不同存储时间对红细胞血红蛋白再释放的影响

不同存储时间对红细胞血红蛋白再释放的影响
李姝;张丽华;袁海清;杨丽丽;宋芳;李旭妍;孙明玥;黄世琪;苏燕
【摘要】目的:观察不同存储时间对红细胞(red blood cells,RBCs)血红蛋白(hemoglobin,Hb)再释放的影响.方法:募集健康成人志愿献血者,分别采集200 mL 全血,滤白后离心去除血浆,将RBCs重悬于50 mL红细胞保护液(MAP)中,4℃保存.于储存期0d、7d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d抽取血样5 mL,分别检测红细胞Hb再释放、RBCs形态、聚集指数、相对溶血率、上清丙二醛(MDA)含量及高铁血红蛋白分数(FMetHb).结果:随着存储时间延长,红细胞Hb再释放增多,同时伴随RBCs相对溶血率、MDA含量、FMetHb、变形RBCs、RBCs聚集指数的逐渐增高.结论:RBCs存储损伤可以导致Hb再释放增多.
【期刊名称】《包头医学院学报》
【年(卷),期】2018(034)004
【总页数】3页(P89-90,93)
【关键词】红细胞(RBCs);血液存储;血红蛋白释放试验(HRT)
【作者】李姝;张丽华;袁海清;杨丽丽;宋芳;李旭妍;孙明玥;黄世琪;苏燕
【作者单位】内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;包头市中心血站;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古
包头014060;内蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060;内
蒙古科技大学包头医学院血液保护研究所,内蒙古包头014060
【正文语种】中文
体外存储的红细胞(red blood cells，RBCs)是临床输血的主要来源，随血液存储
时间延长，RBCs会发生一系列形态、功能、生物化学等方面的变化，即RBCs存储损伤[1]。

近年来，已经对存储过程中RBCs形态[2]、代谢情况[3]、携氧能力[4]、免疫功能[5]等进行了较为全面且深入的研究。

红细胞血红蛋白释放试验(hemoglobin release test，HRT)是本研究室建立的活态RBCs淀粉-琼脂糖混合凝胶电泳技术，用于观察Hb在电泳过程中的释放情况，以说明Hb在RBCs内的存在状态。

本研究拟通过HRT观察不同存储期RBCs内Hb再释放量，研究RBCs 存储损伤与Hb再释放之间的关系，为进一步阐明RBCs存储损伤的机制奠定理论基础。

1 材料与方法
1.1 样品来源与制备本研究得到包头医学院伦理委员会审核批准，依据实验要求
招募19～21岁健康志愿献血者11名，志愿者艾滋病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、
梅毒螺旋体检测阴性，并在献血前签署知情同意书。

分别采集全血200 mL，滤白器滤白后，低温离心去除血浆，重悬于50 mL红细胞保护液(MAP)中，4 ℃保存。

1.2 试剂与仪器丙二醛(MDA)检测试剂盒(A003-1，南京建成生物工程研究所)；
瑞氏-姬姆萨染色液(珠海贝索生物技术有限公司)；一次性使用去白细胞采输血器(四川南格尔生物科技有限公司)；离心机(Centrifuge 5424，德国eppendorf)；
酶标仪(Thermo scientific，3001型)；血气分析仪(雷度ABL90)；全自动血流变
仪(普利生LBY-N6C)；全血细胞分析仪(sysmex800i)。

1.3 方法于储存期0 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d，轻轻混匀血袋中的悬液，从血袋小辫端无菌抽取RBCs悬液5 mL(取血前弃小辫中RBCs悬液)，
热和封闭血袋接口后，分别进行以下指标的检测。

1.3.1 红细胞Hb释放试验将RBCs悬液离心去除上清后置于2个新EP管中，一
份RBCs中加入等体积的生理盐水制备成RBCs悬液；另一份加入等体积生理盐水和1/2体积的四氯化碳漩涡震荡后，10 000 rpm离心10 min，上清液即溶血液。

按照文献[6]方法制备淀粉-琼脂糖混合凝胶板；将10 μL红细胞悬液借助2
mm×10 mm的滤纸条加入凝胶板阴极侧(距边缘2～3 cm)，120 V恒压电泳55 min，停电5 min后，继续电泳60 min，共2 h；泳毕以氨基黑10B染液染色4 h，5 %冰醋酸溶液反复漂洗至背景无色，观察结果，拍照留图。

利用ImageJ软
件做区带灰度分析。

1.3.2 RBCs相对溶血率检测取RBCs悬液1 mL，室温3 000 rpm离心5 min，
取上清200 μL，适当稀释后取200 μL加入96孔板(加3个复孔)，利用多功能酶标仪检测溶液在540 nm处的吸光度值。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量的测定按照丙二醛试剂盒的说明处理和检测样本，计算MDA的含量。

