一种非洲菊的组织培养方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011178991.4
(22)申请日 2020.10.29
(71)申请人 云南省农业科学院花卉研究所
地址 650100 云南省昆明市盘龙区北京路
2238号云南省农业科学院科研办公楼
4楼
申请人 玉溪云星生物科技有限公司　
江苏省中国科学院植物研究所
(72)发明人 李绅崇　王继华　杨春梅　卢珍红　
单芹丽　汪国鲜　莫锡君　吴丽芳　
郑玉红　
(74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 瞿晓晶
(51)Int.Cl.
A01H 4/00(2006.01)
(54)发明名称
一种非洲菊的组织培养方法
(57)摘要
本发明提供了一种非洲菊的组织培养方法，
属于植物组织培养技术领域，包括以下步骤：1)
将带有叶柄的无菌非洲菊叶片进行愈伤组织培
养和继代增殖培养，得到愈伤组织；2)将所述步
骤1)得到的愈伤组织进行分化培养和继代培养，
得到非洲菊丛生苗。

采用本申请提供的组织培养
方法愈伤组织的诱导率高，增殖速度快，愈伤组
织分化效率高，丛生芽数量多，芽生长速度快，可
大幅度的提高非洲菊的繁殖系数，加快繁殖的速
度，缩短成苗周期，极大的有利于非洲菊的大规
模栽培和切花生产。

权利要求书1页 说明书6页CN 112293254 A 2021.02.02
C N 112293254
A
1.一种非洲菊的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将带有叶柄的无菌非洲菊叶片进行愈伤组织培养和继代增殖培养，得到愈伤组织；
2)将所述步骤1)得到的愈伤组织进行分化培养和继代培养，得到非洲菊丛生苗。

2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤1)愈伤组织培养和继代增殖培养使用的培养基均包括：MS+葡萄糖22～25g/L+琼脂7～7.5g/L+
3.2～3.3mg/L苯基噻二唑基脲+1.2～1.3mg/L ɑ-萘乙酸+2.5～3.5mg/L多壁碳纳米管。

3.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤1)愈伤组织培养和继代增殖培养的条件均包括：在24～26℃下暗培养。

4.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2)愈伤组织的体积为0.8～1.0cm 3。

5.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2)分化培养和继代培养使用的培养基均包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1.8～2.0mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.3～0.5mg/L ɑ-萘乙酸+1.5mg/L多壁碳纳米管。

6.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤2)分化培养和继代培养的条件均包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol ·m -2·s -1，光照时间为16h。

7.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤1)带有叶柄的无菌非洲菊叶片的获取方法包括：
a、将非洲菊的花蕾进行清洗和消毒后，除去苞片和管状第一花，得到花托；
b、将所述步骤a得到的花托进行芽诱导和继代培养，得到绿色苗；
c、将所述步骤b得到的绿色苗进行壮苗培养，得到带有8～10片叶的非洲菊苗，取下带有叶柄的叶片，得到带有叶柄的无菌非洲菊叶片。

8.根据权利要求7所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤b芽诱导和继代培养使用的培养基均包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+2.6～2.8mg/L苯基噻二唑基脲+0.6～0.8mg/L ɑ-萘乙酸+1.0mg/L多壁碳纳米管；
所述芽诱导和继代培养的条件均包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol ·m -2·s -1，光照时间为16h。

9.根据权利要求7所述的组织培养方法，其特征在于，所述步骤b壮苗培养使用的培养基包括：MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+0.5～0.8mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.2～0.35mg/L ɑ-萘乙酸+2.5～2.8mg/L多壁碳纳米管；
所述壮苗培养的条件包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol ·m -2·s -1，光照时间为16h。

10.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，得到非洲菊丛生苗后还包括：壮苗培养、生根培养、炼苗和移栽。

权　利　要　求　书1/1页CN 112293254 A
一种非洲菊的组织培养方法
技术领域
[0001]本发明属于植物组织培养技术领域，尤其涉及一种非洲菊的组织培养方法。

背景技术
[0002]非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)，又称扶郎花，是菊科大丁草属多年生草本植。

