发酵实验室检测方法汇总

目录
GSH检测方法（酶法） (1)
GSH检测方法（普通法） (3)
S-腺苷蛋氨酸（SAM）检测方法 (4)
ATP和ADP检测方法 (6)
NADH和NAD+检测方法 (8)
葡萄糖检测方法 (10)
尿素检测方法 (11)
无机硒检测 (12)
有机硒检测 (14)
氧化性有关酶的酶活（GPx、CAT、SOD、MDA等）检测 (15)
己糖激酶测定方法 (16)
磷酸果糖激酶测定方法 (17)
丙酮酸激酶测定方法 (18)
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶测定方法 (19)
普鲁兰产量及其分子量 (20)
总糖的测定-硫酸蒽酮法 (22)
蔗糖检测方法 (23)
NH4+浓度测定（改良的Berthelot法） (24)
蛋白质含量测定-考马斯亮蓝方法 (25)
胞内pH（pHi）的测定 (26)
整理人：王玉磊（1-11）
杨波（12-15）
董颖颖（16-19）
余小六（20-26）
GSH检测方法（酶法）
原理
DTNB是一个由二硫键连接的带有两个苯环的化合物，，可以写成D-S-S-D，其中D代表苯环，在酶反应体系中存在如下反应：
G-S-H + D-S-S-D →G-S-S-D + DSH
G-S-H + G-S-S-D →G-S-S-G + DSH
谷胱甘肽还原酶的作用：
G-S-S-G + NADPH →2GSH + NADP+
其中，DSH在412 nm处有最大吸收峰。

当反应体系中有微量GSH或者GSSG，足量的DTNB、NADPH和谷胱甘肽还原酶酶活，循环反应可以一直进行下去，反应液的颜色会越来越深。

在反应开始的5 min中内，反应速率呈线性增加，并和体系内谷胱甘肽（包括氧化型和还原型）浓度成正比关系。

如果反应体系中不存在谷胱甘肽还原酶和NADPH，则只有最初的GSH能和DTNB反应，当GSH浓度很低时，生成的颜色物质基本不可测。

通过这样的循环反应，使得该方法可以检测到很低浓度的GSH，灵敏性和专一性强。

试剂
（1）125mM磷酸钠缓冲液，6.3mM EDTA，PH 7.5
配制方法：
Ⅰ.称取NaH2PO4.H2O(分子量138)22.25g，EDTA（分子量372.24）2.35g配成1L 溶液；
Ⅱ. 称取Na2HPO4.2H2O(分子量178)17.25g，EDTA（分子量372.24）2.35g配成1L溶液；
Ⅲ. 量取900mLNa2HPO4.2H2O溶液（pH约为7.9左右）加入试剂瓶，加入磁力拌器，边搅拌边慢慢加入NaH2PO4.2H2O溶液，直至pH达到7.5。

后者的用
量大约在100ml左右。

（2）6mM DTNB
称取23.8mg DTNB（分子量396.3，SIGMA D-8130），溶于10mL磷酸钠缓冲液中，4℃可稳定一个月。

每次用量100μL，可测约100个样。

（3）0.3mM NADPH（分子量833.4）
称取12.5 mg溶解于50mL磷酸钠缓冲液中，4℃稳定一星期。

每次用量700μL，可测70个样左右。

（4）50U/mL谷胱甘肽还原酶（GR）
如酶性质为：172U/mg蛋白，蛋白含量为9.8mg/mL，相当于1685.6U/mL酶液。

取30μL酶液加到970μL磷酸钠缓冲液即可。

每次用量10μL，可测约100个样。

所配制的酶液在4℃可稳定一个星期甚至更长时间。

操作步骤
在2mL体积的比色皿中顺序加入100μLDTNB，700μLNADPH和经适当稀释的样
品（25mL酒精萃取后的上清液稀释400倍:10μL+3990μL H2O）200μL。

