紫花苜蓿花药培养的研究进展

紫花苜蓿花药培养的研究进展
唐伟;尹思明;玉永雄
【摘要】The study on anther culture was expounded from two aspects, the donor plant ( genotypes, growth phase of microspores, growth en-vironment of material) and culture technology( pretreatment, basic medium, plantgrowth regulator, carbon source, medium additions, culture conditions). The main issues on anther culture were analyzed in depth. The future direction of alfalfa(Medicago sativa L. ) anther culture re-search was discussed.%从供体植株(基因型、小孢子发育时期、供体材料发育生理状态)和培养技术(预处理、基本培养基、生长调节剂、碳源、培养基添加剂、培养条件)2个方面对花药培养的研究进行了综述,并提出紫花苜蓿花药培养中需要深入研究的主要问题以及今后研究的方向.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)009
【总页数】4页(P5255-5258)
【关键词】紫花苜蓿;花药培养;供体植株;培养技术;研究进展
【作者】唐伟;尹思明;玉永雄
【作者单位】西南大学重庆市草食动物资源保护和利用工程技术研究中心,重庆400716;重庆市渝北区畜牧兽医站,重庆401120;西南大学重庆市草食动物资源保护和利用工程技术研究中心,重庆400716
【正文语种】中文
【中图分类】S541+.1
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是豆科多年生草本，当今世界上栽培面积最大的优
质牧草，有“牧草之王”的美誉。

培育产量高、品质好和抗逆性强的苜蓿新品种对发展畜牧业经济具有重要意义。

目前，常规育种方法主要包括选择育种、杂交育种、综合品种育种和杂种优势利用等。

杂种优势利用是一个育种技术，也是紫花苜蓿的一个重要育种方法。

杂种优势是存在于所有生物中的一种普遍现象，指杂交子代在生长活力、育性和种子产量等方面都优于双亲均值的现象。

杂种优势利用是利用2个遗传组成不同的生物体杂交后获得的杂种一代在生长势、生活力、抗逆性、产量和品质等方面优于亲本的表现，达到生产要求。

Riday和Brummer［1］利用9
个紫花苜蓿种质与5份黄花苜蓿种质按双列配对设计进行杂交，发现了紫花苜蓿×黄花苜蓿杂种优势模式，证明了紫花苜蓿杂种优势表现在亚种、半同胞或个体杂交水平上，而且亚种间的杂交种比亚种内的杂交种可增产18%以上［2］。

在苜蓿的杂种优势利用中，雄性不育系杂交制种也是有效途径之一。

吴永敷等研究表明，杂交不育系苜蓿较常规品种增产25%［3］。

紫花苜蓿为异花授粉作物，其群体遗传基础复杂，基因型众多，同一个体在遗传上也是杂合的。

然而，杂种优势利用的前提是要求亲本的遗传纯合且一致。

因此，紫花苜蓿的杂种优势利用首先要获得遗传纯合且一致的亲本。

遗传纯合、一致的亲本在常规育种中一般是通过多年连续自交而获得的。

但是要获得紫花苜蓿遗传纯合、一致的亲本需要很长的年限，其原因为:①紫花苜蓿其有明显的自交不亲和特性，很难获得自交系。

要获得紫花苜蓿遗
传纯合的亲本只能通过近交(姐妹交等)来实现，而近交的亲本基因纯合速度比自交慢;②紫花苜蓿为同源四倍体植物，亲本纯合速度比二倍体植物慢得多。

以上原因
使紫花苜蓿很难获得遗传纯合、一致的亲本，这就限制了紫花苜蓿杂种优势在生产上的应用。

因此，加快基因纯合，缩短育种年限，成为紫花苜蓿的杂种优势利用首要解决的问题。

花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药(小孢子或花粉)接种到人工培养基上，通过诱导雄核发育改变雄核正常的配子体发育途径，使其转向孢子体发育，而后通过愈伤组织或胚状体的方式表达全能性。