原产于非洲南部的德兰士瓦，喜温暖通风、阳光充足的环境。

因花色丰富，花大而色泽艳丽，可用于切花、盆栽及庭院装饰。

尤其作为切花，受到众多消费者的喜爱，为世界五大鲜切花之一。

目前，已在全世界各地广泛栽培。

[0003]非洲菊种苗的繁殖以组织培养快繁为主。

具体的做法为以花托为外植体，诱导产生少量愈伤组织，愈伤组织不进行增殖诱导，直接分化出丛生芽，经壮芽、壮苗和生根培养，从而建立非洲菊的快繁技术体系。

[0004]近年来，陆续发表了建立非洲菊的组织培养快繁技术体系的论文或专利，但普遍存在诱导周期长，繁殖系数不高等问题。

发明内容
[0005]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种非洲菊的组织培养方法，采用本申请提供的组织培养方法愈伤组织的诱导率高，增殖速度快，愈伤组织分化效率高，丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高非洲菊的繁殖系数，加快繁殖的速度，缩短成苗周期，极大的有利于非洲菊的大规模栽培和切花生产。

[0006]为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007]本发明提供了一种非洲菊的组织培养方法，包括以下步骤：
[0008]1)将带有叶柄的无菌非洲菊叶片进行愈伤组织培养和继代增殖培养，得到愈伤组织；
[0009]2)将所述步骤1)得到的愈伤组织进行分化培养和继代培养，得到非洲菊丛生苗。

[0010]优选的，所述步骤1)愈伤组织培养和继代增殖培养使用的培养基均包括：MS+葡萄糖22～25g/L+琼脂7～7.5g/L+3.2～3.3mg/L苯基噻二唑基脲+1.2～1.3mg/Lɑ-萘乙酸+2.5～3.5mg/L多壁碳纳米管。

[0011]优选的，所述步骤1)愈伤组织培养和继代增殖培养的条件均包括：在24～26℃下暗培养。

[0012]优选的，所述步骤2)愈伤组织的体积为0.8～1.0cm3。

[0013]优选的，所述步骤2)分化培养和继代培养使用的培养基均包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1.8～2.0mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.3～0.5mg/Lɑ-萘乙酸+1.5mg/L多壁碳纳米管。

[0014]优选的，所述步骤2)分化培养和继代培养的条件均包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。

[0015]优选的，所述步骤1)带有叶柄的无菌非洲菊叶片的获取方法包括：
[0016]a、将非洲菊的花蕾进行清洗和消毒后，除去苞片和管状第一花，得到花托；[0017]b、将所述步骤a得到的花托进行芽诱导和继代培养，得到绿色苗；
[0018]c、将所述步骤b得到的绿色苗进行壮苗培养，得到带有8～10片叶的非洲菊苗，取下带有叶柄的叶片，得到带有叶柄的无菌非洲菊叶片。

[0019]优选的，所述步骤b芽诱导和继代培养使用的培养基均包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+2.6～2.8mg/L苯基噻二唑基脲+0.6～0.8mg/Lɑ-萘乙酸+1.0mg/L多壁碳纳米管；[0020]所述芽诱导和继代培养的条件均包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。

[0021]优选的，所述步骤b壮苗培养使用的培养基包括：MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+0.5～0.8mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.2～0.35mg/Lɑ-萘乙酸+2.5～2.8mg/L多壁碳纳米管；[0022]所述壮苗培养的条件包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m -2·s-1，光照时间为16h。

[0023]优选的，得到非洲菊丛生苗后还包括：壮苗培养、生根培养、炼苗和移栽。

[0024]本发明以无菌的带叶柄非洲菊叶片为外植体，成功诱导出愈伤组织，愈伤组织经过增殖培养和分化培养获得大量丛生芽，建立非洲菊的再生技术体系。

此法的优点是愈伤组织的诱导率高，增殖速度快，愈伤组织分化效率高，丛生芽数量多，芽生长速度快，可大幅度的提高非洲菊的繁殖系数，加快繁殖的速度，缩短成苗周期，极大的有利于非洲菊的大规模栽培和生产。

而且利用愈伤组织，可以对非洲菊进行遗传改良，从而利用分子生物学手段对非洲菊进行多种遗传操作或生物工程研究，从分子生物学水平进行品种的遗传改良。

[0025]以非洲菊无菌叶片或幼嫩花托为外植体也能诱导出愈伤组织，但愈伤组织无法大量增殖，出愈不久即分化出芽或褐化。

具体实施方式
[0026]本发明提供了一种非洲菊的组织培养方法，包括以下步骤：
[0027]1)将带有叶柄的无菌非洲菊叶片进行愈伤组织培养和继代增殖培养，得到愈伤组织；
[0028]2)将所述步骤1)得到的愈伤组织进行分化培养和继代培养，得到非洲菊丛生苗。