室温下加入10μL谷胱甘肽还原酶启动反应，测量412nm处反应体系的初始OD值和反应3min后的OD值。

标准曲线
注意事项
（1）采用精确的微量移液器
（2）反应比色杯。

实验的样品只能一个个的测，用在普通分光光度计上的是4mL 比色皿，太大，必须用只有一半大（0.5 cm）厚的比色皿。

(3) 反应温度.严格来说，为保证重复性，应在25℃下进行反应，但是我们的分
光光度计不能恒温，因此每次都需要做标准曲线。

（4）反应时间需精确控制，否则会影响反应速率计算，产生较大误差。

（5）加入GR时，需要用封口膜把比色皿封起来
（6）样品中的GSH浓度尽可能低一些，否则反应速率太大，没法控制，所以稀释倍数要尽量大些
参考文献
Tietze, F., 1969. Enzymatic method for quantitative determination of monogram amounts of total and oxidized glutathione: application to mammalian blood and other tissue. Anal. Biochem. 29, 502-522.
GSH检测方法（普通法）
原理
DTNB与GSH反应产物D-S-H（D代表苯环）在412 nm处有最大吸收峰，在一定范围内，GSH的浓度与反应液的颜色成正比关系。

试剂
（1）DTNB溶液：50mM乙酸钠（M=136.08，含三个结晶水）、2mMDTNB（M=396.36）100mL溶液中含有：三水和乙酸钠0.6804g，DTNB 0.0793g。

（2）Tris-HCl溶液：1M三羟甲基胺基甲烷（M=121.14），pH 8.0
100mL溶液中含有：Tris碱12.114g，加浓HCl并稀释至pH=8.0。

操作步骤
针对细胞提取得到的样品，无需稀释即可直接检测：
0.2mLDTNB溶液+0.4mL Tris-HCl溶液+4mLH2O+500μL样品，于412nm处检测
吸光度值，对照标准曲线，得GSH含量。

标准曲线
注意事项
样品要最后加，加完样品后，在第0min，2min，4min时充分振荡。

参考文献
Tietze, F., 1969. Enzymatic method for quantitative determination of monogram amounts of total and oxidized glutathione: application to mammalian blood
and other tissue. Anal. Biochem. 29, 502-522.
S-腺苷蛋氨酸（SAM）检测方法
原理
HPLC法，利用C18色谱柱对SAM进行分离，分离后的SAM在254 nm处有最大吸收峰，SAM的浓度与峰面积成正比关系。

试剂
流动相配制（一级水配制）：
Ⅰ.0.5mol/L的甲酸铵（化学纯，用甲酸溶液调pH至4.0）溶液1L。

Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1.制样，10 mL发酵液离心取细胞沉淀，向沉淀中加10 mL 0.35 M稀硫酸，4 ℃
静置萃取 2 h，3500 r/min离心3 min，上清液经0.22μm膜过滤即得样品
（约需1 mL）
2.抽滤装置清洗：洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相，并进行抽滤（0.45 μm），同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声（10-20 min），除去空气
5.慢调流速至0.8 mL/min，待压力稳定后，平衡基线约1 h
6.进样
7.待全部样品检测完，清洗液相系统和色谱柱（先一级水冲洗约0.5 h-1 h，用
10%甲醇冲洗0.5 h-1 h，最后用纯甲醇冲洗约1 h）
HPLC检测条件
色谱柱：C18柱（4.6nm×250nm），
检测器：紫外检测器
流动相：0.5mol/L的甲酸铵溶液
流速：0.8mL/min
柱温：25℃
检测池温度：30℃
检测浓度的线性范围：0-0.5 g/L
标准曲线
0 300000600000900000120000015000000
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
020000004000000600000080000000
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
P e a k a r e a
P e a k a r e a SAM concentration/(g/L) SAM concentration/(g/L)
HPLC 分析SAM 浓度的外标曲线
SAM 发酵液样品的HPLC 图谱
注意事项
1. 在静置萃取的过程中要适时摇晃样品，使萃取更充分
2. 样品和流动相一定要经过微膜过滤，且流动相要经过超声处理
3. 操作过程中要留意系统压力变化
参考文献
李东阳, 于健, 田露, 等.利用重组Pichia pastoris 生产腺苷甲硫氨酸[J].生物工程
学报, 2002, 18(3): 295-299.
ATP和ADP检测方法
原理
HPLC法，ATP和ADP在固定相和流动相中分配系数不同，利用C18色谱柱可以实现二者的分离，进一步利用紫外检测器对分离后的二者的信号进行收集，在254 nm处有最大吸收峰，在一定范围内二者的浓度与峰面积成正比关系。

