噬菌体展示技术在子宫内膜异位症中的应用

噬菌体展示技术在子宫内膜异位症中的应用
[摘要] 目的：利用噬茵体7肽库筛选子宫内膜异位症异位内膜细胞表面的特异性结合肽。

方法：利用噬菌体展示技术体外快速差减筛选子宫内膜异位症异位内膜细胞和在位内膜细胞，经过连续5轮生物淘洗，随机挑选50个噬茵体克隆通过ELISA筛选并进行DNA测序，再通过噬茵体竞争抑制试验来验证阳性噬菌体的亲和性。

结果：①经过5轮差减筛选，产出噬菌体的数量（106pfu/mL）在研究1、2、3、4、5中分别为0.9±0.2，3.3±0.6，8.2±1.2，14.2±1.2及26.9±1.9，有显著性差异（P＜0.05）。

②经过ELISA实验，其中OD450值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被选出，经DNA测序，13个噬菌体克隆中包含6个不同的氨基酸序列，其中5个克隆有共同序列为CGCACCCGCCTGCATACCCGC，其相应的氨基酸序列为RTRLHTR。

③多肽RTRLHTR与子宫内膜异位症细胞的结合能力呈多肽剂量依赖性降低，而对照组多肽没有显示这种特异性结合活性。

结论：噬茵体展示技术筛选的多肽RTRLHTR可望为子宫内膜异位症早期诊断及治疗提供新的方向。

[关键词]异位内膜细胞；噬茵体展示技术；噬茵体多肽库；多肽
Application of phage display technology in
endometriosis.
[abstract] Objective:Using 7-mer phage display library in vitro to isolate novel peptides specifically binding to the surface of endometriosis cells (ectopic endometrium).Methods:Phage display technology with biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands between ectopic endometrium cells and eutopic endometrium cells was utilized.50 phage clones were randomly selected after five consecutive rounds of biopanning, and analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay and DNA sequencing.The peptide-competitive inhibition assay was performed to identify the affinity of positive phages combined with ectopic endometrium cells.Results:①During the biopanning processes,the recovered phage
number(106pfu/mL)in parts 1,2,3,4,and 5 of the study were 0.9±0.2,3.3±0.6,8.2±1.2,14.2±1.2,and 26.9±1.9,respectively(P＜0.05).②After ELISA,the OD450 value of 13 clones was＞0.5,and these phase clones were sequenced.6 distinct sequences from the 13 clones were obtained and 5 clones had a consensus DNA sequence CGCACCCGCCTGCATACCCGC,the corresponding amino acid sequence was RTRLHTR.③We found that the binding capacity of the polypeptide RTRLHTR and endometriosis cells was reduced in peptide dose-dependent pattern.In contrast,the control peptide revealed no such specific binding activity.Conclusion:The polypeptide RTRLHTR screened by phage display technology may offer a new direction for early diagnosis and treatment of endometriosis.
[Key words] ectopic endometrium cells;phage display technology;phage peptide library;peptides
子宫内膜异位症是生育年龄妇女常见的一种良性疾病，但是它的一些生物学行为和恶性肿瘤相类似。

近年来，肿瘤靶向治疗是肿瘤临床治疗的热点之一，而子宫内膜异位症治疗上尚不尽人意，没有特异性的药物能到达病灶局部
并形成有效的杀伤浓度，因此子宫内膜异位症的靶向治疗有望成为其治疗的重要手段。

噬菌体展示技术使我们可以筛选出肿瘤细胞表面的特异性结合肽[1]，目前已被广泛应用于肿瘤抗原筛选、单克隆抗体制备等[2]方面，这为研究子宫内膜异位症的靶向治疗提供了新的方法。

本研究即在噬菌体展示基础上，以子宫内膜异位症患者的异位内膜为靶标，通过噬菌体展示的随机7肽库筛选子宫内膜异位症特异性结合多肽，鉴定筛选的阳性噬菌体的亲和性及特异性，并分析这些多肽的氨基酸序列，为研究多肽在子宫内膜异位症的早期诊断和治疗方面提供研究资料。

