氟罗沙星胶囊微生物检查方法的研究

氟罗沙星胶囊微生物检查方法的研究
李芳;刘冬玲;刘浩;杨美成
【摘要】为建立氟罗沙星胶囊的微生物限度检查方法,本文根据《中国药典》2015年版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法和通则1107非无菌药品微生物限度标准,利用硫酸镁与氟喹诺酮类抗生素的络合作用、聚山梨酯80和卵磷脂的中和作用,采用薄膜过滤法测定氟罗沙星胶囊对5种试验菌株的回收率,并对控制菌检查方法进行适用性试验.在对3个批次的样品进行需氧菌总数、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验中,稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2之间,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2之间;在进行控制菌检查方法适用性试验中,试验组检出阳性试验菌.因此该方法可消除氟罗沙星胶囊的抑菌作用,可用于氟罗沙星胶囊的微生物限度检查.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2016(041)006
【总页数】3页(P445-447)
【关键词】氟罗沙星胶囊;微生物限度检查;方法适用性试验;络合作用;薄膜过滤法【作者】李芳;刘冬玲;刘浩;杨美成
【作者单位】上海市食品药品检验所,上海201203;上海市食品药品检验所,上海201203;上海市食品药品检验所,上海201203;上海市食品药品检验所,上海201203
【正文语种】中文
【中图分类】R917
氟罗沙星是由日本杏林公司首次合成的第四代喹诺酮类抗生素，对革兰阳性菌、革兰阴性菌、衣原体、支原体的标准菌株及临床分离株均显示出较强的抗菌活性[1-2]。

氟罗沙星胶囊主要用于对本品敏感细菌引起的呼吸系统感染、泌尿生殖系统感染、消化系统感染、皮肤软组织感染、骨感染、腹腔感染及盆腔感染等。

根据《中国药典》2015年版四部微生物限度检查的相关规定，建立微生物限度检查方法时应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检查。

本文对氟罗沙星胶囊微生物限度检查方法进行研究，并对方法进行适用性试验，结果表明所确定的检查方法有效、可行。

1.1 药品
氟罗沙星胶囊，规格：0.1g，批号150501，150502，150503，国药集团工业有限公司。

1.2 仪器
Steritest equinox集菌仪(默克密理博有限公司)，一次性薄膜过滤器FC752(浙江泰林生物技术股份有限公司)，恒温培养箱[三洋电机(中国)有限公司]，BSA 2202S 电子天平[赛多利斯工业称重设备(北京)有限公司]，ESCO MSC Advantage生物安全柜[赛默飞世尔科技(上海)有限公司]。

1.3 菌种
微生物限度检查法用标准菌株：铜绿假单胞菌(Pseudomonas
aeruginosa)[CMCC(B)10104]；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus
aureus)[CMCC(B)26003]；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501]；白念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]；黑曲霉(Aspergillus
niger)[CMCC(F)98003]；大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]，均为
实验室保藏。

1.4 试剂
硫酸镁(分析纯)，批号20120429，江苏永华精细化学品有限公司。

使用无菌0.1%蛋白胨缓冲液作为溶剂。

聚山梨酯80(批号：20151119，上海凌峰化学试剂有限公司)，卵磷脂[批号：SUVUM-JL，梯希爱(上海)化成工业发展有限公司]。

1.5 培养基
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：3302098，广东环凯微生物科技有限公司)；0.9%无菌氯化钠溶液(批号：20151010，上海凌峰化学试剂有限公司)；胰酪大豆胨琼脂培养基(批号：4090289)，沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号：5091514)，麦康凯液体培养基(批号：3200272)[碧迪医疗器械(上海)有限公司]，以上均为符合药
典规定的干燥培养基。

麦康凯琼脂培养基平板(广东环凯微生物科技有限公司，批号：E1322Y)，以上为购买的成品培养基。

2.1 菌液制备
接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，30℃～35℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成不大于
100cfu/mL的菌悬液。

接种白念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20℃～25℃培养2～3d，用0.9%无菌氯化钠溶液制成不大于100cfu/mL和不大于1000cfu/mL的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20℃～25℃培养5～7d。

加入5mL含 0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。

然后，吸出1mL孢子菌液至无菌试管内，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成不大于100cfu/mL和不大于1000cfu/mL的孢子悬液[3]。

2.2 供试液的制备
取本品10g，加入不超过45℃ 1mol/L MgSO4溶液至100mL，混匀，作为1:10的供试液。

并使用1mol/L MgSO4溶液作为稀释液稀释为1:100的供试液。

2.3 微生物计数法适用性试验
试验组：需氧菌总数计数采用薄膜过滤法，取1:100的供试液1mL加入45℃的100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含1%聚山梨酯80)中，按照薄膜过滤法全量过滤后，用45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含1%聚山梨酯80)冲洗9次，每次100mL。