试剂
流动相配制（一级水配制）：
Ⅰ. PBS溶液（1.36 g KH2PO4加0.1 mol·L-1 NaOH溶液15.2 mL，用水稀释至100 mL，
pH 6.5）
Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1．制样，取5 mL发酵液，经4℃，8000 r·min-1冷冻离心10 min得到酵母泥，将湿细胞重新悬浮在5 mL 0.2 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）中，超声波破碎10 min（功
率22%，破碎10 s，间隔10 s），离心后得到的上清液经0.22μm膜过滤即得样品（约
需1 mL）
2.抽滤装置清洗：洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相，并进行抽滤（0.45 μm），同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声（10-20 min），除去空气
5.用一级水以0.8 mL/min流速冲洗柱子0.5 h，然后利用流动相平衡系统约1 h
6.进样
7.待全部样品检测完，清洗液相系统和色谱柱（先一级水冲洗约0.5 h-1 h，用10%
甲醇冲洗0.5 h-1 h，最后用纯甲醇冲洗约1 h）
HPLC检测条件
色谱柱：C18柱（4.6nm×250nm），
检测器：紫外检测器
流动相：0.01 M PBS溶液
流速：0.8mL/min
柱温：35℃
检测浓度的线性范围：0-50 mg/L
标准曲线
ATP
050000
100000150000200000250000
3000003500000
10
20
30
40
50
60
ATP浓度（mg/L）
峰面
积
ADP
0100000
200000300000400000500000
6000007000000
10
20
30
40
50
60
ADP浓度（mg/L）
峰面积
HPLC 分析ATP 、ADP 浓度的外标曲线
注意事项
检测ATP 和ADP 浓度的流动相为缓冲盐，因缓冲盐与有机溶剂混合易形成细小沉淀，造成系统或者柱子的堵塞，因而在检测前和检测后必须用一级水对整个系统进行彻底的冲洗。

参考文献
Sato K, Yoshida Y , Hirahara T, Ohba T. On-line measurement of intracellular ATP of Saccharomyces cerevisiae and pyruvate during sake mashing [J]. J. Biosci. Bioeng ., 2000, 90(3): 294-301
NADH和NAD+检测方法
原理
HPLC法，NADH和NAD+在固定相和流动相中分配系数不同，利用C18色谱柱可以实现二者的分离，进一步利用紫外检测器对分离后的二者的信号进行收集，在254 nm处有最大吸收峰，在一定范围内二者的浓度与峰面积成正比关系。

试剂
流动相配制（一级水配制）：
Ⅰ. 10.93 g NaH2PO4和3.04 g Na2HPO4溶于水中，加入四丁基溴化铵3.22 g，调节pH 为6.5，真空抽滤后定容至1 L，按86:14（v·v-1）比例和乙腈混合Ⅱ.10%的甲醇(HPLC级)溶液200mL
操作步骤
1．制样，取5 mL发酵液，经4℃，8000 r·min-1冷冻离心10 min得到酵母泥，将湿细胞重新悬浮在5 mL 0.2 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）中，超声波破碎10 min，离
心后得到的上清液经0.22μm膜过滤即得样品（约需1 mL）
2.抽滤装置清洗：洗衣粉清洗一次→一级水润洗两次→烘干备用
3.准确配置流动相，并进行抽滤（0.45 μm），同时抽滤一瓶一级水
4.对流动相进行超声（10-20 min），除去空气
5.用一级水以0.8 mL/min流速冲洗柱子0.5 h，然后利用流动相平衡系统约1 h
6.进样
7.待全部样品检测完，清洗液相系统和色谱柱（先一级水冲洗约0.5 h-1 h，用10%
甲醇冲洗0.5 h-1 h，最后用纯甲醇冲洗约1 h）
HPLC检测条件
色谱柱：C18柱（4.6nm×250nm），
检测器：紫外检测器
流动相：见试剂
流速：0.8mL/min
柱温：35℃
检测浓度的线性范围：0-50 mg/L
标准曲线
NAD+
0100000
200000300000400000
5000006000000
10
20
3040
50
60
NAD+（mg/L）
峰面
积
NADH
050000
100000150000200000250000
3000003500004000000
10
20
3040
50
60
NADH（mg/L）
峰面积
HPLC 分析NADH 、NAD+浓度的外标曲线
参考文献
Miseta A, Tökés-Füzesi M, Aiello D P, Bedwell D M. A Saccharomyces cerevisiae mutant unable to convert glucose to glucose-6-phosphate accumulates excessive glucose in endoplasmic reticulum due to core oligosaccharide trimming [J]. Eukaryot. Cell , 2003, 2(3): 534-541
葡萄糖检测方法
原理
DNS与还原性糖在共沸条件下，生成的物质在520 nm处有最大吸收峰，且在一定范围内吸收峰的强度（OD值）与还原糖浓度成线性关系。