1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试剂：自美国New England Biolabs公司购买噬菌体随机7肽库，随机多样性为1.28×109，文库滴度为2×1013pfu/mL，大肠杆菌ER2738购自北京Biovector有限公司，HRP-抗M13单抗及M13K07购自上海Sangon biotech有限公司，鼠抗人细胞角蛋白19抗体购自北京中杉金桥公司，IV型胶酶、DNasel及DMEM/F-12购自美国Gibco公司，邻苯二甲酸二丁酯与环己烷购自北京Yiqiangsheng科技有限公司。

1.1.2 标本：本研究入选子宫内膜异位症III-IV期（按美国AFS分类）的育龄期女性。

总共有10位经手术和组织学确诊为子宫内膜异位症的患者被入选。

所有的在位/异位内膜标本均在增殖期通过诊断性刮宫/腹腔镜下囊肿剔除术获得，标本被分为两组：异位内膜组（n=10）和在位内膜组（n=10，来自同一个患者），患者在术前6个月内未接受过如GnRHa或性激素等的激素治疗。

1.2 方法
1.2.1 细胞来源：组织在无菌条件下获取后，用乳酸林格液湿润，再用PBS液清洗3-5次，立即低温储存在液氮中。

融化后组织经PBS液洗涤2次，剪碎至1mm3，1mg/mL的IV型胶酶于水浴摇床消化1小时，然后加入DNase1(15U/mL)继续消化30分钟，再分别经过100目和400目筛网，于4℃、800g离心5分钟，沉淀细胞即为子宫内膜间质细胞。

再用含15％FBs的DMEM/F-12重悬，于37℃、5%CO2培养箱中培养和传代，最后用鼠抗人细胞角蛋白19抗体鉴定子宫内膜间质细胞的纯度。

1.2.2 差减筛选：收集子宫内膜间质细胞，用1%BSA的DMEM无血清培养液重悬，将细胞数调整为1×107/mL。

取100μL在位内膜间质细胞，加入噬菌体10μL于4℃共同孵育2小时。

再加入200μL邻苯二甲酸二丁酯与环己烷组成的有机分离液，于4℃、10000g离心10分钟。

吸出水相里未结合的噬菌体，加入到100μL异位内膜间质细胞于4℃共同孵育3小时。

离心后取出沉淀物，加入200μL处于对数生长期的大肠杆菌ER2738，37℃孵育30分钟，复苏与异位内膜间质细胞结合的噬菌体。

对淘洗后的噬菌体进行扩增和纯化，再进入新一轮的差减筛选，如此重复5个循环，测定每一轮淘洗和扩增后的噬菌体数目和滴度。

1.2.3 ELISA：经过5轮生物淘洗后，随机挑选50个蓝斑进行阳性噬菌体克隆的鉴别，每个噬菌体克隆一式三份进行ELISA实验。

将细胞（异位/在位内膜间质细胞）接种入96孔板，每孔104过夜培养；4%多聚甲醛室温固定20分钟；封闭液封闭2小时；分别加入上述50个阳性噬菌体克隆（1010 pfu/孔），M13K07和阴性对照PBS，37℃孵育2小时；封闭液中加入HRP-抗M13单抗以1：6000稀释，室温孵2小时；最后加入TMB显色液200μL/孔，使用微板阅读器设置在450nm。

值大于0.5的共有13个1.2.4 DNA测序和BLAST匹配：经过ELISA实验，OD
450
噬菌体克隆被鉴别，提取这些噬菌体DNA，由上海Sangon biotech有限公司进行DNA测序，通过网络数据库进行BLAST匹配分析，再推导出多肽序列。

1.2.5 噬菌体竞争抑制试验：将异位内膜间质细胞接种入96孔板，每孔104过夜培养；无血清培养1小时；然后用封闭液37℃封闭2小时；PBS系列稀释（0、0.1、1、10、100、1000nM）合成的多肽RTRLHTR，并与细胞 4℃孵育 1
于4℃继续孵育1小时，封闭液中加入HRP-小时，再与2×1011 pfu噬菌体P
5
抗M13单抗以1：6000稀释，室温孵2小时；最后加入TMB显色液200μL/孔，使用微板阅读器设置在450nm，试验重复三次。

