值与实测值若拟合良好，则数据散点分布且沿模型诊断线呈近似直线分布［3］。

模型预测值与实测值拟合如图5所示。

由图5可看出，模型预测值与实测值拟合度较高，试验误差较小。

微扰曲线（Perturbation plot）可在响应优化曲面特定区域比较各自变量对响应值的影响［11］，如曲线陡直，表明响应值对因
素敏感，如曲线平缓，则表明响应值对因素变化不敏感。

由图6可看出，因素B （酶添加量，X2）对响应值最敏感，因素C（酶解pH，X3）对响应值较为敏感，而A（酶解时间，X1）和 D（底物浓度，X4）对响应值变化不敏感。

因此，因素
B为最重要因素，其影响为正影响［11］。

图4 内部t化残差正态分曲线
图5 模型预测值vs实测值
图6 微扰曲线
2.2.5 模型求解与验证试验
将回归方程分别对各自变量求偏导数并令其等于0可得到四元一次方程组，解逆
矩阵，得到方程组解为 x1＝0．60，x2＝0．56，x3＝0．98和 x4＝-0.37。

经转换可得到因素实际水平为酶解时间198 min，酶添加量0.081 2 g／mL，酶解 pH 9.96和底物浓度0.082 6 g／mL。

为实际操作方便，将优化方案修约为酶解时间200 min，酶添加量0.081 g／mL，pH 10.0和底物质量浓度0.083 g／mL。

优
化条件下验证试验结果为（0.135 6±0.001 4）%（n＝6），与模型预测值0.137 7%接近，偏差为1.55%。

3 讨论与结论
酶促水解前对底物进行超声波预处理可利用超声波空化作用与机械作用断裂蛋白质化学键，改善酶解微环境并提升酶解效率，同时还可改善酶解产物的功能特性［18］。

酶促水解前的热预处理也可以破坏维持蛋白质三级结构的氢键、范德华
力等作用键，有利于蛋白质的酶促水解。

蛋白质酶促水解是一个高度复杂的非线性灰色体系，具有高度的产物多样性与动力学复杂性［8］。

为了对酶解过程进行数值分析并研究各因素对响应值的影响可采取响应面优化分析技术。

本研究在单因素试验基础上运用Box-Behnken响应面优化分析方法对酶促水解制备冷榨花生粕多肽工艺参数进行优化分析并构建了相应的数值模型，同时对模型进行了回归与方差
分析。

响应面优化方案为酶解时间200 min，酶添加量0.081 g／mL，酶解pH 10.0和底物质量浓度0.083 g／mL。

优化条件下验证试验结果为（0.135
6±0.001 4）%，与模型预测值0.137 7%接近，偏差为1.55%。

研究表明，单因
素试验与响应面优化联用可很好应用于冷榨花生粕酶促水解制备活性多肽工艺的优化分析。

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