试剂
DNS：
甲液:溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g NaHSO3。

乙液：称取255g酒石酸钾钠，加到300mL10%NaOH中，再加入880mL 1%的3，5-二硝基水杨酸。

甲、乙液混合得黄色试剂，贮存于棕色瓶中，室温放置7-10天后备用。

操作步骤
0.04mL样品+1.96mL水+1.5mLDNS+→沸水浴五分钟，冷却至室温并定容至25mL→520nm 处检测OD值
浓度范围0-0.5 g/L
标准曲线
葡萄糖母液1g/L：称取0.1160g葡萄糖，溶于100mL去离子水。

参考文献
Miller G. Use of 3,5-dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars [J].
Anal. Chem., 1959, 31: 426-428
尿素检测方法
原理
二乙酰一肟显色法
试剂
酸性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml 及85%磷酸66ml，冷却至室温，加入硫氨脲50mg 及硫酸镉（CdSO4.8H2O）2g ，溶解后用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年；
二乙酰一肟溶液：称取二乙酰一肟20g ，加蒸馏水约900ml，溶解后，再用蒸馏水稀释至1L，置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年不变；
尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW=60.06）0.6g ，溶解于水，并稀释至100ml，现配现用。

尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。

操作步骤
空白管：蒸馏水0.02ml + 二乙酰一肟0.5ml + 酸性试剂5ml ；
检测管：样品0.02ml + 二乙酰一肟0.5ml + 酸性试剂5ml ；
混匀后，置沸水浴中加热12min ，取出，置冷水中冷却5min后，用分光光度计波长540nm，比色杯光径1.0cm，以空白管调零，读取测定管吸光度。

浓度范围
0-10 mmol/L
标准曲线
参考文献
叶应妩, 王毓三. 全国临床检验操作规程（第二版）[M]. 南京: 东南大学出版社, 1997, 260- 261.
无机硒检测
原理：Se能够催化氯酸钾氧化苯肼生成偶氮离子，继而与变色酸偶合成红色偶氮染料，生成的红色偶氮染料的吸光度与一定浓度范围的硒成正比，因而可利用催化吸光光度法测定硒酵母中的硒含量。

试剂：变色酸：0.03mol/L，称取变色酸1.0930g，定容至l00ml。

盐酸苯肼：0.03mol/L，称取0.4400g盐酸苯肼，定容至100ml。

EDTA：0.02mol/L，称取EDTA 钠盐0.7450g定容至100ml。

氯酸钾：0.6mol/L，称取7.3500g氯酸钾．定容至100ml。

HCI—KC1缓冲液：0.2mol/L ，取浓盐酸2.50ml稀释至150ml；再取氯化钾2.2500g，定容至150ml，两者混匀。

亚硒酸钠标液：称取亚硒酸钠0.08167g，定容至500ml，然后再稀释500倍
操作步骤：取10 mL发酵液，3500 r/min离心10 min收集菌体，蒸馏水离心洗涤3次。

将湿菌体悬浮于5 mL去离子水中，沸水浴30 min，离心，测定上清液中硒的浓度。

向25 mL比色管中依次加入乙二氨四乙酸二钠（EDTA-2Na）溶液1 mL、HCl-KCl缓冲液2 mL、氯酸钾2 mL、变色酸2 mL、盐酸苯肼1 mL和待测样品2 mL，混匀，在沸水浴中加热20 min，于冷水中迅速冷却后，利用酶标仪测定520 nm下吸光值。

标准曲线：
有机硒检测
原理：Se2-+2H+ H2Se 将H2Se通过载气（氩气）导入石英炉进行测定。

操作步骤：
Ⅰ.样品的消化
取5 mL发酵液，在3500 r/min下离心10 min，蒸馏水离心洗涤3次，收集湿菌体。

将湿菌体置于小烧杯中并加入混合酸（浓HNO3 : 浓HClO4 = 4:1)10 mL，加热直到溶液上面有滚滚白烟时停止加热，此时溶液变成无色，冷却后，定容至100 mL待测。

