膜连蛋白A2基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用_张海霞
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ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ；ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ｐｈｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
１６
动 物 医 学 进 展 ２０１５ 年 第 ３６ 卷 第 １０ 期 （总 第 ２６８ 期 ）
（１．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 ７３００３０；２．西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室， 甘肃兰州 ７３００３０；３．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 ７３００３０）
摘 要：为 建 立 膜 连 蛋 白 Ａ２（ＡｎｘＡ２）基 因 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 方 法，根 据 Ｇｅｎ－
Ｃａ２＋ 依赖的膜性生物学活动［４－５］，主要表现在体内参 与膜功能区的形成［６］；在细胞表面具有受 体 作 用 ， ［７］ 且能够引起 细 胞 外 血 管 再 生［８］；另 外，针 对 ＡｎｘＡ２ 对肿瘤的生成相关研 究 也 较 多 。 ［９－１１］ 目 前 有 研 究 表 明，在 不 同 类 型 的 细 胞 中，ＡｎｘＡ２ 的 表 达 水 平 存 在 差异 。 ［１２］ 本研究旨在以 ＢＨＫ－２１细 胞 为 材 料，使 用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 技 术 建 立 检 测 ＡｎｘＡ２ 基 因 表 达 水 平 的 方 法，为 进 一 步 研 究 ＡｎｘＡ２ 基 因 表 达 与 其 生 物 学 功 能 奠 定 基 础 。
的方法 能 成 功 检 出 不 同 细 胞 中 ＡｎｘＡ２ 含 量。 表 明 本 研 究 建 立 的 ＡｎｘＡ２ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光 定 量
ＰＣＲ 检测方法灵敏性高，重复性好，可用于 ＡｎｘＡ２的检测及定量分析。
关键词：膜连蛋白 Ａ２；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应；检测
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ （ＣＰＩＶ），ｔｈｅ ｆｕｌｌ－
ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＨＲＢ－Ｖ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ５′ＵＴＲ，３′ＵＴＲ，ｆ１，ｆ２，ｆ３，ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ
用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝 胶 回 收 试 剂 盒 回 收 ＰＣＲ 产物后，与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载 体 连 接，转 化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ 感受态细胞。涂板后挑取单个圆润的菌落进行增菌 培养，利用质粒抽提试剂 盒 提 取 质 粒，进 行 ＰＣＲ、酶 切和测序鉴定。将测序正确的质粒经紫外分光光度 计分别测定在２６０ｎｍ 及２８０ｎｍ 处的吸光值，并根 据相应公式计算每微升液体中质粒的拷贝数。将该 阳性质粒命名为 Ａ２－Ｓｔａｎｄ，置－８０ ℃保存备用。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 细胞 幼 年 叙 利 亚 仓 鼠 肾 细 胞 （ｂａｂｙ ｈａｍ－ ｓｔｅｒ Ｓｙｒｉａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ，ＢＨＫ－２１）、非 洲 绿 猴 肾 细 胞 （Ｖｅｒｏ）、大鼠 神 经 胶 质 瘤 细 胞 （Ｃ６）、中 国 仓 鼠 卵 巢 细胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ，ＣＨＯ）、人 正 常 胚 肺成纤维细胞（ＭＲＣ－５）、大 鼠 心 肌 细 胞 （Ｈ９Ｃ２）、人 脐静脉 内 皮 细 胞 （ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＨｕｖＥｃ）由甘肃 省 动 物 细 胞 工 程 技 术 研 究 中 心 提供。 １．１．２ 主 要 试 剂 及 仪 器 胎 牛 血 清 ，兰 州 民 海 生 物 工程有限公司产品；反转录试剂、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 总 ＲＮＡ 提取试剂盒，天根生 化 科 技 有 限 公 司 产 品； ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭⅡ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）试 剂盒，宝生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 产 品；ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝 胶 回 收 试 剂 盒，美 国 ＡｘｙＧｅｎ 公 司 产 品； Ｅａｓｙ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ，上 海 生 工 生 物 工 程技术 服 务 有 限 公 司 产 品；ＰＣＲ 仪，德 国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司产 品；Ｂｉｏ－Ｒａｄ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 仪，美 国 伯 乐 有 限 公 司 产 品 ；凝 胶 成 像 系 统 ，北 京 亚 力 思 机 电 技 术研究所产品。 １．２ 方 法 １．２．１ 引物的设计与合成 参照 ＧｅｎＢａｎｋ公布的 ＡｎｘＡ２基因 的 （登 录 号 ＮＭ－００７５８５．３）序 列，通 过 引 物软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０和 Ｏｌｉｇｏ ６．０进行引物 设 计 ，根 据 软 件 评 价 及 分 析 ，设 计 一 对 预 期 扩 增 目 的 片段为８５ｂｐ 的 特 异 性 扩 增 引 物 （Ａｎｘａ２－Ｆ１／Ｒ１）， 同时设计一条扩增目标序列为８９２ｂｐ的 ＡｎｘＡ２通 用引物 Ａ２－Ｆ／Ｒ，并 由 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 合 成 （表 １）。 １．２．２ 标 准 阳 性 模 板 的 制 备 按 照 天 根 总 ＲＮＡ 抽提试剂盒说明提取 ＢＨＫ－２１细胞总 ＲＮＡ，通过常 规反 转 录 体 系，将 ＲＮＡ 反 转 录 为 ｃＤＮＡ 后 作 为 模 板，应 用 通 用 引 物 进 行 ＰＣＲ，扩 增 目 的 基 因 片 段。 ２５μＬ 反 应 体 系：ｄＮＴＰｓ （２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ， １０×ＰＣＲ 缓 冲 液 ２．５ μＬ，上、下 游 引 物 Ａ２－Ｆ／Ｒ
Ｃｌｏｎｅ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ
ＱＩ Ｂｉｎ－ｂｉｎ，ＳＯＮＧ Ｃａｉ－ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｗｅｉ，ＱＵ Ｌｉａｎ－ｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｍｉｎｇ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，１５０００１，Ｃｈｉｎａ）
DOI:10.16437/ki.1007-5038.2015.10.004
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５４．４３
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７－５０３８（２０１５）１０－００１５－０５
膜 连 蛋 白 Ａ２（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２）又 称 为 ＡｎｘＡ２ 或 Ａｎｘ２，是 Ａｎｎｅｘｉｎｓ蛋白家族的 一 员，该 蛋 白 家 族 是 由 Ｃａ２＋ 调节，能 够 结 合 到 带 负 电 荷 的 膜 磷 脂 上，参
（２０ｐｍｏｌ／μＬ）各 ０．５μＬ，ｃＤＮＡ 模 板 ２．０μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ １７．０μＬ。反应 条 件 为：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ｓ， ６０ ℃ ６０ｓ，７２ ℃ ９０ｓ，共３５个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。
反应结束后，用１０ｇ／Ｌ 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增 产物。
பைடு நூலகம்
与 一 系 列 与 Ｃａ２＋ 相 关 的 生 物 学 活 动 。 ［１－３］ 其 中 ＡｎｘＡ２蛋白有 ３３９ 个 氨 基 酸，分 子 质 量 ３６ｋｕ。 目 前 研 究 发 现 ，ＡｎｘＡ２有 不 同 的 生 物 学 功 能 ，如 参 与
收 稿 日 期 ：２０１５－０４－０１ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１４６０６６５）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”项 目（ＩＲＴ１３０９１）；中 央 高 校 基 本
动 物 医 学 进 展 ，２０１５，３６（１０）：１５－１９ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
膜连蛋白 Ａ２基因实时荧光定量 ＰＣＲ 检测方法的建立及应用
张 海 霞１，马 玉 梅３，包 晓 婧３，徐 雷３，李 向 茸１，谢 晶 莹３，马 忠 仁１，２，冯 若 飞１，２＊
科 研 业 务 费 专 项 资 金 项 目 （３１９２０１５００２５） 作者简介：张海霞（１９８６－ ），女，宁夏银川人，助教，硕士，主要从事分子病毒学研究。＊通讯作者
櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂａｎｋ中公布的 ＡｎｘＡ２基因序列设计并合成引物，经 过 条 件 优 化，建 立 了 ＡｎｘＡ２ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光
定量 ＰＣＲ 检测方法。该方法线性 关 系 较 好，以 质 粒 标 准 品 构 建 的 标 准 曲 线 相 关 系 数 Ｒ２ 为 ０．９９９；灵 敏 性
好，比普通 ＰＣＲ 灵敏１００倍。应用建立的方法对随机选取 的 几 种 哺 乳 动 物 细 胞 进 行 检 测。 结 果 表 明，建 立
ｑＰＣＲ 引物 ＡｎｘＡ２－Ｆ１ ５′－ＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＡＴＣＡ－３′
ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＡｎｘＡ２－Ｒ１ ５′－ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＡＡ－３′
ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＷ２０００．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ ＰＩＶ５ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ １５ ２４６ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ５′ ＵＴＲ，７ＯＲＦＳ ａｎｄ ３′ＵＴＲ．Ｆｕｓｉｏｎ （Ｆ）ｇｅｎｅ，ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ （ＨＮ）ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ＨＲＢ－Ｖ ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＰＩ－／ＣＰＩ＋ ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ Ｆ ａｎｄ ＨＮ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ９６．５％－９８．８％ ａｎｄ ９８．１％－９９．５％， ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ９４．２％－９８％ ａｎｄ ９７％－９９．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｂｏｖｅ ａｌｌ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＨＲＢ－Ｖ ｈａｄ ｌｉｔｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＰＩＶ５ｉ－
ｓｏｌａｔｅｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣＰＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
表 １ 引 物 的 核 苷 酸 序 列 Ｔａｂｌｅ １ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物 Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
通用引物
Ａ２－Ｆ ５′－ＣＴＡＣＴＧＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴ －３′
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ Ａ２－Ｒ ５′－ＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＧＡＧＡ －３′
１６
动 物 医 学 进 展 ２０１５ 年 第 ３６ 卷 第 １０ 期 （总 第 ２６８ 期 ）
（１．甘肃省动物细胞工程技术研究中心，甘肃兰州 ７３００３０；２．西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室， 甘肃兰州 ７３００３０；３．西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 ７３００３０）
摘 要：为 建 立 膜 连 蛋 白 Ａ２（ＡｎｘＡ２）基 因 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 检 测 方 法，根 据 Ｇｅｎ－
Ｃａ２＋ 依赖的膜性生物学活动［４－５］，主要表现在体内参 与膜功能区的形成［６］；在细胞表面具有受 体 作 用 ， ［７］ 且能够引起 细 胞 外 血 管 再 生［８］；另 外，针 对 ＡｎｘＡ２ 对肿瘤的生成相关研 究 也 较 多 。 ［９－１１］ 目 前 有 研 究 表 明，在 不 同 类 型 的 细 胞 中，ＡｎｘＡ２ 的 表 达 水 平 存 在 差异 。 ［１２］ 本研究旨在以 ＢＨＫ－２１细 胞 为 材 料，使 用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 技 术 建 立 检 测 ＡｎｘＡ２ 基 因 表 达 水 平 的 方 法，为 进 一 步 研 究 ＡｎｘＡ２ 基 因 表 达 与 其 生 物 学 功 能 奠 定 基 础 。
的方法 能 成 功 检 出 不 同 细 胞 中 ＡｎｘＡ２ 含 量。 表 明 本 研 究 建 立 的 ＡｎｘＡ２ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光 定 量
ＰＣＲ 检测方法灵敏性高，重复性好，可用于 ＡｎｘＡ２的检测及定量分析。
关键词：膜连蛋白 Ａ２；ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ实时荧光定量聚合酶链反应；检测
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ （ＣＰＩＶ），ｔｈｅ ｆｕｌｌ－
ｌｅｎｇｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ＨＲＢ－Ｖ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ． Ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ５′ＵＴＲ，３′ＵＴＲ，ｆ１，ｆ２，ｆ３，ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ
用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝 胶 回 收 试 剂 盒 回 收 ＰＣＲ 产物后，与 ｐＭＤ１８－Ｔ 载 体 连 接，转 化 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ 感受态细胞。涂板后挑取单个圆润的菌落进行增菌 培养，利用质粒抽提试剂 盒 提 取 质 粒，进 行 ＰＣＲ、酶 切和测序鉴定。将测序正确的质粒经紫外分光光度 计分别测定在２６０ｎｍ 及２８０ｎｍ 处的吸光值，并根 据相应公式计算每微升液体中质粒的拷贝数。将该 阳性质粒命名为 Ａ２－Ｓｔａｎｄ，置－８０ ℃保存备用。
１ 材 料 与 方 法
１．１ 材 料 １．１．１ 细胞 幼 年 叙 利 亚 仓 鼠 肾 细 胞 （ｂａｂｙ ｈａｍ－ ｓｔｅｒ Ｓｙｒｉａｎ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌ，ＢＨＫ－２１）、非 洲 绿 猴 肾 细 胞 （Ｖｅｒｏ）、大鼠 神 经 胶 质 瘤 细 胞 （Ｃ６）、中 国 仓 鼠 卵 巢 细胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌ，ＣＨＯ）、人 正 常 胚 肺成纤维细胞（ＭＲＣ－５）、大 鼠 心 肌 细 胞 （Ｈ９Ｃ２）、人 脐静脉 内 皮 细 胞 （ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ，ＨｕｖＥｃ）由甘肃 省 动 物 细 胞 工 程 技 术 研 究 中 心 提供。 １．１．２ 主 要 试 剂 及 仪 器 胎 牛 血 清 ，兰 州 民 海 生 物 工程有限公司产品；反转录试剂、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 总 ＲＮＡ 提取试剂盒，天根生 化 科 技 有 限 公 司 产 品； ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭⅡ （Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）试 剂盒，宝生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 产 品；ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝 胶 回 收 试 剂 盒，美 国 ＡｘｙＧｅｎ 公 司 产 品； Ｅａｓｙ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ，上 海 生 工 生 物 工 程技术 服 务 有 限 公 司 产 品；ＰＣＲ 仪，德 国 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司产 品；Ｂｉｏ－Ｒａｄ 实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 仪，美 国 伯 乐 有 限 公 司 产 品 ；凝 胶 成 像 系 统 ，北 京 亚 力 思 机 电 技 术研究所产品。 １．２ 方 法 １．２．１ 引物的设计与合成 参照 ＧｅｎＢａｎｋ公布的 ＡｎｘＡ２基因 的 （登 录 号 ＮＭ－００７５８５．３）序 列，通 过 引 物软件 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ５．０和 Ｏｌｉｇｏ ６．０进行引物 设 计 ，根 据 软 件 评 价 及 分 析 ，设 计 一 对 预 期 扩 增 目 的 片段为８５ｂｐ 的 特 异 性 扩 增 引 物 （Ａｎｘａ２－Ｆ１／Ｒ１）， 同时设计一条扩增目标序列为８９２ｂｐ的 ＡｎｘＡ２通 用引物 Ａ２－Ｆ／Ｒ，并 由 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司 合 成 （表 １）。 １．２．２ 标 准 阳 性 模 板 的 制 备 按 照 天 根 总 ＲＮＡ 抽提试剂盒说明提取 ＢＨＫ－２１细胞总 ＲＮＡ，通过常 规反 转 录 体 系，将 ＲＮＡ 反 转 录 为 ｃＤＮＡ 后 作 为 模 板，应 用 通 用 引 物 进 行 ＰＣＲ，扩 增 目 的 基 因 片 段。 ２５μＬ 反 应 体 系：ｄＮＴＰｓ （２．５ ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ， １０×ＰＣＲ 缓 冲 液 ２．５ μＬ，上、下 游 引 物 Ａ２－Ｆ／Ｒ
Ｃｌｏｎｅ ｏｆ Ｃａｎｉｎｅ Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ
ＱＩ Ｂｉｎ－ｂｉｎ，ＳＯＮＧ Ｃａｉ－ｌｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｘｉａｏ－ｗｅｉ，ＱＵ Ｌｉａｎ－ｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｍｉｎｇ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｈａｒｂｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ，１５０００１，Ｃｈｉｎａ）
DOI:10.16437/ki.1007-5038.2015.10.004
中 图 分 类 号 ：Ｓ８５４．４３
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７－５０３８（２０１５）１０－００１５－０５
膜 连 蛋 白 Ａ２（Ａｎｎｅｘｉｎ Ａ２）又 称 为 ＡｎｘＡ２ 或 Ａｎｘ２，是 Ａｎｎｅｘｉｎｓ蛋白家族的 一 员，该 蛋 白 家 族 是 由 Ｃａ２＋ 调节，能 够 结 合 到 带 负 电 荷 的 膜 磷 脂 上，参
（２０ｐｍｏｌ／μＬ）各 ０．５μＬ，ｃＤＮＡ 模 板 ２．０μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ 聚 合 酶 （５ Ｕ／μＬ）０．５ μＬ，ＤＥＰＣ Ｈ２Ｏ １７．０μＬ。反应 条 件 为：９４ ℃ ５ ｍｉｎ；９４ ℃ ４５ｓ， ６０ ℃ ６０ｓ，７２ ℃ ９０ｓ，共３５个循环；７２ ℃ １０ ｍｉｎ。
