_HPLC法测定多维元素泡腾片中5种B族维生素

第一作者 Te:l (0760)86655310;E -ma i :l bosstrong @126.co m
HPLC 法测定多维元素泡腾片中5种B 族维生素
王德刚,严慧如,马萍,刘俊华
(珠海联邦制药股份有限公司,中山528467)
摘要 目的:建立高效液相色谱法测定多维元素泡腾片中5种B 族维生素的含量。

方法:以Ine rtsilOD S-3C 18(250mm @416mm,5L m )为分析柱,乙腈-01003mo l #L -1己烷磺酸钠溶液为流动相进行梯度洗脱,流速为1mL #m in -1;检测波长为277n m;柱温为40e 。

结果:维生素B 1、维生素B 2、维生素B 6、烟酰胺、叶酸的浓度分别在8145~5017L g #mL -1(r =019997)、9127~5516L g #mL -1(r =019997)、1111~6615L g #mL -1(r =019998)、9114~548L g #mL -1(r =019998)、0185~5109L g #mL -1(r =019997)范围内与峰面积呈良好的线性关系。

平均回收率(n =9)分别为10017%,9815%,9918%,10011%,10014%。

重复性的R SD (n =6)分别为019%,019%,113%,111%,112%。

结论:该法专属性好,操作简便,准确度高,可作为该产品质量控制的方法。

关键词:多维元素泡腾片;B 族维生素;含量测定;高效液相色谱法中图分类号:R 917
文献标识码:A
文章编号:0254-1793(2010)07-1271-05
HPLC deter m i nation of five ki nds of vita m i n B i n multivita m i n effervesce nt tablets
WANG De-gang ,YAN Hu i-ru ,MA P i n g ,LIU Jun-hua
(ZhuhaiUn ited Laboratories C o 1,L t d 1,Zh ongs han 528467,Ch i na )
Abst ract Objective :To estab lish an H PLC m ethod f o r the deter m i n ation o f v ita m in B co m plex i n m u ltiv ita m in e-f fer vescent tab lets .M ethods :The separati o n w as perfor m ed on an I nertsil ODS -3C 18co l u m n (250mm @416mm ,5L m );a g radient e l u ti o n pr ocedure w as co m posed o f aceton itrile-01003m o l #L -1
1-hexanesu lfonic ac i d
sod i u m salt so l u ti o n ,and the flo w rate w as 110m L #m in -1
;detecti v e w aveleng th w as set at 277nm.The separa -ti o n w as perfor m ed at 40e .R esults :V ita m i n B 1,v ita m in B 2,vita m i n B 6,n icotina m ide ,fo lic ac i d had good li n e -arity i n t h e range of 8145-5017L g #mL
-1
(r =019997),9127-5516L g #mL
-1
(r =019997),1111-6615L g
#mL -1
(r =019998),9114-548L g #mL -1
(r =019998),0185-5109L g #mL -1
(r =019997),respectively .The average recoveries (n =9)w ere 10017%,9815%,9918%,10011%,10014%,respective ly .RSD s o f re -peatab ility(n =6)w ere 019%,019%,113%,111%,112%,respective ly 1Conclusion :The m ethod is repro -duc i b le ,si m ple and accurate .It can be used for the deter m inati o n of v ita m i n B co m p lex i n m ultivita m i n efferves -cent tablets .K ey w ords :mu lti v ita m i n e ffervescent tab lets ;v ita m i n B co m plex ;deter m inati o n of conten;t HPLC B 族维生素有B 1(硫胺)、B 2(核黄素)、B 3(烟酰胺)、B 6(吡多辛)、B 12(氰钴胺)、叶酸和泛酸,都是人体健康必不可少的重要物质,市售多维元素产品中大多含有上述B 族维生素。

多维元素泡腾片除含上述B 族维生素外,还含维生素A 、D 、E 及维生素C 和生物素等12种维生素、9种矿物质和微量元素。

原研瑞士M igros 公司产品(ACTI LI FE A ll in
One)每片重量达418g ,但12种维生素只占处方量的2%,矿物质和微量元素占处方量的7%和90%以上为辅料。