Ⅱ.样品检测
采用氢化物原子荧光光谱法。

称取0.5 g～2 g（精确至0.001 g）试样，液体试样吸取1.00 mL～10.00 mL，置于消化瓶中，加10.0 mL混合酸及几粒玻璃珠，盖上表面皿冷消化过夜。

次日于电热板上加热，并及时补加硝酸。

当溶液变为清亮无色并伴有白烟时，再继续加热至剩余体积2 mL左右，切不可蒸干。

冷却，再加5.0 mL盐酸，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，将六价硒还原成四价硒。

冷却，转移至50 mL容量瓶中定容，混匀备用。

同时做空白试验。

吸取10.0 mL试样消化液于15 mL离心管中，加盐酸2.0 mL，铁氰化钾溶液1.0 mL，混匀用原子荧光光谱仪检测。

氧化性有关酶的酶活（GPx、CAT、SOD、MDA等）检测
原理
GPx：谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢（H2O2）与还原型谷胱甘肽（GSH）反应生成H2O及氧化型谷胱甘肽（GSSG），谷胱甘肽过氧化物酶的活力可以利用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。

CAT：过氧化氢酶（CAT）分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速终止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm处测定其生成量，可计算出CAT的活力。

SOD：采用经典的氮蓝四唑（NBT）显色法。

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜，后者在560nm处有强吸收。

而SOD可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。

反应液蓝色愈深，说明超氧化物歧化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。

据此通过比色分析就可以计算出超氧化物歧化酶活性水平。

MDA：丙二醛在较高的温度下可与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应，形成红色的MDA-TBA 加合物，该加合物在535 nm处有最大吸收峰，据此可以通过比色法进行MDA的检测。

相关操作步骤及其它，请详见各检测试剂盒。

己糖激酶测定方法
原理 D-葡萄糖+ATP→6-磷酸葡萄糖+ADP
6-磷酸葡萄糖+NADP+→6-磷酸葡萄糖酸盐+NADPH
反应体系：100 mM Tris-buffer(pH 7.6) 1.0 ml
500 mM D-葡萄糖0.4 ml
250 mM MgCl20.12 ml
36 mM ATP 0.8 ml
10 mM NADP 0.3 ml
H2O 0.08 ml
细胞破碎液0.1 ml
酶活测定在37℃恒温下进行。

用分光光度计于340 nm下每隔30 s读取一次吸光值（A），共读取3 min。

以A对时间作图，取反应最初线性部分计算酶活。

注意事项最后加细胞破碎液，之后立即混匀放入分光光度计中测定。

酶活定义 1个酶活单位表示为在1分钟内该酶催化形成产物的微摩尔数。

参考文献Barnard E A. Hexokinase from yeast [J]. Methods Enzymol, 1975, 42: 6-20.
原理果糖-6-磷酸+ATP→果糖-1,6-二磷酸+ADP
磷酸烯醇式丙酮酸+ADP→丙酮酸+ATP
丙酮酸+NADH→乳酸+NAD
反应体系：0.2 mM NADH 0.1 ml
0.1 M Tris-buffer(pH 7.6) 0.1 ml
8 mM MgCl20.1 ml
0.1 M 葡萄糖-6-磷酸0.1 ml
1 mM ATP 0.
2 ml
2.7 U/ml 醛缩酶0.2 ml
4.7 U/ml 甘油磷酸脱氢酶0.1 ml
2.5 mM 二硫苏糖醇0.1 ml
细胞破碎液0.1 ml
酶活测定在37℃恒温下进行。

用分光光度计于340 nm下每隔30 s读取一次吸光值（A），共读取3 min。

以A对时间作图，取反应最初线性部分计算酶活。

注意事项最后加细胞破碎液，之后立即混匀放入分光光度计中测定。

酶活定义 1个酶活单位表示为在1分钟内该酶催化形成产物的微摩尔数。

参考文献
Zhang J, Fu R Y, Hugenholtz J, et al. Glutathione protects Lactococcus lactis against acid stress [J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 5268-5275.
原理磷酸烯酮式丙酮酸+ADP→丙酮酸+ATP
丙酮酸+NADH→L-乳酸+NAD+
反应体系：0.1 M Tris-buffer(pH 7.6) 0.82 ml
0.5 M KCl 0.02 ml
0.25 M MgCl20.01 ml
0.01 M 磷酸烯醇式丙酮酸0.05 ml
0.1 M ADP 0.05 ml
0.01 M NADH 0.02 ml
1500 U/ml 乳酸脱氢酶0.02 ml
酶活测定在37℃恒温下进行。