[0029]在本发明中，所述非洲菊的品种优选包括切花品种，具有更优选为切花品种的“红韵6号”和“秋韵3号”。

[0030]在本发明中，所述带有叶柄的无菌非洲菊叶片的获取方法优选包括：
[0031]a、将非洲菊的花蕾进行清洗和消毒后，除去苞片和管状第一花，得到花托；[0032]b、将所述步骤a得到的花托进行芽诱导和继代培养，得到绿色苗；
[0033]c、将所述步骤b得到的绿色苗进行壮苗培养，得到带有8～10片叶的非洲菊苗，取下带有叶柄的叶片，得到带有叶柄的无菌非洲菊叶片。

[0034]在本发明中，所述花蕾的直径优选为0.6～0.8，所述花蕾的个数优选为15～20个。

本发明优选使用自来水洗净花蕾表面的灰尘，再用洗涤剂震荡浸泡13～15min后用流水冲洗2～3h。

[0035]在本发明中，所述消毒优选包括：在超净工作台使用70～75％的乙醇溶液洗净花托40～42s，再用质量百分含量为0.1％的氯化汞溶液处理12～14min后进行无菌水清洗。

[0036]在本发明中，将得到的花托切割成规格为3mm×3mm的薄片后进行芽诱导培养。

[0037]在本发明中，所述芽诱导和继代培养使用的培养基均优选包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+2.6～2.8mg/L苯基噻二唑基脲+0.6～0.8mg/Lɑ-萘乙酸+1.0mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述芽诱导和继代培养的条件均优选包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。

芽诱导33～35d后，花托上有绿色的突起发生，将有绿色突起的花托接种于上述培养基上进行继代培养13d后，得到绿色苗。

[0038]本发明将得到的绿色苗进行壮苗培养，得到带有8～10片叶的非洲菊苗，取下带有叶柄的叶片，得到带有叶柄的无菌非洲菊叶片。

在本发明中，所述壮苗培养使用的培养基优选包括：MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+0.5～0.8mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.2～0.35mg/Lɑ-萘乙酸+2.5～2.8mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述壮苗培养的条件优选包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。

在本发明中，所述带有8～10片叶的非洲菊苗的高度优选为4～5cm。

[0039]在本发明中，所述愈伤组织培养和继代增殖培养使用的培养基均优选包括：MS+葡萄糖22～25g/L+琼脂7～7.5g/L+3.2～3.3mg/L苯基噻二唑基脲+1.2～1.3mg/Lɑ-萘乙酸+ 2.5～3.5mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述愈伤组织培养和继代增殖培养的条件均优选包括：在24～26℃下暗培养。

所述愈伤组织优选经过23d的培养，在叶片的表面和周边出现绿色的颗粒状突起，为非洲菊愈伤组织发生的开始，愈伤组织培养32～35d后重新接种上述培养基中进行继代增殖培养，得到2.5～3cm3的团块。

本发明优选将所述团块切割成体积为0.8～1.0cm3后进行分化培养。

[0040]本发明将得到的愈伤组织进行分化培养和继代培养，得到非洲菊丛生苗。

[0041]在本发明中，所述分化培养和继代培养使用的培养基均优选包括：MS+蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+1.8～2.0mg/L 6-苯甲基腺嘌呤+0.3～0.5mg/Lɑ-萘乙酸+1.5mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述分化培养和继代培养的条件均优选包括：培养温度为24～26℃，光照强度为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间为16h。

经过25～30d的分化培养，在深绿色的愈伤组织组织培养表面产生浅绿色的芽点，继代培养35～40d，芽点长成绿色的丛生苗，即为非洲菊丛生苗。

[0042]本发明得到非洲菊丛生苗后还优选包括：壮苗培养、生根培养、炼苗和移栽。

[0043]在本发明中，所述壮苗培养养基优选为：MS+蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+0.5～0.8mg/ L 6-BA+0.2～0.35mg/L NAA+2.5mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述壮苗的培养温度优选为25±1℃，光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间优选为16h。

经过60-90d 的壮苗培养，小苗长成高度6.5cm、茎直径0.2cm、叶片12片的试管苗。

期间随着小苗的长大，将其分切成单株。

[0044]本发明优选将得到的单株试管苗进行生根培养。

在本发明中，所述生根培养使用的培养基优选为：MS+蔗糖40g/L+琼脂7.3～7.4g/L+1.0mg/L IBA+2～2.5g/L活性炭+2.5～3.5mg/L多壁碳纳米管。