利用花药和花粉培养诱导培育的单倍体植株，通过染色体加倍可获得单倍体(DH)加倍纯系，不仅可以缩短育种年限，还可以快速获得符合育种目标的植株，提高育种效率［4］。

因此，花药培养技术将会为解决紫花苜蓿的杂种优势利用问题提供一种新途径。

苜蓿花药培养始于20世纪70年代初，在1972年Saunders和Bingham［5］从未成熟的苜蓿花药成功诱导获得苜蓿花培单株。

1980年，我国学者徐速［6］利用花药培养获得了紫花苜蓿单倍体植株。

1995年，Nedialka Zagorska和Bjan Dimitrov［7］利用经过低温和射线等预处理的紫花苜蓿花药培养获得了单倍体植株。

自进入21世纪以来，对紫花苜蓿花药培养的研究越来越多，但至今未见经苜蓿花药培育成的品种的推广应用的报道。

为此，笔者对紫花苜蓿花药培养的供体植株、培养技术和国内外有关苜蓿花药培养取得的进展以及存在的问题进行综述。

1 紫花苜蓿花药培养的影响因素
1.1 供体植株的影响
1.1.1 基因型。

在决定花粉植株的产生频率中，限制花药培养成功的主要因素之一是供体植株的基因型。

诱导花粉胚或愈伤组织和不定芽以及再生植株形成的频率，通常受到许多基因的制约。

1987年，Tony H［8］等对3个品种50个基因型的紫花苜蓿进行再生试验，研究表明:具有高频率再生的基因型植株无论采用何种方式培养和外植体选取，都能产生体胚;而其他的再生频率低的基因型植株则只有在
选取特定的外植体在特定的培养基中培育时才能产生体胚。

由此可见，基因型对花药和花粉培养存在显著影响，应该选择高频率再生的基因型。

可通过轮回选择法，先按育种目标从基础群体中选择优良单株进行配合力测定，然后根据测定结果将选中的优株彼此互交，形成一个遗传基础更加丰富的优良新群体，这是一个轮回周期。

通过多次轮回选择，群体内再生基因的频率不断提高。

最后，从这样的群体中分离出优良基因型，以提高花粉植株产生的频率［9］。

1.1.2 小孢子发育时期。

在花药和花粉培养过程中，确定离体培养小孢子的发育时期是花药培养中取得诱导单倍体雄核发育成功的重要因素。

张洁［10］等研究表
明只有小孢子发育到一定阶段时对离体刺激才最为敏感，从而改变其发育途径，由配子体转为孢子体方向，获取胚状体或愈伤组织。

不同阶段的花粉小孢子对外界刺激的敏感程度不同。

因而诱导频率也不同。

马菊兰和张博［11］的研究表明，利
用处于单核中期至单核中晚期的花粉小孢子进行单倍体培养是最佳时期。

同时，在蒺藜苜蓿花药培养中发现单核靠边期小孢子的花药愈伤组织诱导率最高，可达37.21%，单核早中期为4.82%，而花药中小孢子处于双核期时无脱分化能力［12］。

1.1.3 供试材料发育的生理状态。

供体植株的生理状态会影响花药培养的效率，即所取材的生理条件是控制花培的因素之一。

生理状态又受到生长条件的影响(光强、光周期、温度、植株的营养状况)。

Kell［13］研究表明供体植株生长的温度和光
照对花药培养有重要的作用。

许智宏［14］的研究表明，若供体母株生长在较低
温条件下，其花粉胚胎具有较高的发生能力。

吴丽芳［15］等在紫花苜蓿花药愈
伤组织和幼苗诱导技术的研究中发现，在不同的生长季节的紫花苜蓿，愈伤组织的诱导率具有较大差异。

生长在9月份的供体植株的花药愈伤组织诱导率比生长在7月份的植株的花药愈伤组织诱导率高出15%左右。

由此可见，适宜的生长条件有
利于紫花苜蓿花药培养胚诱导、愈伤组织诱导。

1.2 培养技术
1.2.1 预处理。

在花药培养中预处理起到关键作用。

对花蕾和花药进行预处理，可以在一定程度上提高花粉胚愈伤组织的诱导率，提高培养的成功率。

李泽文［16］等研究表明在花培中发现花药内有2种不同形态的花粉(S-花粉、E-花粉)。

S-花粉为胚性花粉，可以启动雄核发育途径，朝着形成孢子体的方向发展，但数量极少。

预处理可以增加花药内S-花粉的数目，提高花粉质量，获得较高的诱导效率。

为了提高花粉植株的诱导频率，可对植株或花药进行低温、高温、离心、甘露醇、辐射、高渗等预处理，可起到延缓花粉的退化、提高内源激素的水平、启动雄核发育等作用，对诱导率的提高具有一定的效果。