用分光光度计于340 nm下每隔30 s读取一次吸光值（A），共读取3 min。

以A对时间作图，取反应最初线性部分计算酶活。

注意事项最后加细胞破碎液，之后立即混匀放入分光光度计中测定。

酶活定义 1个酶活单位表示为在1分钟内该酶催化形成产物的微摩尔数。

参考文献
Reibstein D, Hollander J A, Pilkis S J, et al. Studies on the regulation of yeast
phosphofructo-1-kinase: its role in aerobic and anaerobic glycolysis [J].
Biochemistry, 1986, 25(1): 219-227.
γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶测定方法
原理
有机物经酸氧化分解，使磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，此化合物经过对苯二酚，亚硫酸钠还原成蓝色化合物—钼蓝。

用分光光度计在波长660 nm处测定钼蓝的吸光值，以测定磷的含量。

标准曲线测定：25 mM ATP 0.1 ml
100 mM 谷氨酸0.1 ml
1 g/L 牛血清蛋白0.05 ml
0.032 M 磷酸二氢钾0 10 20 30 40 50
H2O 625 615 605 595 585 575
0.1 M Tris-HCl(pH 8.0) 25 μl
0.1 M L-氨基丁酸100 μl
37℃放置半小时，后加入125 μl三氯乙酸（10%）终止反应。

然后加入1.6%的钼酸铵与1%的硫酸亚铁的混合溶液（其中前者的用量为1000 μL，后者的用量为400 μL），加去离子水定容至10 mL。

用分光光度计于660 nm下读取吸光值。

样品测定时，直接加入100 μl细胞破碎液代替磷酸二氢钾溶液。

注意事项
钼酸铵需用15%的硫酸配置；钼酸铵与硫酸亚铁需单独配置，在加之前混合，混合均匀后再用，且先用现配。

酶活定义1个酶活单位表示为每毫克蛋白释放的磷（Pi）的微摩尔数。

参考文献
Kenchappa R S, Ravindranath V. γ-Glutamyl cysteine synthetase is up-regulated during recovery of brain mitochondrial complex I following neurotoxic insult in mice [J].
Neurosci Lett, 2003, 350(1): 51-55.
普鲁兰产量及其分子量
1.分批发酵中取样方式
用不同不同规格的注射器取样品，取样时间点通常是0 、6、9、12、18、24、30、
36、42、48、54、60、66、72。

2.发酵液的处理用于检测常规非活性指标
取发酵液20ml，80℃加热20min，于12000rpm室温（25-30℃）离心20min。

3.生物量和普鲁兰产量
将离心所得菌体沉淀于70℃烘箱烘干至恒重（36h-48h），称量得生物量。

取离心所得上清液10ml，加入2倍体积无水乙醇沉淀，4℃过夜（12h or so），于4℃12000rpm离心10min，弃去上清，留多糖沉淀于70℃烘箱烘干至恒重（36h-48h）。

参考文献：江南大学博士普鲁兰的发酵及改性研究
4. 分子量的估计
分子量用粘均分子量来表示,具体如下：
取5ml 上清加入加入水稀释,具体的体积因样品点而异；一般除6h 、9h 点加10ml 水外，其余点加水25ml （20ml ）；充分摇匀，得到稀释后的多糖溶液。

分子量估计方法：
配制试剂：配制0.05M 和0.15M 的无水硫酸钠溶液用于稀释在乌氏粘度计中的样品；无水硫酸钠分子量142。

在30℃恒温下，取10ml 稀释后的多糖溶液，加入乌氏粘度计，同时加入5ml 0.15M 硫酸钠溶液，用洗耳球充分混匀，根据具体情况（流出时间在110-200秒内比较好）继续加入一定体积的0.05M 的硫酸钠溶液，用秒表记录流出时间。