反应结束后，用１０ｇ／Ｌ 的琼脂糖凝胶电泳检测扩增 产物。
பைடு நூலகம்
与 一 系 列 与 Ｃａ２＋ 相 关 的 生 物 学 活 动 。 ［１－３］ 其 中 ＡｎｘＡ２蛋白有 ３３９ 个 氨 基 酸，分 子 质 量 ３６ｋｕ。 目 前 研 究 发 现 ，ＡｎｘＡ２有 不 同 的 生 物 学 功 能 ，如 参 与
收 稿 日 期 ：２０１５－０４－０１ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１４６０６６５）；教育部“长江学者和创新团队发展计划”项 目（ＩＲＴ１３０９１）；中 央 高 校 基 本
动 物 医 学 进 展 ，２０１５，３６（１０）：１５－１９ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
膜连蛋白 Ａ２基因实时荧光定量 ＰＣＲ 检测方法的建立及应用
张 海 霞１，马 玉 梅３，包 晓 婧３，徐 雷３，李 向 茸１，谢 晶 莹３，马 忠 仁１，２，冯 若 飞１，２＊
科 研 业 务 费 专 项 资 金 项 目 （３１９２０１５００２５） 作者简介：张海霞（１９８６－ ），女，宁夏银川人，助教，硕士，主要从事分子病毒学研究。＊通讯作者
櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙櫙
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂａｎｋ中公布的 ＡｎｘＡ２基因序列设计并合成引物，经 过 条 件 优 化，建 立 了 ＡｎｘＡ２ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 实 时 荧 光
定量 ＰＣＲ 检测方法。该方法线性 关 系 较 好，以 质 粒 标 准 品 构 建 的 标 准 曲 线 相 关 系 数 Ｒ２ 为 ０．９９９；灵 敏 性
好，比普通 ＰＣＲ 灵敏１００倍。应用建立的方法对随机选取 的 几 种 哺 乳 动 物 细 胞 进 行 检 测。 结 果 表 明，建 立
ｑＰＣＲ 引物 ＡｎｘＡ２－Ｆ１ ５′－ＧＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＣＧＣＣＴＡＴＣＡ－３′
ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ＡｎｘＡ２－Ｒ１ ５′－ＣＧＴＣＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＡＴＡＡ－３′
ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＨＷ２０００．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｏｆ ＰＩＶ５ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｗａｓ １５ ２４６ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ５′ ＵＴＲ，７ＯＲＦＳ ａｎｄ ３′ＵＴＲ．Ｆｕｓｉｏｎ （Ｆ）ｇｅｎｅ，ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ （ＨＮ）ｇｅｎｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ＨＲＢ－Ｖ ｉｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ＣＰＩ－／ＣＰＩ＋ ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ Ｆ ａｎｄ ＨＮ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ９６．５％－９８．８％ ａｎｄ ９８．１％－９９．５％， ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ９４．２％－９８％ ａｎｄ ９７％－９９．３％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｂｏｖｅ ａｌｌ
ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｖｉｒｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ＨＲＢ－Ｖ ｈａｄ ｌｉｔｔｌｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ＰＩＶ５ｉ－
ｓｏｌａｔｅｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｅ ｌａｉｄ ｔｈｅ ｂａｓｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ＣＰＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｇｅｎｅｔｉｃｓ
表 １ 引 物 的 核 苷 酸 序 列 Ｔａｂｌｅ １ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物 Ｐｒｉｍｅｒｓ
序列 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
通用引物
Ａ２－Ｆ ５′－ＣＴＡＣＴＧＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＣＣＴ －３′
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ Ａ２－Ｒ ５′－ＴＣＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＧＡＧＡ －３′