由于辅料量大,对各成分的分离分析干扰也较大,含量测定比较困难。

多维元素片(29)(善存片)的国家药品标准W S 1-(X -054)-2000Z 等文献
[1~5]
采用等度洗脱的方法分析B 族维生素的
含量,也有文献[6~8]
采用梯度洗脱的方法分析B 族
维生素的含量,多为测定辅料量较少的制剂,如注射剂、胶囊剂及普通片剂等,而无测定多维元素泡腾片的相关报道;各国药典(BP、EP、USP、JP、ChP)收录维生素类制剂以单方较多,复方制剂较少,多维元素泡腾片各国药典均未收载。

本研究在参考以上文献方法的基础上,对多维元素泡腾片中B族维生素的含量测定方法进行了研究。

结果发现,采用等度洗脱,主成分峰和辅料峰不能实现基线分离,维生素B1和维生素B2保留时间长,峰形差,辅料干扰测定,不能对各成分准确定量。

本研究对善存片(普通片剂)的国家药品标准方法进行了改进,克服了泡腾片中大量辅料的干扰,同时增加了对叶酸的含量测定,建立了同一色谱条件同时测定多维元素泡腾片中5种B族维生素含量的方法,测定结果准确可靠。

1仪器与试药
LC-10Avp型高效液相色谱仪(日本SH IMAD-ZU公司),SPD-M10A vp紫外检测器(日本S H I MADZ U公司),AE240型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

对照品盐酸硫胺(维生素B1)、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、叶酸均由瑞士F l u ka公司提供,多维元素泡腾片(香港联邦制药厂有限公司,批号为040415,040421),ACT I LI FE A ll i n One泡腾片(瑞士M i g r os公司产品,批号为471533),规格:维生素B1 (按C12H17N4OS计)114m g,维生素B2(C17H20N4O6) 116m g,维生素B6(按C8H11NO3计)210m g,烟酰胺(C6H6N2O)18m g,叶酸(C19H19N7O6)012mg,平均片重418g。

乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,水为超纯水。

2色谱条件
以I nertsil ODS-3C18(250mm@416mm, 5L m)为分析柱;以01003m o l#L-1己烷磺酸钠水溶液(称取己烷磺酸钠01564g,置1000mL量瓶中,加水950mL,用冰醋酸调节p H至216,加水稀释至刻度)为流动相A,乙腈为流动相B,流速为1mL# m in-1,梯度洗脱(0~20m i n内,流动相B的比例从5%增加至25%;2015m in,流动相B的比例恢复至5%,维持14m i n);检测波长为277nm,进样量20 L L。

理论板数按叶酸峰计算应不低于2000,各成分峰间的分离度应符合要求。

3实验方法
311对照品储备液的制备
取对照品烟酰胺约188m g,盐酸硫胺约1815m g,维生素B2约18m g,维生素B6约27m g,精密称定,精确至011m g,置于同一个200m L量瓶中,加65e的1%醋酸溶液80m L,置65e?5e 水浴中振摇15m i n,冷至室温,用1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,得到对照品储备液¹。

因样品中叶酸和其他4个成分的含量相差较大,而且叶酸在1%醋酸溶液中不溶,故叶酸对照品储备液单独配制。

参照中国药典叶酸[9]含量测定方法,取叶酸对照品约22m g,精密称定,置200mL 量瓶中,加015%氨溶液4mL溶解后,用水稀释至刻度,摇匀,得到对照品储备液º。

溶液稳定性试验表明,该溶液室温下4h内稳定。

312对照品溶液的制备分别精密量取对照品储备液¹10m L和对照品储备液º1mL,置同一25 mL量瓶中,加1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀, 0145L m滤膜过滤,即得。

313供试品溶液的制备取样品10片,精密称定,研细,精密称取适量(约相当于烟酰胺18m g),置50m L量瓶中,加微热至65e的1%醋酸溶液45m L,置65e?5e水浴中振摇45m i n,冷至室温,加1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,0145L m滤膜过滤,待测。

4结果与讨论
411流动相的选择参照多维元素片(29)国家药品标准中维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺含量测定的色谱条件,以甲醇-01005m o l#L-1己烷磺酸钠溶液(p H217)(12B88)作为流动相,结果主成分峰和辅料峰不能完全分离,盐酸硫胺和维生素B2保留时间长,峰形差。