然后用多糖浓度数据和流出时间计算分子量。

具体计算如下：
若约定纯溶剂的粘度为η0,同温度下溶液的粘度为η。

定义如下参数： 1.相对粘度： 2.增比粘度： 3.比浓粘度： 一点法通用式： 然后根据公式：
η单位dL /g 。

参考文献
高分子物理；网络资源（ppt ，武汉百特纯）；
Roukas, T., & Biliaderis, C. G. (1995). Evaluation of carob pod as a
substrate for pullulan production by Aureobasidium pullulans . Applied Biochemistry and Biotechnology, 55, 27–44.
Stephen E. Harding, Kjell M. Vårum, Bjørn T. Stokke and Olav Smidsrød(1991).
Molecular weight determination of polysaccharides. Advances in Carbohydrate Analysis, 1, 63-144.
η/ηηr =10
-=-=
r sp ηηηηηC
ηC ηr sp 1
-=
[]C
r sp )
ln (2ηηη-=
总糖的测定-硫酸蒽酮法
原理
糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

浓度范围小于0.1 g/L
试剂
A.蒽酮试剂：称取200mg蒽酮溶于100ml 98%的浓硫酸，即配即用（使用硫酸注意安全操作）；
B. 0.1g/l葡萄糖标准液（灵敏度比DNS法高）。

标准曲线
各管加入蒽酮试剂后立即混匀迅速置于冰浴中；待各管都加入蒽酮试剂后，同时置于沸水浴中，准确加热7min，立即取出，冰浴中迅速冷却，待各管达室温后，以第一管（水也可以）为空白，于620nm处迅速测定各管OD值。

参考文献
梁丽军,曾哲灵,熊涛，吕伟(2008). 蒽酮—硫酸法测定大蒜多糖含量. 食品科学,29,499-502.
蔗糖检测方法
试剂
（1）DNS：
甲液:溶解6.9g苯酚于15.2mL10%NaOH中，并稀释至69mL，在此溶液中加入6.9g NaHSO3
乙液：称取255g酒石酸钾钠，加到300mL10%NaOH中，再加入880mL1%的3，5-二硝基水杨酸。

甲、乙液混合得黄色试剂，贮存于棕色瓶中，室温放置7-10天后备用。

（2）6M HCl：60mL浓盐酸+56mL水
（3）6M NaOH：24g氢氧化钠+100mL水
操作步骤
(1) 1mL糖（样品：稀释50倍-20μL样+980μL水）+ 0.2mLHCl→先沸水浴
十分钟，在冷水浴冷却至室温
(2)在上述液体中加入0.2mLNaOH，振荡30秒，中和多余的酸，再加入DNS试
剂，沸水浴五分钟，冷水浴冷却至室温，定容至25mL，测520nm处OD
值。

标准曲线
配制1.0g/L的蔗糖溶液作为母液
NH4+浓度测定（改良的Berthelot法）
试剂
溶液A：10g/l苯酚+10mg/l亚硝铁氰化钠；
溶液B：90g/l Na2HPO4·12H2O + 6g/l NaOH + 10ml NaOCl
操作步骤
0.2 ml样品+4 ml 溶液A + 4 ml溶液B（注意顺序：先加入200ul样品,加入
A液后,混匀;加入B液后再混匀）。

37℃保温反应30 min，测定OD630nm 浓度范围小于0.1 g/L
标准曲线
参考文献
E. D. Rhine, G. K. Sims, R. L. Mulvaney, and E. J. Pratt(1998). Improving the
Berthelot Reaction for Determining Ammonium in Soil Extracts and Water.
Soil Sci. Soc. Am. J., 62, 473-480 .
蛋白质含量测定-考马斯亮蓝方法
试剂
Ａ．考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml（配制好用滤纸过滤）；
B．标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经凯氏定氮法测定蛋白质氮含量。

根据其纯度用0.15mol/l NaCl（约0.9%生理盐水）配制成1.0mg/ml蛋白质溶液；标准曲线
摇匀，1小时内以0管为空白对照。

在595nm处比色（5-20min内测）。

参考文献
赵英永，戴云，崔秀明，张文斌，马妮（2006）. 考马斯亮蓝G-250染色法测定草乌中可溶性蛋白质含量. 云南民族大学学报(自然科学版),15,235-237.
李志江（2008）. G250染色法测定啤酒中蛋白质含量.酿酒，35，70-71.
胞内pH（pHi）的测定
原理
激发所产生的荧光强度，随pH变化而变化；其根本原因是因pH不同，荧光物质的解离状态不同，不同的解离状态具有不同的荧光能力。

