东方百合病毒检测与茎尖超低温脱毒研究

东方百合病毒检测与茎尖超低温脱毒研究本研究以东方百合(oriental lily)两个品种索邦(Sorbonne)和西伯利亚(Siberia)为材料,进行东方百合病毒检测及茎尖超低温脱毒的研究。

主要研究内容为:东方百合离体再生体系的建立;东方百合病毒检测;茎尖超低温脱毒体系的建立;茎尖超低温脱毒及其效果检测;超低温脱毒后再生苗的遗传稳定性检测。

主要研究结果如下:1.东方百合离体再生体系的建立。

以东方百合两个品种索邦和西伯利亚的鳞片为材料,对其不定芽分化、增殖、生根结鳞茎和移栽等方面进行了研究,结果表明:索邦在MS+1.0mg/LBA+0.5mg/LNAA的培养基上不定芽分化系数最高,达到7.32 ,在
MS+0.5mg/LBA+0.3mg/LNAA+0.5mg/LIAA+0.05mg/LKT的培养基上增殖系数最高,达到3.59;而西伯利亚在MS+1.0mg/LBA+0.3mg/LNAA的培养基上不定芽分化系数最高,达到7.11,在MS+0.5mg/LBA+0.1mg/LNAA+0.3mg/LIAA+0.2mg/LKT的培养基上增殖系数最高,达到3.74。

适合东方百合不定芽生根结鳞茎的最佳培养基为:1/2MS+0.3 mg/LNAA+90 g/L蔗糖,此时的生根率为100%,鳞茎直径大小也在1.20-1.25cm左右。

珍珠岩:沙子:泥炭土(2:1:1)最适宜东方百合移栽,成活率达93.33%。

2.东方百合病毒检测。

以东方百合组培苗叶片为材料,对三种常见病毒:黄瓜花叶病毒(CMV)、百合斑驳病毒(LMOV)和百合无症病毒(LSV)进行检测,结果表明:通过多重RT-PCR检测,两种百合均带有LMOV和LSV,未检测到CMV。

通过同源关系鉴定可知,LMOV和LSV与国内外其它百合病毒的序列同源性相当高,都达到了97%以上,且LSV更是高达100%,因此具有高度的保守性,且地域差异不显著。

3.东方百合茎尖超低温脱毒体系的建立。

以东方百合索邦茎尖为材料,对影响超低温处理过程中茎尖成活率的几个主要因素进行研究,结果表明:预培养1d,蔗糖浓度为0.5mol/L,装载30min,PVS2
液处理60min组合时茎尖成活率最高,可达54.25%。

同时还比较了其它因子如:组培苗的培养时间、茎尖大小、液氮处理时间、化冻方式对成活率的影响,结果表明:培养20d左右的百合苗作为茎尖切取的材料、切取的茎尖带2-3个叶原基、液氮处理24h以及40℃水浴化冻后的茎尖成活率是比较高的。

另外,结合不同阶段茎尖石蜡切片观察,初步探明了超低温技术的脱毒机理。

4.茎尖超低温脱毒及其效果检测。

以同时带有LSV和LM0V的索邦百合和西伯利亚百合组培苗为材料,以百合茎尖长度<0.3mm、0.3-0.5mm、0.5-0.8mm、0.8-1.0mm、1.0-2.0mm对超低温处理后成活率及脱毒率的影响进行了研究,结果表明:综合考虑成活率和脱毒率的前提下,我们采用0.5-0.8mm范围内的茎尖作为脱毒材料,此时的脱毒率为:索邦43.33%、西伯利亚40%,成活率为50%。

这样既保证了较高的成活率又保证了较高的脱毒率,符合大规模生产的需要。

5.东方百合超低温脱毒后再生苗的RAPD遗传稳定性检测。

试验应用筛选出的10条引物,对随机选取的10株东方百合超低温脱毒再生苗基因组DNA进行扩增,结果表明:超低温脱毒的体细胞无性系遗传稳定性基本得到保持,但也存在小量变异。

其中,索邦百合RAPD图谱中的条带与对照苗没有差异,而西伯利亚百合脱毒前后存在一些差异,变异率为1.6%。

变异产生的原因可能与品种有关,也可能是由于低温胁迫而造成的。

总之,本研究建立了东方百合离体再生体系;应用多重RT-PCR技术检测百合
病毒;首次将茎尖超低温脱毒用于东方百合,摸索并建立了脱毒技术体系;通过再生苗的脱毒率检测,证明了超低温脱毒的可行性;采用RAPD技术分析了东方百合病毒苗与超低温脱毒后的再生苗的遗传稳定性,对东方百合离体快繁、病毒检测及脱毒都具有重要意义。