Nedialka Zagorska［7］研究苜蓿
花药培养中发现，低温预处理花药可提高苜蓿花药的愈伤组织诱导率。

对于不同的种类、品种紫花苜蓿，低温预处理时
间是不同的。

马菊兰等［11］研究表明以KS220-97紫花苜蓿新品系为材料，4℃低温预处理3 d出愈伤率最高。

吴丽芳［15］等以德钦苜蓿与GT13R杂交的杂交种(F1)代为材料的研究表明:花药低温预处理24～48 h较处理72 h对愈伤组织的
诱导效果更好。

热激预处理的有利效果主要在接种后一段时间，即小孢子早期分裂阶段。

若错过这一时期，即使将花药转入高温下培养，也不利于小孢子的发育［17－18］。

吴丽芳［15］等对苜蓿花药进行24～48 h的低温预处理结合32℃热激处理48 h较单一低温预处理出愈率有一定程度的提高。

Touraev A［19］等研究表明，花药在高渗透压液体培养基诱导后转移到固体培养基，对小麦幼胚的诱导频率具有积极影响。

Ravinder Kaur Grewal［20］等研究表明离心处理可以影
响花粉中生长素和细胞分裂素的比例，从而有利于从小孢子胚进行诱导。

1.2.2 基本培养基。

MS、Miller、Nitsch［1］和 Blaydes［21］等培养基对豆科花药培养具有普遍适用性。

苜蓿花药常用的基本培养基有 MS、B5、SH、N6［22－23］，然而应根据花药培养的不同需求而设计新的配方。

李增红［24］等通过
将这4种培养中的大量元素、微量元素、铁盐、有机物等营养元素重新组合发现，N6大量元素+MS微量元素+MS铁盐+B5有机物对苜蓿花药的愈伤诱导率比单一培养基都要高。

耿小丽［25］等研究表明NB培养基对愈伤组织的诱导效果比B5培养基要好，并成功获得苜蓿再生植株。

马菊兰和张博［26］利用改良的
Nitsch2为基本培养苜蓿花药，也获得较理想的培育效果。

1.2.3 生长调节剂。

激
素在花药培养中对诱导小孢子增殖和雄核发育起着重要的作用。

激素的水平和配比对细胞分裂、分化和生长起着关键作用。

在苜蓿花药培养中用到的激素主要有:生
长素类的NAA、2，4-D、IAA等和细胞分裂素类的2-ip、6BA、玉米素、KT等。

李增红［27］研究表明再生植株的生根培养基为1/2MS+NAA 0.01～0.05 mg/L，取得再生植株。

姚喜红［28］等在NB培养基中添加2，4-D 0.3 mg/L和NAA 0.3 mg/L，获得质量较好的愈伤组织。

黄远新［29］等研究表明苜蓿花药宜用较
高浓度的2，4-D，对启动愈伤组织的发生与再分化是有利的。

因此，加入生长调节剂的浓度以及组合应依据接种材料的不同进行分析，通过多次试验来确定适宜的配方。

1.2.4 碳源。

糖可为花药提供碳源，并且调节培养基渗透压、维持花药的正常生长。

Rashid.A［30］与张芳［31］等研究表明在花粉培育时加入高浓度的蔗糖，而蔗
糖代谢会导致培养基中含有高浓度的葡萄糖，不利于胚状体的产生。

丁世萍［32］研究表明麦芽糖为碳源的培养基培养效果较好的原因是麦芽糖代谢慢，有利于小孢子对氨基酸、离子和有机酸等小分子物质的吸收，从而维持小孢子的渗透平衡，这些营养物质也是细胞胚胎发生和植株再生所需要的。

对苜蓿花药培养时，在分化MS培养基添加蔗糖3%或蔗糖1.5%+麦芽糖1.5%的绿苗分化率较高［33］。

耿小丽等的研究表明在诱导分化培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 3 mg/L+琼脂7 g/L附加4%蔗糖时，花药的愈伤组织生长率和胚状体分化能力最大［34］。