在本发明中，所述生根培养的培养温度优选为25±1℃，光照强度优选为100～300μmol·m-2·s-1，光照时间优选为16h，生根培养40d后小苗长成高度6.3cm、茎直径0.2cm、叶片15片、根长1.0cm的试管苗。

[0045]在本发明中，所述炼苗优选在室内进行。

在本发明中，所述试管苗优选在组织培养瓶中进行炼苗，本发明优选将组织培养瓶松盖后，置于组织培养室缓冲间，放置3d，之后移
入室内房间，置于自然散射光下，在放置3d。

炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。

栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1:1，栽培基质须经800倍多菌灵消毒处理。

之后进行正常的水肥管理。

[0046]下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0047]实施例1
[0048]切花非洲菊品种‘红韵6号’再生体系的建立
[0049](1)外植体的获取：采集非洲菊切花品种‘红韵6号’幼嫩的花蕾(直径为0.6cm)20个，用自来水洗净表面的灰尘，洗涤剂震荡浸泡13min后流水冲洗2.5h，备用。

[0050](2)外植体的消毒：于超净台上用75％的酒精处理洗净的花托40s，再用0.1％的HgCl2处理12min，无菌水清洗5次，除去苞片和管状第一花，将花托切分成3mm×3mm的薄片，备用。

[0051](3)无菌苗的诱导：将花托薄片以平放的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+MS+2.8mg/L苯基噻二唑基脲(TDZ)+0.8mg/L NAA+ 1.0mg/L多壁碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

接种33d后，花托上有绿色的突起发生；此时，按照原配方进行继代培养，又经过13天后，绿色的突起上萌发出绿色的小苗。

[0052](4)壮苗培养：小苗萌发生长22d后，将小苗转接到壮苗培养基上进行壮苗培养。

培养基配方为蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+2.5mg/L多壁碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

直至小苗长成高度4-5cm，带有叶片8-10片的试管苗。

[0053](5)愈伤组织的诱导和增殖：在超净工作台上，取下无菌试管苗带叶柄的叶片，以平放的方式接种于培养基上，诱导愈伤组织的产生。

培养基配方为：葡萄糖22g/L+琼脂7.5g/L+MS+3.2mg/L苯基噻二唑基脲(TDZ)+1.2mg/L NAA+2.5mg/L多壁碳纳米管。

培养条件为培养温度25±1℃，暗培养。

经过23d的培养，可观察到92.5％的叶片的表面和周边出现绿色的颗粒状突起，此为非洲菊愈伤组织发生的开始。

继续培养，并于32d后进行同配方继代培养，愈伤组织增殖成直径约2.5cm3的团块。

[0054](6)愈伤组织的分化：将愈伤组织切分成体积0.8cm3的小块，接种到愈伤组织的分化培养基上，进行分化培养，从而诱导出丛生芽。

培养基的配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+ MS+1.8mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+1.5mg/L多壁碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过25d的培养，可观察到96.3％的深绿色愈伤组织培养表面产生浅绿色的芽点；30d后继代培养，继续培养35d，芽点慢慢长大成绿色的丛生小苗。

[0055](7)壮苗培养：丛生小苗不分切，直接转接到上述壮苗培养基上进行壮苗培养。

培养基配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+MS+0.5mg/L 6-BA+
[0056]0.2mg/L NAA+2.5mg/L多壁碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过60-90d的培养，小苗长成高度6.5cm、茎直径0.2cm、叶片12片的试管苗。

期间随着小苗的长大，将其分切成单株。

[0057](8)生根培养：将单株试管苗转接到生根培养基上进行生根培养。

培养基配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.4g/L+MS+1.0mg/L IBA+2.5g/L活性炭+2.5mg/L多壁碳纳米管。

培养温度
25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h，40d后小苗长成高度6.3cm、茎直径0.2cm、叶片15片、根长1.0cm的试管苗。

[0058](9)炼苗和移栽：炼苗在室内进行。

将组织培养瓶松盖后，置于组织培养室缓冲间，放置3d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，在放置3d。

炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。

栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1: 1，栽培基质须经800倍多菌灵消毒处理。

之后进行正常的水肥管理。

[0059]从愈伤组织的形成开始计，本实施例得到‘红韵6号’小苗的整个周期为5.5个月。

[0060]实施例2
[0061]切花非洲菊品种‘秋韵3号’再生体系的建立
[0062](1)外植体的获取：采集非洲菊切花品种‘秋韵3号’幼嫩的花蕾(直径为0.8cm)15个，用自来水洗净表面的灰尘，洗涤剂震荡浸泡15min后流水冲洗2.8h，备用。

