雷公藤多苷片抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖的谱效分析

CJCM 中医临床研究 2019年第11卷第2期 -1-
雷公藤多苷片抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖的谱效分析Efficacy of tripterygium on mesangial cell in rats
熊智慧
（湖南省中医药大学附属衡阳医院，湖南衡阳，421001）
中图分类号：R285.1文献标识码：A文章编号：1674-7860（2019）02-0001-
【摘要】目的：探究HPLC法分析小鼠肾小球系膜细胞药效毒效的雷公藤多苷片谱效关系，为以后研发新型药物载体、开展高质量的雷公藤多甙片临床应用研究，获得高质量的临床证据，指导临床合理用药，提供理论和实验依据。

方法：选择7个不同厂家生产的雷公藤多苷片作为研究对象，通过HPLC法建立高效液相指纹图谱，对不同厂家生产的雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞增殖抑制的差异展开对比分析。

结果：A厂家生产的雷公藤多苷片药效最强的同时，毒性也最强；B厂家在抗炎效果上不明显，但是毒性明显；G厂家药效不明显，而毒性中等。

结论：积极控制其毒性成分含量，甄别雷公藤多甙片的有效有毒成分，筛选出治疗肾炎蛋白尿的高效无毒或少毒的单体。

【关键词】谱效关系；雷公藤多苷片；指纹图谱；肾小球系膜细胞
【Abstract】Objective: To explore the efficacy of tripterygium by HPLC method on mesangial cell in rats. Methods: Tripterygium of seven different manufacturers was selected. The high performance liquid chromatography of tripterygium was established by HPLC method. The difference of inhibiting effect of different manufacturers on mesangial cell was compared. Results: Tripterygium of A manufacturers shows best efficacy and strongest toxicity. Tripterygium of B manufacturers shows inapparent anti-inflammatory effects and obvious toxicity. Tripterygium of G manufacturers shows inapparent efficacy and moderate toxicity. Conclusion: The content of toxic components of tripterygium should be actively controlled; effective toxic components need to be screened; the highly effective non-toxic or less toxic monomer treated nephritis proteinuria should be screened out.
【Keywords】Spectrum effect relationship; Tripterygium; Fingerprint chromatogram; Mesangial cells
doi:10.3969/j.issn.1674-7860.2019.02.001
雷公藤多苷为卫矛科植物雷公藤的根提取精制而成的一种极性较大的脂溶性成分混合物，其生理活性是由多种成分（雷公藤总萜内酯、雷公藤内酯醇、雷公藤氯内酯醇、雷公藤总甙、生物碱等）协同产生，既保持了雷公藤生药的免疫抑制作用，又去除了许多毒性成分，是目前临床上使用较多的非甾体类免疫抑制剂[1]。

具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤、抗生育、抗菌的作用[2-5]。

其显著疗效已得到普遍认可，并广泛应用于临床许多疾病的治疗中，如肾病、风湿病、皮肤病、甲状腺病、哮喘病、眼科疾病、妇科疾病及器官移植后的治疗等。

但随着雷公藤多甙的广泛应用，其毒副作用也被发现，如对肝肾功能的损害、骨髓抑制、性腺抑制、消化道反应、皮肤黏膜损害等，这些毒副作用一方面限制了该药的应用，另一方面给患者精神上、经济上、身体上带来不利影响[6,7]。

雷公藤属中含有多种成分，目前已报道380余种，主要是生物碱类、二萜类、三萜类、倍半萜类及糖，而且迄今已发现其中约50种成分具有抗肿瘤活性，研究较多的包括二萜类的雷公藤甲素、雷公藤甲素衍生物[如雷公藤乙素、雷公藤氯内酯醇（tripchlorolide）]以及三萜类的雷公藤红素等。

在雷公藤属所有成分中，起药理作用的主要是二萜类成分，其次为生物碱类，但二萜类和生物碱类的毒性也最强。

对雷公藤的毒代动力学进行研究，研究其主要毒效成分，提高主要药效无毒效成分，控制主要药效次毒效的成分，重点控制强效强毒的成分，提高其用药安全是临床
上刻不容缓的措施。

如何对疗效卓著的雷公藤多苷实施减毒，便成为摆在学术界面前的一项重大课题。

雷公藤多苷多成分、多靶点、多途径的作用特点使其毒效机制研究十分复杂。

本课题拟通过体外实验研究雷公藤多苷片高效液相指纹图谱，通过统计学方法建立雷公藤多苷片药效、毒效数据与高效液相指纹图谱色谱峰之间的相互关系，甄别雷公藤多苷片的有效有毒成分，筛选出治疗肾炎蛋白尿的高效无毒或少毒的单体，本文采用小鼠肾小球系膜细胞考察雷公藤的肾脏体外细胞毒性评价各分离活性成分的毒性，筛选出主要药效成分和毒性成分的最佳含量。

