蛋白质结晶学和X光衍射基础

蛋白质表达、纯化
Protein Expression in Yeast
Cloning of target gene to vector Transform to yeast Pichia pastoris Selection of recombinant yeast strain Yeast cell culture for protein production
历史的回顾
最终X射线衍射成为有机分子（特 别是生物活性分子）立体结构测定的有 力工具，为研究生理活性物质（药物分 子）的立体结构、结构改造、结构预测、 结构－功能关系为目标的有机晶体学科 奠定了基础。
对于生物大分子的研究，始于30年 代中期，贝纳尔和藿奇金开始用X射线 衍射方法研究胃蛋白酶的晶体结构，但 直到布拉格主持凯文迪实验室后，才使 得这一工作取得突破，为创建分子生物 学科奠定了基础。
2. Protein-Nucleic Acid：
a. Protein-DNA Complex； b. Protein-RNA Complex.
蛋白质表达、纯化
Protein－Protein Complex Expression and Purification
• Methods for production of recombinant protein complexes by in vivo reconstitution in E. coli
蛋白质表达、纯化
Producing Protein Complexes for Crystallization
1. Protein－Protein Complex Expression and Purification:
a. Proteins express separately; b. Proteins co-express in one cell.
生物物理学－－生物大分子结构解析
蛋白质结晶学和X光衍射基础
授课内容
• 历史的回顾 • X光衍射原理 • 蛋白质表达、纯化 • 蛋白质结晶 • X光衍射及数据收集 • 结构解析
授课目的
• 了解生物物理学发展历史与前沿； • 掌握蛋白质结晶学和X光衍射基础知识； • 开阔视野－－贴近国际一流结构生物学实验室； • 培养兴趣－－增强对科研工作的感性和理性认识。
蛋白质表达、纯化
293EBNA1 Cells With GFP Expressing Vector
A
B
A. Whole cells on plate; B. Cells in the same plate to A viewed by GFP florescence
蛋白质表达、纯化
Recombinant Proteins Expression In 293EBNA1 Cells
1953年沃森和克里克根据X衍射实 验数据建立了脱氧核糖核酸(DNA)的双 螺旋结构，并因此获得1962年的诺贝尔 生理学和医学奖。
历史的回顾
肯德鲁和佩卢茨从30年代开始， 应用X衍射方法研究肌红蛋白与血红蛋 白的晶体结构，历经20多年的艰苦努 力，在众多科学家的共同参与下，终 于在1960年获得了这两个蛋白质的三 维结构，并因此荣获1962年的诺贝尔 化学奖。
What we can do？
挑战和机遇 ？？？
Structural Biology Processes
• 克隆、表达、纯化 • 结晶 • 数据收集及处理 • 相角的测定 • 相角的改进（优化） • 电子密度图的解释 • 修正 • 结构的描述和与功能
关系的研究
蛋白质表达、纯化
Recombinant protein over-expression and purification
1. Use compatible vectors, such as pMR101(p15A ori) and pET15B(2 ori); 2. Use one vector with more than one expression cassettes--polycistronic；
Benefits of in vivo reconstitution (coexpression) • efficiency – one round of expression – one round of purification • quality – coexpression and cofolding of polypeptides in the presence of cellular chaperones may increase yield of functional complex
蛋白质三维结构测定方法
• X-射线晶体学 • 电子显微学 (低温电子显微技术与三维象重构） • 核磁共振波谱学
历史的回顾
1895 年 德 国 物 理 学 家 伦 琴 发 现X射线并因此获得 1901年 首届诺贝尔物理学奖，X射 线 历 经 110 年 跨 越 3 个 世 纪 ， 由于众多学者在探索X射线 性质、应用、仪器等方面的 创新性研究，先后有29位物 理学家、晶体学家、化学家、 分子生物学家等分别获得了 物理（7项）、化学（9项）、 生理学或医学（3项）总计19 项诺贝尔奖。
历史的回顾
1912年劳厄获得了X射线通过 晶体后产生的衍射斑点图像（劳厄 衍射图），证明了X射线的波动性 及其波长范围。随后提出了表示原 子排列周期与X射线波长间关系的 著名的衍射方程（劳厄方程），并 成功地解释了晶体衍射的实验结果。
英国物理学家布拉格父子、达 尔文等人发展了X射线衍射理论， 类比光学反射原理提出了表示晶体 结构（晶面间距d）、X射线波长 （λ）与衍射方位（）间的关系的 布拉格方程，提出了嵌镶晶体、完 整晶体和包含有原子热运动诸因素 的衍射强度公式，阐明了X射线通 过晶体产生衍射的付里叶变换本质， 获得了X射线的连续光谱与取决于 阴极材料的特征光谱。
1
2
34
5
94
67
45
Recombinant protein 1 (lane 4)
Recombinant protein 2 (lane 5)
31
GFP (lane3)
20
14 Lanes: 1. Protein standard; 2. Control whole 293E cells; 3. GFP expressed 293E cells; 4. HCF-1N380 expressed 293E cells; 5. HCF-1N16-363 expressed 293E cells.