在最后一次的冲洗液加入含菌量不大于100cfu的试验菌液，过滤，取出滤膜以菌面向上贴至直径为150mm的胰酪大豆胨琼脂培养基平板上(含3%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂、1% 1mol/LMgSO4溶液)。

每株试验菌平行
制备2个平皿。

培养温度30℃～35℃，培养3～5d。

霉菌和酵母菌计数采用平皿法，取1:10的供试液10mL，加入试验菌液，混匀，使供试液中含菌量不大于
100cfu/mL，取供试液1mL注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基。

每株试验菌平行制备2个平皿。

培养温度20℃～25℃，培养5d。

供试品对照组：取准备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作，每株试验菌制备2个平皿。

菌液对照组：取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验，每株试验菌制备2个平皿。

稀释剂对照组：取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，按试验组方法测定其菌数，平行制备2个平皿。

计算试验组菌落数减去供试品对照组菌落数及稀释剂对
照组菌落数与菌液对照组的菌落数的比值，3次试验结果见表1。

在对3个批号的样品进行方法适用性试验中，供试品对照组均无菌落生长，由表1结果可知，稀释剂对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2之间，试
验组菌落数减去供试品对照组菌落数与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2之间，故可照该供试液制备方法和计数法测定氟罗沙星胶囊的需氧菌总数、霉菌及酵母菌
数。

2.4 控制菌检查方法适用性试验
由于取1:10的供试液10mL过滤会堵塞滤膜，于是取1:10的供试液2mL加入45℃的100mL pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含1%聚山梨酯80)中，按照薄
膜过滤法全量过滤后，用45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(含1%聚山梨
酯80)冲洗9次，每次100mL。

同法过滤5张滤膜，在最后一次的冲洗液加入含
菌量不大于100cfu的大肠埃希菌菌液，过滤，将5张滤膜加入1000mL胰酪大
豆胨液体培养基(含2%聚山梨酯80、0.3%卵磷脂、1% 1mol/L MgSO4溶液)中。

混匀，30℃～35℃培养18h。

取上述培养物1mL接种至100mL麦康凯液体培养基中，42℃～44℃培养24h。

然后取麦康凯液体培养物接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30℃～35℃培养18h，均可见桃红色菌落。

阴性对照试验：以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查，阴性对照试验无菌生长。

在对3个批号的样品的方法适用性试验中，由表2结果可知，试验组检出阳性试
验菌大肠埃希菌，故可用此供试液制备方法和控制菌检查法进行氟罗沙星胶囊的控制菌检查。

依相应的控制菌检查方法，在规定的温度和最短时间下培养，能检出所加试验菌相应的反应特征。

2.5 样品微生物限度检查
采用“2.3～2.4”项确立的检验方法对3批样品进行微生物限度检查，结果见表3。

由表3可知，3批样品的需氧菌总数均小于100cfu/g、霉菌及酵母菌数均小于
10cfu/g，均未检出控制菌大肠埃希菌，均符合药典对口服制剂的限度要求。

(1)氟罗沙星主要对细菌有较强抗菌活性，单纯采用薄膜过滤法不能完全消除氟罗
沙星的抗菌活性。

氟喹诺酮药物与金属离子(Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+)可发生络合并引起其抗菌活性下降[4]，于是选择1mol/L硫酸镁作为中和剂。

试验结果
表明，综合采用中和法、培养基稀释法和薄膜过滤法才能完全消除抗细菌活性。

霉菌和酵母菌数采用中和法进行检查。

(2)冲洗液中含有聚山梨酯80，若在常温下不易混匀而且容易堵塞滤膜，需在45℃下加热后再用于薄膜过滤，可以增加冲洗液和供试液的滤过性。

(3)根据2015年版《中国药典》的要求，如果供试品对微生物生长的抑制作用无
法以其他方法消除，供试液可经过薄膜过滤处理后再加入试验菌悬液进行方法适用性试验。

在本方法中，考虑到氟罗沙星胶囊对细菌的抑制性，进行方法适用性试验时，最后一次冲洗液中加入不大于100cfu的试验菌后进行薄膜过滤，而不是一定量的供试液中加入试验菌使供试液中的菌数不大于100cfu/mL进行试验。

【相关文献】
[1] 常志初, 蒋勤, 朱法中. 氟罗沙星的研究进展[J]. 中国现代应用药学, 1997, 14(4): 1-4.
[2] Andreas E S, Donbosco K K, Felix J F. Fleroxacin clinical pharmacokinetics[J].Clin Pharm, 1992, 22(2):116-131.
[3] 国家药典委员会. 中国药典[S](2015年版四部). 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 附录140-151.
[4] Li J T, Liu J, Wang T,et al. In vitroactive of gatifl oxacin[J].Chin J Clin Pharmacol, 2001,
74(6): 403.。