1.3.4 高铁血红蛋白分数(FMetHb)的检测利用雷度ABL90血气分析仪进行测定。

1.3.5 RBCs形态的检测取50 μL充分混匀的RBCs悬液手工推制血涂片，然后用
瑞氏-姬姆萨染色液进行染色。

100倍显微镜下观察RBCs，拍照留图并计数1 000个RBCs中变形RBCs的个数。

1.3.6 血液流变学检测利用普利生LBY-N6C型全自动血流变仪检测RBCs聚集性。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件，计量数据以(均数±标准差)表示，组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 Hb再释放的检测随着RBCs存储时间延长，Hb再释放增加。

0 d Hb再释放量为(0.43±0.01)，与0 d相比，14 d为(0.55± 0.03)、28 d为(0.62±0.02)、42 d为(0.62±0.14)，Hb再释放明显增加(P<0.05)；与14 d相比，28 d再释放明显增加(P<0.05)；但到存储后期，42 d的再释放增加并不显著(P>0.05)。

见图1。

图1 不同存储时间红细胞血红蛋白再释放电泳图
2.2 FMetHb、MDA含量、相对溶血率的检测随着RBCs存储时间延长，FMetHb和MDA含量不断增加。

与0 d相比，从7 d开始，FMetHb浓度不断增加(P<0.05)；从21 d开始，MDA含量增加(P<0.05)。

在存储过程中，细胞膜不断被破坏，RBCs相对溶血率不断增加，与0 d、7 d相比，从28 d开始，RBCs相对溶血率增加(P<0.05)。

见表1。

表1 不同存储时间FMetHb、MDA、相对溶血率的变化(n=11)时间
(d)FMetHb(%)MDA(nmol/mL)相对溶血率
00．436±0．1033．09±0．250．0079±0．001570．573±0．110a3．26±0．430．0083±0．0020140．718±0．117ab3．02±0．480．0108±0．0029 210．927±0．110abc3．94±0．73ab0．0126±0．0028281．018±0．125a bc4．44±0．45abcd0．0173±0．0030ab351．013±0．146abc5．03±0．8 0abcde0．0239±0．0021abcde421．157±0．127abcdef6．54±1．11abcd ef0．0439±0．0100abcd
a为与0 d相比，P<0.05；b为与7 d相比，P<0.05；c为与14 d相比，
P<0.05；d为与21 d相比，P<0.05；e为与28 d相比，P<0.05；f为与35 d 相比，P<0.05
2.3 RBCs形态与聚集指数的检测在RBCs存储期间，0 d和7 d RBCs形态大多数呈双凹圆盘状，从14 d开始，棘形RBCs开始增多，分别与0 d相比明显增多(P<0.05)；且随着存储时间延长，棘形和球形RBCs个数不断增加，同时RBC聚
集指数从21 d开始增加(P<0.05)。

见图2、表2。

图2 不同存储时间RBCs形态变化表2 不同存储时间变形RBCs、聚集指数的变化(n=11)
时间(d)变形RBCs(个) RBCs聚集指数
074．17±9．871．76±0．117101．83±22．821．84±0．0814181．50±17．33ab1．83±0．0721344．20±12．70abc1．91±0．07ac28442．00±32．12abcd1．92±0．06ac35554．67±31．63abcde2．01±0．08abcde42734．83±9．95abcdef2．06±0．15abcde
a为与0 d相比，P<0.05；b为与7 d相比，P<0.05；c为与14 d相比，
P<0.05；d为与21 d相比，P<0.05；e为与28 d相比，P<0.05；f为与35 d 相比，P<0.05
3 讨论
在正常RBCs内，绝大多数Hb游离存在于胞浆内，只有少部分与RBCs膜结合。

当Hb结构异常或被氧化以及细胞膜异常时，Hb再释放会发生改变。

我们前期结果表明，轻型β-地中海贫血患者、肝内胆管癌患者、肝硬化患者、慢性肾衰竭患者的红细胞Hb再释
放增加[7-11]，而遗传性球形RBCs增多症患者Hb再释放减少[12]，这些疾病可能从不同角度影响了Hb与RBCs膜的相互作用，导致Hb再释放的改变。

此后，我们证明，体外过氧化氢作用RBCs可导致Hb再释放增加[13-15]。

据此推测，Hb再释放增加还可能与RBCs氧化损伤有关。

本研究结果表明，随着存储时间延长，Hb再释放增加。

同时，随着存储时间延长，作为膜脂过氧化最重要产物之一的MDA含量逐渐增加，细胞内Hb不断被氧化成高铁血红蛋白(MetHb)，FMetHb也呈递增趋势，推测存储RBCs再释放增加可能与细胞膜氧化损伤及MetHb生成增加有关。

血涂片及相对溶血率的结果显示，存储末期变形RBCs增
多，相对溶血率增高，RBCs聚集指数也呈增加趋势，说明RBCs破坏严重，因此膜结合Hb增高不明显，Hb再释放增加也不明显。

综上所述，随着存储时间延长，RBCs存储质量下降是必然的趋势。

本研究结果表明，伴随着RBCs存储损伤加重，与膜结合的Hb可能增加，导致Hb再释放量增加。

因此，Hb再释放量的增加有可能作为评价红细胞存储损伤的一种简便方式，对评估RBCs存储质量具有重要的指导作用。

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