药品
5-FAM，5-cFDA(水相里易分解，不稳定)，两性霉素B，二甲亚砜（其作为溶剂，但有点伤及细胞，因此，所配置溶液较浓）。

操作步骤
1.取-70℃冰冻含细胞发酵液，于30℃，200rpm下，融化复活90-120min。

2.稀释，使细胞浓度为OD620nm=0.6-0.8之间（细胞越新鲜越有活力越好；选取适中浓度发酵液直接稀释使其在上述范围内，然后统一个稀释倍数即可）。

3.透性细胞的制备
a．用终浓度5mg/l的两性霉素B制备透性细胞，于30℃，200rpm下，孵育60min。

使用的缓冲液pH=7.4（偏碱性使两性霉素B最好的发挥作用）。

b．将孵育后的细胞悬液，离心（10000rpm，4℃，10min）得到细胞沉淀，用不同pH的缓冲液复溶（pH4-8，如4、5、5.4、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、
6.8、
7.0、7.4、
8.0）；然后加入终浓度为0.2umol/l的5-羧基荧光素（5-FAM），
于30℃，200rpm下，平衡30min（最好在避光条件下进行）。

平衡好后置于
黑暗冰浴中，待测。

4.样品处理
a．细胞用pH=4.0（背景噪声小，以为荧光物质在低pH荧光能力弱，同时让cFDA呈更多的非解离形式易于进入细胞，此外，死细胞无维持
pH的能力，这样可以排除死细胞的影响）的缓冲液稀释至OD620nm=0.6-0.8。

加入终浓度为30-50umol/l的羧基荧光素二乙酸酯（cFDA）;于30℃，200rpm
下孵育>=60min。

b．的细胞悬液，离心（10000rpm，4℃，10min）得到标记细胞，用pH=4.0缓冲液洗洗，用同体积缓冲液重悬，置于黑暗冰浴中，待测。

激发谱：在发射波长Em=517nm，激发扫描400-500nm(苏大分析中心操作步骤：做
激发谱时，第一个标签下填Ex=220.Em=517；第二个标签下选择激发扫描波段400-500nm)。

做完激发谱后数据需要进行Data Correction，在发射谱时不需要，进行一次数据上升一个数量级。

发射谱：在激发波长Ex=490/435nm,发射扫描500-600nm(苏大分析中心操作步骤：做激发谱时，第一个标签下填Ex=490/435，Em=800；第二个标签下选择
激发扫描波段500-600nm)。

数据处理：在进行胞内pH测定时，主要是利用激发谱的数据。

扫描所得的数据是比较锯齿的，需要进行润滑（相关软件和方法，人工神经网络工具比较
好的对数据进行润滑模拟，matlab ANN工具箱）。

根据发射谱数据，找出
435nm和490nm处的荧光强度，计算Ratio=I490nm/I435nm。

将Ratio和pH做
标线。

（在pH=5.0左右，扫描基本上是很难看到峰出现的，因为当pH=5.0
左右时，峰值I490nm和低值I435nm接近，所以没有峰出现，也是正常的，说
明pH就是不高。

数据显示pH=5.0，R=1.2around;pH=6.0, R=4.8around;
pH=7.0, R=8.8around.）。

缓冲系统：柠檬酸/磷酸氢二钠，此缓冲盐范围宽
配置好0.2M的磷酸氢二钠，0.1M柠檬酸，按照配方表配制不同pH的缓
冲盐（缓冲能力与体系浓度和所需pH与pKa的差异有关；同时，也需要
用校准的pH计去测定一下，以防理论值与实际值有较大的偏离）。

参考文献
刘树臣，谢澜漪，李春，曹竹安（2004）.热带假丝酵母细胞内 pH的测定及其与生长代谢活性的关系. 生物工程学报,20,279-282.
董建军,史媛英,贾士儒(2004).胞内pH 法评价酵母活性的研究.酿酒，31,66-67.
Henrik Siegumfeldt, K. Björn Rechinger and Mogens Jakobsen(2000).
Dynamic Changes of Intracellular pH in Individual Lactic Acid
bacterium Cells in Response to a Rapid Drop in Extracellular pH.
Applied and Environmental Microbiology,66,2330–2335.
D. Bracey, C.D. Holyoak, G. Nebe-von Caron, P.J. Coote(1998)
Determination of the intracellular pH (pH i ) of growing cells of Saccharomyces cerevisiae:the effect of reduced-expression of the membrane H+-ATPase. Journal of Microbiological
Methods,31,113–125.。