推测其化学成分比例变化与雷公藤多甙减毒增效的关系。

为寻找科学合理的药效评价指标、质控指标以及为临床合理用药提供科学依据。

1资料与方法
1.1 雷公藤多苷片指纹图谱的建立
1.1.1 仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪（型号：Agilent1200）；分析天平（生产厂家：上海梅特勒-脱离仪器有限公司，型号：AL204）；双光束紫外可见分光光度计（生产厂家：北京普析通用仪器有限责任公司，型号：TU-1901）；超声波清洗器（生产厂家：上海超声波仪器有限公司，型号：KQ-800KDE）；中性氧化铝柱；色谱柱。

试验中所需试药如表1所示。

Clinical Journal of Chinese Medicine 2019 V ol.(11) No.2 -2-
表1实验所需试药生产厂家及其生产批号
试药名称生产批号生产厂家剂量乙晴美国Sigma公司
甲醇美国Sigma公司
乙酸乙酯上海联试化工试剂有限公司
雷公藤甲素14032718南京泽朗医药科技有限公司20 mg
雷公藤内酯酮14022521上海同田生物技术有限公司10 mg
雷公藤次碱14082933上海同田生物技术有限公司10 mg
雷公藤多苷片（A厂家）20120802湖南某药业公司
雷公藤多苷片（B厂家）20120901湖北某制药有限公司
雷公藤多苷片（C厂家）120905福建某生物药业有限公司
雷公藤多苷片（D厂家）120601上海某药业有限公司
雷公藤多苷片（E厂家）120502浙江某天然药物有限公司
雷公藤多苷片（F厂家）120917江苏某制药有限公司
雷公藤多苷片（G厂家）121202安徽某药业有限公司
1.1.2 制备供试品溶液
将适量的雷公藤多苷片研磨成粉末状，择取0.2 g，与
30 mL的乙酸乙酯融合，超声处理10 min，待凉后，过滤，
择15 L的滤液，纯化处置。

事先选择2倍柱体积对氧化铝柱
活化处置。

滤液经过柱后，将流出液采集，然后适应乙酸乙
酯2倍柱体积进行洗脱，洗脱出之后，对洗脱液进行采集，
将洗脱液和流出液合并，使用氮气吹干，剩余的残渣使用含
量为2 mL的甲醇进行溶解，在经过0.22 μm的滤膜后，便可
以获取[8-10]。

制备对照品溶液：选取雷公藤内脂酮、雷公藤次碱、雷公
藤甲素各适量，置于容量为10 mL的容量瓶中，将甲醇溶液
置入其中，然后稀释到固定的刻度值，便可以获取[11]。

1.2 雷公藤多昔片药效毒效及谱效关系试验
1.2.1 仪器与材料
仪器：试验研究所需仪器如表2所示。

材料：试验研究所
需材料如表3所示。

表2实验所需仪器生产厂家及其型号
仪器名称型号生产厂家
培养箱MCO-20AIC日本三洋公司
生物安全柜BSC-1360IIA2哈尔滨市东联电子技术开发有限
公司
酶联免疫检测仪Model680BIO-RAD公司
倒置显微镜AFX-DX日本Nikon公司
表3实验所需材料生产厂家及其生产批号
材料名称生产批号生产厂家
CCK-8试剂盒00121352上海诩圣生物科技有
限公司
DMSO国药集团化学试剂有
限公司
小鼠（雄性）SCXK（沪）2012-00020南京军区福州总医院1.2.2 样品制备
以“1.1.2”中的方法为依据制备雷公藤多苷片提取物，择取DMSO适量，并置入提取物中与其混匀，便可获取样品的母液。

选择相同比例的血清培养基和母液进行稀释，便可以得到实验所需的样品[12]。

1.2.3 雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞的增殖的抑制作用
对小鼠肾小球系膜细胞进行常规培养，将细胞的浓度控制为1×104 cells·mL-1，将100 μL的细胞悬液置于96孔细胞培养板中，将其放置在温度为37 ℃，含量为5%CO2的培养箱中24小时，然后换液给药。

（1）实验组：将浓度不同的药物10 mL置入。

（2）对照组：将10 μL DMSO无血清DMEM 培养基置入。

然后设置空白的对照组。

每一组设6个复孔，将其放置在温度为37 ℃，含量为5%CO2的培养箱中48小时，进行培养，在实验结束前4小时，将CCK-8试剂10 μL置入，实验结束后，在450 mm处使用酶标仪进行吸收度检测[13]。