（晶面间距，晶胞参数等）；而衍射强度决定于晶体中各组成原子的元素种类及其分
布排列的坐标。
劳埃（Laue）方程
布拉格方程
X光衍射原理
X光衍射原理
劳埃（Laue）方程和布拉格（Bragg）方程确定了衍射方向与晶体结构基本周期的 关系，通过对衍射方向的测量，理论上我们可以确定晶体结构的对称类型和晶胞参 数。而X射线对于晶体的衍射强度则决定于晶体中原子的元素种类及其排列分布的 位置。
a. additional base pairs; b. sticky ends; 4. Purification of DNA oligos: HPLC with hydrophobic interaction,
Virus assembly in insect cells Viruses infect Insect Cells for protein production Strains for expression: Sf9, Sf21, Hi5
蛋白质表达、纯化
Transient Expression In Mammalian Cells
在1957至1967年的10年中，相继 用X衍射方法测定了溶菌酶、胰岛素、 胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核 酸酶S和羧肽酶的高分辨晶体结构。
戴森豪菲尔和胡贝尔、米海尔因 测定紫色细菌光合作用中心的三维结 构而获得1988年的诺贝尔化学奖，形 成了新的蛋白质晶体学科与结构分子 生物学科。
X光衍射原理
2. 在物质的微观结构中，原子和分子的距离（1 ～ 10 埃左右）正好落在X 射线的波长范围内， 所以物质（特别是晶体）对X 射线的散射和衍射能够传递极为丰富的微观结构信息。X 射线衍 射方法是当今研究物质微观结构的主要方法。
3. X 射线穿透物质时都会被部分吸收,其强度将被衰减变弱；吸收的程度与物质的组成、密度和 厚度有关。在此过程中X 射线与物质的相互作用是很复杂的，会引起多种效应。例如，可以使 气体电离；使一些物质发出可见的荧光；能破坏物质的化学键，引起化学分解，也能促使新键 的形成，促进物质的合成；作用于生物细胞组织，还会导致生理效应，使新陈代谢发生变化甚 至造成辐射损伤。
Recombinant plasmid with target gene
Transfect to 293E cells with PEI Harvest cells for protein purification
293E cell can be cultured in suspension medium
4. X 射线散射的过程又可分为两种，一种是只引起X 射线方向的改变， 不引起能量变化的散射， 称为相干散射，这是X 射线衍射的物理基础；另一种是既引起X 射线光子方向改变，也引起其 能量的改变的散射，称为不相干散射或康普顿散射（或康普顿效应），此过程同时产生反冲电 子（光电子）。
X光衍射原理
衍射的几何方程
X-射线
X 射线和可见光一样属于电磁辐射，但其波长比可见光短得多，介于紫外线与 γ 射线之间，约为10－2 到102 埃的范围。
X光衍射原理
X-射线
1. X 射线和其它电磁波一样，能产生反射、折射、散射、干涉、衍射、偏振和吸收等现象。但是， 在通常实验条件下，很难观察到X 射线的反射。不可能像可见光那样用透镜成像。对于所有的 介质，X 射线的折射率n都很接近于1（但小于1），所以几乎不能被偏折到任一有实际用途的 程度。
X 射线照射到晶体上发生散射，其中衍射现象是X 射线被晶体散射的一种特殊表
现。晶体的基本特征是其微观结构（原子、分子或离子的排列）具有周期性，当X 射
线被散射时，散射波中与入射波波长相同的相干散射波，会互相干涉，在一些特定的
方向上互相加强，产生衍射线。
晶体可能产生衍射的方向决定于晶体微观结构的类型（晶胞类型）及其基本尺寸
Expression systems: 1. Bacteria system 2. Yeast 3. Insect cells 4. Mammalian cells 5. Cell-free system
蛋白质表达、纯化
Some Vectors for E.coli Expression System
蛋白质表达、纯化
Protein－DNA Complex
1. Protein solubility: higher in high salt buffer usually; 2. Protein-DNA complex stability: more stable than protein alone; 3. DNA length and sequence used for crystallization:
蛋白质表达、纯化
Cell-free System for Protein Production
Roche: Rapid Translation System (RTS) Rapid protein expression Sometimes it can produce soluble protein which can not be expressed as soluble form with cellular system. Toxic protein expression
蛋白质表达、纯化
Protein Expression in Insect Cells
Cloning of target gene to pFastBac
Transform to bacteria with Bacmid
After recombination
Bacmid transfected to insect cells