[0063](2)外植体的消毒：于超净台上用75％的酒精处理洗净的花托42s，再用0.1％的HgCl2处理14min，无菌水清洗5次，除去苞片和管状第一花，将花托切分成3mm×3mm的薄片，备用。

[0064](3)无菌苗的诱导：将花托薄片以平放的方式直接接种到芽诱导培养基上，培养基的组分为：蔗糖30g/L+琼脂7.2g/L+MS+2.6mg/L苯基噻二唑基脲(TDZ)+0.6mg/L NAA+ 1.0mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

接种35d后，花托上有绿色的突起发生；此时，按照原配方进行继代培养，又经过12天后，绿色的突起上萌发出绿色的小苗。

[0065](4)壮苗培养：小苗萌发生长24d后，将小苗转接到壮苗培养基上进行壮苗培养。

培养基配方为蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+MS+0.8mg/L 6-BA+0.35mg/L NAA+2.8mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

直至小苗长成高度4.5cm，带有叶片9片的试管苗。

[0066](5)愈伤组织的诱导和增殖：在超净工作台上，取下无菌试管苗带叶柄的叶片，以平放的方式接种于培养基上，诱导愈伤组织的产生。

培养基配方为：葡萄糖25g/L+琼脂7.0-7.5g/L+MS+3.3mg/L苯基噻二唑基脲(TDZ)+1.3mg/L NAA+3.5mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养条件为培养温度25±1℃，暗培养。

经过23d的培养，可观察到93.2％叶片的表面和周边出现绿色的颗粒状突起，此为非洲菊愈伤组织发生的开始。

继续培养，并于35d后进行同配方继代培养，愈伤组织增殖成直径约3.0cm3的团块。

[0067](6)愈伤组织的分化：将愈伤组织切分成体积1.0cm3的小块，接种到愈伤组织的分化培养基上，进行分化培养，从而诱导出丛生芽。

培养基的配方为：蔗糖30g/L+琼脂7.5g/L+ MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+1.5mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过30d的培养，可观察到97.1％的深绿色愈伤组织培养表面产生浅绿色的芽点；此时继代培养，继续培养40d，芽点慢慢长大成绿色的丛生小苗。

[0068](7)壮苗培养：丛生小苗不分切，直接转接到上述壮苗培养基上进行壮苗培养。

培养基配方为：蔗蔗糖40g/L+琼脂7.2g/L+MS+0.8mg/L 6-BA+0.35mg/LNAA+2.8mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度100～300μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过85d的培养，小苗长成高度6.8cm、茎直径0.25cm、叶片15片的试管苗。

期间随着小苗的长大，将其分切成单株。

[0069](8)生根培养：将单株试管苗转接到生根培养基上进行生根培养。

培养基配方为：蔗糖40g/L+琼脂7.3g/L+MS+1.0mg/L IBA+2.0g/L活性炭+3.5mg/L多壁羧化碳纳米管。

培养温度25±1℃，光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h，40d后小苗长成高度6.3cm、茎直径0.3cm、叶片18片、根长1.2cm的试管苗.
[0070](9)炼苗和移栽：炼苗在室内进行。

将组织培养瓶松盖后，置于组织培养室缓冲间，放置2d，之后移入室内房间，置于自然散射光下，在放置3d。

炼苗完成后，用镊子将试管苗取出，洗去根部的培养基，移栽到10×10的穴盘中。

栽培基质为泥炭土：珍珠岩：田园土＝1:1: 1，栽培基质须经800倍多菌灵消毒处理。

之后进行正常的水肥管理。

[0071]从愈伤组织的形成开始计，本实施例得到‘秋韵3号’苗的整个周期为6个月。

[0072]对比例1
[0073]同样按照实施实例1进行‘红韵6号’获取外植体和消毒，培养无菌苗；然后利用无菌苗带叶柄的叶片诱导愈伤组织的产生。

区别在于诱导愈伤组织时的培养条件为光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过28d的培养，观察到叶片的表面和周边出现绿色的颗粒状突起，比暗培养时推迟了5d。

[0074]对比例2
[0075]同样按照实施实例2进行‘秋韵3号’获取外植体和消毒，培养无菌苗；然后利用无菌苗带叶柄的叶片诱导愈伤组织的产生。

区别在于诱导愈伤组织时的培养条件为光照强度250μmol·m-2·s-1，光照时间16h。

经过30d的培养，观察到叶片的表面和周边出现绿色的颗粒状突起，比暗培养时推迟了7d。

[0076]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。