1.2.5 培养基添加剂。

在培养基中添加适宜的有机物、氨基酸等营养物质与活性炭、
PVP等吸收物质以及硝酸银、VC等抗氧化物质，有利于提高花粉胚以及植株的获得率。

Olsen［35］在培养基中补加5.1 mmol/L谷氨酰胺，可以提高大麦花药培养绿苗产量。

马菊兰和张博［36］在苜蓿花药培育的培养基中添加谷氨酰胺也获
得较好的结果。

Claudio Stasolla［37］等与Claudio Stasolla［38］认为在培养基中添加谷胱甘肽对花粉培育中胚的诱导是有利的。

Herberle Boys E［39］研究表明活性炭使花粉胚状体和愈伤组织形成的同时，也吸收营养物质和激素类物质，从而影响小孢子的培养。

由于苜蓿花药愈伤组织的内源激素不足以维持其生命活动，在缺少必要的外源激素时容易死亡，因此活性炭在苜蓿花药培育时的应用要慎重。

硝酸银和VC可抑制褐化现象的发生，而且可提高愈伤组织诱导率和胚胎的发生能力［40－41］，但在苜蓿上的应用未见报道。

1.2.6 培养条件。

离体花药培养条件包括温度、光、接种密度、水分等。

光照是组织培养中重要的培养条件之一，对愈伤组织的诱导具有一定的影响［42］。

吴丽
芳［15］等将苜蓿花药先接种在23～27℃条件下暗培养15 d，然后转入光强1 000～1 500 lx光照时间16 h/d下培养，试验表明暗培养结合光培养较单一光培
养形成的诱导愈伤率低，但绿苗率高。

在随后的研究中发现，花药先采用32℃高
温诱导再进行25℃培养，能大幅度提高花粉胚的诱导率。

Sunderland［43］与
梁彦涛［44］等的研究表明花药接种密度对植物的花药培养有一定的影响，而且
诱导率和接种密度呈正相关。

在苜蓿花药培育中一般接种密度以每个50 ml三角
瓶接种5～10朵小花的花药为宜。

Johansson［45］研究表明，进行低温诱导的
同时添加2%CO2，能更有效地诱导胚的发生。

1.3 倍性鉴定花药培育产生的再生植株往往是单倍体、双单倍体及其他倍性的混
合群体。

常用的鉴定方法有细胞学鉴定、气孔大小以及保卫细胞叶绿体数目鉴定以植株形态鉴定［46］。

这些方法只能对少量细胞进行检测，且过程复杂，无法对
嵌合体进行检测。

Mollers［47］等尝试对绿色子叶形胚使用流式细胞仪进行早期
倍数检测，获得理想效果。

耿小丽［48］等利用流式细胞法鉴定花培苜蓿再生植
株的倍性，发现此法具有简单、快捷、精确度高、可进行大批量检测等优点，找到了适宜的程序。

2 紫花苜蓿花药培养存在的问题与对策
2.1 诱导频率和分化成苗率低紫花苜蓿花培存在不少技术难题与理论问题，其中
最主要的问题是花药培养得苗率低［15］。

由于苜蓿花培的基因型差异很明显，
在试验过程中任何条件不恰当都会对花药培养的效率造成影响。

首先要寻找好的再生型材料，加强操作技能，优化培养条件，提高花粉植株的诱导率;加强基础研究，采用分子标记和基因克隆手段，分析花药早期发育基因的功能以及它们在调控花药发育过程的作用模式和它们之间的相互关系，并通过探索在培养过程中某些生理生化指标(如内源激素、氨基酸类物质的含量等)与培养力之间的关系，寻找更加有效的培养技术措施，提高花培效率［49］。

2.2 花药培养中的褐化现象在苜蓿花药培养过程中，褐化现象比较严重［33］。

由于组织中多酚氧化物被激活而被氧化形成褐色的醌类物质，这些醌类物质使得其他酶系统失活，体内代谢紊乱，苜蓿花药生长受阻，从开始的黄绿色逐渐褐变而死亡，影响花培效率。

为防治褐化，首先应选择适期的外植体，建立最佳培养条件(温度、光照、通气状况等);其次应选择最佳培养基(培养基成分、激素含量以及比例);另外，在培养基中添加防褐剂，如PVP(聚乙烯吡咯烷酮)和AgNO3，不仅可
以有效防止褐化，而且能提高花粉胚的发生能力;在培养过程中对花药进行连续转移，也能减少周围酚类物质的积累，从而减轻褐变的毒害作用［41］。

3 展望
苜蓿花培的主要目的是获得纯系育种材料，这样可以加速育种进程，提高选择效率。

但是如今花培的意义不断扩大，进一步拓宽花培育种的应用领域是今后的研究方向。

①花药培育可使得材料在培育过程中发生细胞学上的各种变异，由此获得突变体。

为此研究了这些突变体，建立一套诱导突变体的新筛选体系，构建遗传连锁图以及基因定位分析等。

②在花药培育中没有单一、标准的试验方法或条件使得花药内小孢子一定会发生诱导，通过对花药培育技术和对遗传机理的深入研究，可为试验设计提供一个方向，建立有效、可行的花培体系，在一定程度上克服花培的局限性。

③将花培与分子生物学、细胞生物学、信号传感研究等领域相结合，通过获得主要控制花药发育基因的信息，并对这些基因的功能以及相互作用进行分析。

这对研究苜蓿花药发育的机制是有利的，由此建立控制花药发育的调控网络，使花培具有更好的发展前景。

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