2 结果
2.1 差减筛选：本实验利用噬菌体7肽库以在位内膜细胞为吸附细胞，以异位内膜细胞为靶细胞，经过5轮差减筛选，产出噬菌体的数量（106pfu/mL）在研究1、2、3、4、5中分别为0.9±0.2，
3.3±0.6，8.2±1.2，1
4.2±1.2及26.9±
1.9，有显著性差异（P＜0.05）。

研究5中生物淘洗的浓度是研究1中的30倍。

2.2 ELISA：在实验中OD
值大于0.5的共有13个噬菌体克隆被选择，这13个内
450
值分别为0.61±0.05，0.63±0.04，0.56±0.05，0.72
异症相关的克隆其OD
450
±0.06，0.58±0.08，0.65±0.03，0.71±0.03，0.58±0.05，0.59±0.02，0.52±0.04，0.66±0.06，0.77±0.05及0.62±0.04（见图1），而对照组的
值为0.07～0.14，与子宫内膜异位症相关的克隆组比有显著性差异（见图OD
450
1）。

值大于0.5的共有13个子宫内膜异位症2.3 DNA测序：经过ELISA试验，其中OD
450
相关的噬菌体克隆被选出（P
2, P
5
, P
9
, P
11
, P
14
, P
17
, P
22
, P
24
, P
31
, P
34
, P
37
, P
45
,
P
46
）（见表1），提取这些噬菌体DNA，由上海Sangon biotech有限公司进行测序分析，结果显示13个噬菌体克隆中包含6个不同的氨基酸序列，其中DNA序列
为CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌体（P
5, P
9
, P
17
, P
34
, P
46
）被富集，其相应的
氨基酸序列为RTRLHTR。

表1.13个克隆的DNA序列
克隆DNA序列氨基酸序列频次P5 P9 P17 P34 P46CGCACCCGCCTGCATACCCGC RTRLHTR 5
P11 P14 P31CGCCCGCGCAAAATTAGCCGC RPRKISR 3
P2 P24CTGAGCCTGCGCAACACCCGC LSLRNTR 2
P22CGCCATCTGCCGCATCGCATT RHLPHRI 1
P37CCGCATCGCACCAACCGCAAA PHRTNRK 1
P45CGCCTGACCATTCCGACCAAA RLRIPTK 1
2.4 噬菌体竞争抑制试验：我们发现预先用合成多肽RTRLHTR处理后，噬菌体克隆P
5
与子宫内膜异位症细胞的结合能力随多肽剂量升高而降低。

相反，对照组多肽没有显示这种特异性结合活性，对照组多肽几乎无结合活性。

多肽RTRLHTR
在不同浓度（0、0.1、1、10、100及1000nM）其OD
450
值分别为0.64±0.04，
0.59±0.05，0.54±0.03，0.46±0.05，0.38±0.02及0.29±0.03，有显著性差异（P＜0.05）（见图2），多肽RTRLHTR浓度在1000nmol/L时能抑制50%的结合活性，然而对照组多肽无此效果（P＞0.05 见图2）。

另外多肽的浓度超过10nmol/L时，与对照组有显著性差异而低浓度（0，0.1，1nmol/L）时，与对照组无显著性差异。

2.5 细胞免疫组化：我们还用免疫组化法来证明生物素标记的多肽RTRLHTR是否能特异性结合到子宫内膜异位症细胞，在与其他细胞相比，我们发现生物素标记的多肽RTRLHTR能特异性结合子宫内膜异位症细胞。

其结合到子宫内膜异位症、宫颈癌、上皮性卵巢癌及正常子宫内膜细胞的结合率分别为1.32±0.05，0.66±0.08，0.49±0.06及0.23±0.04，有显著性差异（P＜0.05）。

3讨论
手术治疗是子宫内膜异位症治疗中较为有效的手段，然而其有不利的一
面，常导致卵巢皮质的丢失，卵巢功能的损害，以及较高的复发率。

药物治疗中GnRHa是治疗子宫内膜异位症的最有效的药物[3]，然而药物的作用是暂时的、保守性的、或是术前处理用的[4]，常伴随明显的副作用，这些都降低了患者的依从性。