试用梯度洗脱:0~30 m i n,甲醇的比例从10%增加至55%,30m i n之后,甲醇的比例恢复至10%,维持10m in,此色谱条件盐酸硫胺和叶酸不能分离。

以乙腈代替甲醇,并调整己烷磺酸钠溶液的浓度,梯度洗脱:0~20m i n,乙腈的比例从5%增加至25%;20m in之后,乙腈的比例恢复至5%,维持14m i n,此色谱条件下各主成分色谱峰之间的分离度符合要求,主成分峰和辅料峰完全分离,故选择此流动相系统,并采用梯度洗脱的方法进行试验。

412流动相pH的考察分别用冰醋酸调节01003m o l#L-1己烷磺酸钠溶液的p H至212,214, 215,216,217,310,315进行试验,结果当p H为212时,主成分峰和辅料峰不能完全分离,pH在214~ 315之间,主成分峰和辅料峰均能达到分离,但当p H变大时,各峰的保留时间延后,叶酸与维生素B6
之间的分离度变小,综合考虑,选择流动相A的pH 为216。

413色谱柱的选择采用选定的流动相系统,试用H ypersil B DS、I nertsil ODS-3、SH IMADZU VP-ODS 3种色谱柱进行试验,当用H ypersil BDS、I nertsilODS -3柱,柱长为250mm时,峰形均较好,各峰的分离度符合要求,好于SH I MADZ U VP-ODS柱,但用H y-persil BDS柱保留时间提前。

综合考虑,选用Inertsil
ODS-3C18(250mm@416mm,5L m)作为分析柱。

414检测波长的选择根据上述各B族维生素的紫外吸收图谱,综合考虑,选择检测波长为277nm,此波长处各成分均有较大吸收。

415干扰性试验取按处方比例制备的多维元素泡腾片空白辅料,按/3130项下方法制备供试品溶液,取20L L进样分析,结果空白辅料对主成分的含量测定没有干扰。

见图1。

图1空白辅料(A)、混合对照品(B)及样品(C)的色谱图
Fi g1H PLC ch ro m at ogra m s of b l ank(A),m ixed standards(B)and sa m p l e(C)
1.烟酰胺(nicoti na m i de)
2.维生素B6(vita m i n B6)
3.叶酸(f oli c aci d)
4.
盐酸硫胺(thia m i ne hydroch l ori de)5.维生素B2(vit a m i n B2)416专属性试验取对照品盐酸硫胺、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、叶酸分别经高温(105e),强光(4500l x?500lx)照射及氧化破坏后制成的溶液,进样分析。

5种B族维生素经高温、强光照射及氧化破坏后叠加的色谱图见图2。

结果各成分破坏后的降解产物均不影响5种B族维生素的含量测定,说明方法的专属性良好。

图2高温(A)、光照(B)及氧化(C)破坏后的B族维生素叠加色谱图
F i g2Overl a i d HPLC c h ro m at ogra m s of fi ve k i nds of vita m i n B destroyed by heat(A),li gh t(B),and oxidati on(C)
417线性关系考察精密量取对照品储备液¹1,2,3,4,5,6m L,分别置10m L量瓶中,用1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,分析。

精密量取对照品储备液º1,2,3,4,5,6m L,分别置100m L 量瓶中,用1%醋酸溶液稀释至刻度,摇匀,分析;以浓度(C)对峰面积(A)作线性回归,回归方程见表1。

表1线性关系考察结果Tab1R esu lts of linear ity
成分(co m pon ent)回归方程
(regres s i on
equati on)
r
线性范围
(li near range)
/L g#mL-1
维生素B
1
(V i ta m i n B
1)
A=21360@104C-
11052@104
0199978145~5017
维生素B
2 (v it a m i n B2)A=71123@104C-
11992@104
0199979127~5516
维生素B
6 (v it a m i n B6)A=31643@104C-
11684@104
0199981111~6615
烟酰胺(n icoti na m ide)A=61550@103C-
11090@104
0199989114~548
叶酸(f olic aci d)A=71730@104C-
479
0199970185~5109
418精密度试验取对照品溶液,连续进样5次,
测定峰面积。

结果盐酸硫胺、维生素B2、维生素B6、
烟酰胺、叶酸峰面积的RSD(n=5)分别为0138%,
0113%,0119%,0117%和1142%。

419重复性试验精密称取同一批样品6份,按
/3130项下方法操作进样分析,计算维生素B1、维生
素B2、维生素B6、烟酰胺、叶酸含量的RSD(n=6)
分别为019%,019%,113%,111%,112%。