2结果
2.1 7个厂家雷公藤多昔片的HPLC指纹图谱
在7个厂家的指纹图谱中，共选择和筛选出特征色谱峰18个，通过采取积累分析、相似度分析、主成分分析的方法对18个特征色谱峰面积进行分析后发现，5、6、7、9、10、15、18号峰是对7个厂家的雷公藤多苷片进行区分的主要特征峰，如图1所示。

2.2 雷公藤多苷片对肾小球系膜细胞增殖抑制毒效谱效分析
以偏最小二乘回归法分析雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用，发现在0.52～8.5 μg·mL-1内，7个厂家的雷公藤多苷片均具有抑制肾小球系膜细胞增殖的作用，且抑制水平随着药物浓度的升高而提升，在4.25～8.5 μg·mL-1浓度内，7个厂家的抑制率均超过50%
，随着药物浓度降图1 7个厂家雷公藤多苷片HPLC指纹图谱
CJCM 中医临床研究 2019年第11卷第2期 -3-
低，抑制率降低，其中B、F厂家降低幅度更大，在浓度为2.13 μg·mL-1时显著低于其他厂家；0.52 μg·mL-1由B、D、E 厂家的雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞增殖抑制率在10%以下，A、C厂家仍高于40%，详见表4。

表4雷公藤多苷片抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖的谱效分析
药物浓度（μg·mL-1）A B C D E F G
8.587.1±3.089.0±2.388.0±2.583.3±3.490.6±2.489.2±2.387.4±2.6
4.2586.5±2.160.4±3.182.6±3.582.6±2.687.1±2.65
5.1±2.28
6.7±1.7
2.128
3.3±2.22
4.2±2.380.4±3.168.7±4.858.2±4.238.2±3.469.4±2.9
1.0569.6±
2.317.3±4.651.3±
3.49.9±2.711.6±3.230.8±3.05
4.5±2.7
0.5245.5±2.89.4±3.440.7±1.97.4±1.29.0±1.128.1±1.718.0±3.0
进一步分析发现，7个厂家雷公藤多苷片IC50值存在较大差异，其中F厂家的水平最高，为5.83 μg·mL-1，说明F 厂家雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞毒性最小，由于抑制肾小球系膜细胞增殖可以延缓肾小球硬化，因此F厂家对肾小球肾炎的疗效剂量要求越大，疗效最小；A、C厂家IC50值较小，低于1 μg·ml-1，说明A、C厂家对小鼠肾小球系膜细胞毒性强，所以疗效较大。

各个厂家IC50的排列顺序如下：
F＞B＞D＞E＞G＞C＞A。

详见表5。

2.3 雷公藤多苷各成分的毒效谱效关系分析
采用偏最小二乘回归分析法分析后发现，由于IC50值与毒效之间存在着负相关的关系，即IC50值越大，就意味着雷公藤多苷片对小鼠肾小球系膜细胞所产生的毒性越小，因此与毒性相关的峰应当是回归系数为负的峰，l、2、6、7、17、18号峰为主要毒效峰。

详见表6。

表5各个厂家雷公藤多苷片IC50值
厂家A B C D E F G
IC50（μg·mL-1）0.47 3.960.80 2.08 1.94 5.83 1.04
表6雷公藤多苷片抑制小鼠肾小球系膜细胞增殖的谱效分析
峰号123456789101112131415161718系数-0.38-0.470.180.100.14-0.38-0.16-0.020.110.120.190.440.07-0.010.060.18-0.28-0.30
3讨论
雷公藤多苷作为一种免疫抑制剂，目前已广泛用于慢性肾小球肾炎、过敏性紫癜性肾炎和狼疮性肾炎等多种原发性和继发性肾小球疾病，可有效减少蛋白尿的排出。

但长期应用存在明显的毒副作用，对消化系统、泌尿系统、生殖系统及血液系统均有不同程度的毒性。

针对雷公藤制剂及饮片的毒性，很多学者在剂量、用法、配伍、炮制等方面的减毒及防毒效果上进行了研究与探索，以求在保证疗效的同时降低其毒性，提高雷公藤临床应用的安全性。

雷公藤的毒性多数是可逆的，停药后可恢复，其毒性在一定程度上限制了患者的用药。

所以临床上迫切需要能拮抗其毒性的方法。

而在此次实验研究中，笔者通过对不同厂家的对肾小球系膜细胞药效及毒效差异，结合雷公藤多苷片高效液相指纹图谱进行分析，通过统计学方法建立雷公藤多苷片药效、毒效数据与高效液相指纹图谱色谱峰之间的相互关系，筛选出主要药效成分和毒性成分，甄别雷公藤多苷片的有效有毒成分，筛选出治疗肾炎蛋白尿的高效无毒或少毒的单体。

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作者简介：
熊智慧（1983－），女，湖南益阳人，博士，主治医师，研究方向为肾病方向。

编辑：田杏茹编号：ER-4180702001（修回：2019-01-12）。