究其原因主要是这些激素治疗缺乏选择性地作用于异位内膜细胞。

肿瘤靶向治疗是通过载体携带抗肿瘤药物，特异性作用于肿瘤细胞使其死亡，而不作用于肿瘤周围的正常细胞，成为肿瘤治疗的新途径[5]。

小分子多肽是一种理想的抗肿瘤靶向药物的载体，其结构简单，容易制备，且对肿瘤组织穿透力强，无免疫原性等优点[6]。

而噬菌体展示技术是一种生物学技术，能够快速筛选出与靶分子高亲和力的抗体或多肽配体，它最大的特点是实现了表型和基因型的结合[7]。

我们无需预先知道靶分子的结构信息，只要通过对靶分子有高亲和力的阳性噬菌体克隆的基因进行测序，就可间接推导出所递呈的外源多肽的氨基酸序列，这为研究子宫内膜异位症的发生发展、诊断及治疗提供新的方法。

目前在妇科领域，应用噬菌体展示技术，在体外已成功筛选出能与宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等肿瘤细胞特异性结合的多肽[8]。

国外也有学者曾报道过子宫内膜异位症的特异性结合肽的筛选[9]，国内尚无研究子宫内膜异位症的特异性结合多肽的筛选的文献报道。

本研究中，采用噬菌体展示技术联合体外快速差减筛选技术，筛选特异性结合到子宫内膜异位症细胞的多肽，不仅提高了筛选效率，而且减少了非特异性结合[10]。

经过5轮的差减筛选，噬菌体浓度从0.9±0.2到26.9±1.9，第五轮中生物淘洗的浓度是第一轮中的30倍，提示结合的噬菌体被富集了。

然后经过5轮差减筛选的50个蓝斑被随机选取，用于ELISA试验及DNA测序，结果显示有13
个噬菌体（P
2, P
5
, P
9
, P
11
, P
14
, P
17
, P
22
, P
24
, P
31
, P
34
, P
37
, P
45
, P
46
）包含6个
氨基酸序列，其中DNA序列为CGCACCCGCCTGCATACCCGC的噬菌体被富集，其相应的氨基酸序列为RTRLHTR，这提示了插入序列所编码的多肽可能具有与子宫内膜异位症特异性结合的潜能。

通过DNA测序结果发现序列RTRLHTR最具有潜在研究价值，我们通过噬菌体竞争抑制试验，一方面来观察在没有噬菌体衣壳蛋白的多肽与子宫内膜异位症细胞是否仍有特异性亲和力，另一方面观察多肽与其对应的噬菌体是否竞争结合同一结合位点。

化学合成多肽RTRLHTR后进行噬菌体竞争抑制试验，结果表明子宫内膜异位症细胞预先用多肽RTRLHTR处理后，再与噬菌体克隆P
5
结合的能力随多肽剂量增加而降低，说明没有噬菌体的多肽仍具有与子宫内膜异位症细胞特异性结合的能力。

免疫组化的结果也显示多肽RTRLHTR 能特异性结合到子宫内膜异位症异位内膜细胞，而不能特异性结合到其他肿瘤细胞及正常子宫内膜细胞，提示多肽RTRLHTR对子宫内膜异位症异位内膜细胞有较高的亲和性，为子宫内膜异位症细胞表面的特异性结合肽。

综上所述，我们利用噬菌体展示技术筛选并鉴定了一个新型多肽序列RTRLHTR，该多肽对子宫内膜异位症细胞有高亲和力，为药物靶向传递至这些异位内膜细胞提供候选。

这个多肽技术能被用于连接到包含脂质体的激素治疗，同样能改善激素对子宫内膜异位症治疗作用的特异性和有效性，对子宫内膜异位症相关激素治疗疗效的改善都有一定的作用，既能导致异位内膜细胞生长的抑制而又能明显降低全身副作用的发生，可能为子宫内膜异位症的早期诊断、复发及治疗提供新的方向。

本文标本数量有限，要进一步明确特异性结合肽与子宫内膜异位症的相关性并推广至临床尚需增大样本量。

另外仍有较多问题需
要进一步的研究，包括亲和力的改善，药代动力学的研究，以及多肽在活体动物上干预的应用等。

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