4110溶液稳定性考察取对照品溶液于室温下放
置0,2,4,6,8,12,24h进样测定,取供试品溶液于
室温下放置0,2,4,6,8,12h进样测定,记录色谱
图,并与0h的峰面积比较,以峰面积的变化率考察
溶液的稳定性,结果见表2、表3。

结果表明,对照品
溶液及供试品溶液于室温下放置4h内稳定,峰面
积变化率小于?210%。

表2对照品溶液稳定性考察结果
Tab2R esults of stab ility of reference solut i on
成分(co mponen t)
变化率(d i versifi cati on)/%
0h2h4h6h8h12h24h
维生素B
1
(th i a m i ne))-0194-0186-0179-0162-1107-0191
维生素B
2
(vita m i n B2))+0102+0110-0106-0125-0137+0129
维生素B
6
(vita m i n B6))-0111-0106+0133+0124+0127+0128烟酰胺(n i coti na m i de))-0130-0138-0140-0112-0127-0198叶酸(f o li c aci d))-0162-1191-2155-3142-5158-14121
表3供试品溶液稳定性考察结果
Tab3Re s u lts of sab ility of sa mp le so l u ti on
成分(co mponen t)
变化率(d i versifi cati on)/%
0h2h4h6h8h12h
维生素B
1
(th i a m i ne))+0112-0118-0153-1101-2110
维生素B
2
(vita m i n B2))-1101-1199-3116-4108-6130
维生素B
6
(vita m i n B6))-0153-1130-1176-2127-3147烟酰胺(n i coti na m i de))+0102-0111+0185+0147+0140叶酸(f o li c aci d))+1118-0181-2101-3126-8131
4111回收率试验取按处方比例制备的多维元素泡腾片空白辅料共9份,3份为一组,分别置25m L 量瓶中,先用少量1%醋酸溶液溶解,再按120% (高)、100%(中)、80%(低)3个浓度,分别精密加入对照品溶液,按/3130项下方法操作,分别取20 L L进样分析测定,计算维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、叶酸平均回收率(n=9)分别为10017%,9815%,9918%,10011%,10014%。

结果见表4。

4112样品的测定精密量取对照品溶液和供试品溶液各20L L,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。

按外标法以峰面积计算供试品中维生素B1(按C12H17N4OS计)、维生素B2(C17H20N4O6)、维生素B6 (按C8H11NO3计)、烟酰胺(C6H6N2O)和叶酸(C19H19N7O6)的含量,限度均为标示量的90%~ 130%。

结果见表5。

表4回收率试验结果(n=3) T ab4R esu lt of recovery
成分(compon ent)
浓度
(con cent-
rati on)/%
平均回收率
(average recovery)/%
RSD/%
(n=3)
维生素B
1 (t h ia m i n e)120100110139 100100130106 80101160121
维生素B
2 (vit a m i n B2)12098100145 10098150116 8099100110
维生素B
6 (vit a m i n B6)12099130148 10099160122 80100140121
烟酰胺(n i coti na m i de)12099110144 10099190136 80101140127
叶酸(f oli c aci d)120100191173 100101141171 8099101153
表5样品含量测定结果(标示量%) T ab5R esu lts of de ter m i nation of sa mp le(l abeled a m ount%)
批号(batch)
040415
(Un ited)
040421
(Un it ed)
471533
(M i gros)
维生素B
1
(t h ia m i n e)
126141221913015
维生素B
2
(vit a m i n B2)
108111051610510
维生素B
6
(vit a m i n B6)
111151121511110烟酰胺
(n i coti na m i de)
104151051310414叶酸
(f o li c aci d)
105101201011010
5结论
本文采用梯度洗脱的方法实现了同一色谱条件同时测定多维元素泡腾片中5种B族维生素的含量。

该法相对等度洗脱的方法,克服了泡腾片中大量辅料对测定的干扰,实现了主成分峰和辅料峰的完全分离。

各种维生素之间具有较好的分离度,分析时间适中,且操作简便、结果准确可靠,因此,本方法可作为多维元素泡腾片产品质量控制的方法。

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