产甲烷菌菌落特性及分子生物学研究

马氏甲烷球菌
甲酸甲烷杆菌
E巴u氏rya甲rc烷h八ae叠ot球a 菌
†产甲烷菌的分类
METHANOGEN
Euryarchaeota
†产甲烷菌显著影响因子
微量元素
微量元素缺乏会导致VFA高，气 体产率下降。 对毒性物质具有拮抗作用 使反应器内优势菌种发生变化 使乙酸利用率提高数倍。
METHANOGEN
METHANOGEN
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
RFLP分析
物种I
7.6kb
HapⅠ
METHANOGEN
I 杂合子 II
13kb
13kb
物种II
7.6kb
分子探针 Southern印迹杂交
DNA剪辑序列基因点突变、易位、倒位、缺失和转座等产生的改变会导致限
制性内切酶(RE)的识别位点发生变化，进而使得部分具有同源序列的限制性
繁殖培养 纯化分离 纯度检验 菌种保存
碳源、氮源、维生素、微量元素、还原剂、指示剂 培养基配好后先煮沸数分钟 厌氧操作箱中进行接种操作，充入体积比4:1的H2/CO2 培养10天后，重复上述过程四次。
滚管分离 在荧光显微镜下标记产甲烷菌菌落，在厌氧操作箱中挑取菌落。
涂片染色检验 滚管观察 在荧光显微镜下观察看其是否有蓝绿色荧光 进行沼气发酵试验看其是否产生沼气
硫酸盐
硫酸盐还原细菌和产甲烷细菌存 在竞争关系，二者都以氢、乙酸、 乳酸等为电子供体。 硫化氢致害浓度为50 mg·L-1，驯 化后的500 mg·L-1。
最适pH值6.8 ~ 7.4 pH值的变化可引起微生物体表面 的电荷变化，影响培养基中有机 化合物的离子化作用 酶只有在最适宜的pH 值时才能发 挥最大活性。
1950 美国
R. E .Hungate 发明厌氧培养技术
1967 Bryant 采用改进Hungate 技术纯化产甲烷菌
1972 三阶段理论
1974 Bryant首次 提出了产甲烷菌 (Methanogen)一词
更先进的技术 更完善的体系
……
Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
1
专性厌氧 •-320mV下正常生长 • -160mV 下生长缓慢 • 遇氧停止生长甚至死亡
METHANOGEN
荧光原位杂交
荧光原位杂交((Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)是目前单个细胞 水平上分析微生物群落结构的常用分 子生态学方法。用荧光标记探针，原 位鉴定单个细胞, 可原位分析它们的 空间及数量分布。
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
PCR-DEEG
16S rRNA的基因是细菌的系统分类研究中最有用 的和最常用的分子钟，其种类少，含量大(约占细 菌RNA含量的80％)，分子大小适中，存在于所有 的生物中 ，既能体现不同菌属之间的差异，又能 利用测序技术较容易地得到其序列，故而被普遍 用来菌种分析与鉴定过程中。
探针和靶核酸的不同，杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA (核糖核酸)杂
交，RNA –RNA杂交3类
•原位杂交
RNA
DNA
复性
•菌落杂交 •Southern 印迹杂交 •斑点印迹杂交 •狭线印迹杂交
•荧光原位杂交
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
核酸探针杂交技术
能快速，能灵敏地探测出环境微生物中特殊的核酸序列 定性、定量分析微生物的存在、分布、丰度和适应性等
片段大小发生变化，并在凝胶电泳中表现为不同的电泳迁移率。对每个DNA、
RE组合来说，所产生的片段是特异的。
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
RFLP分析
设计适当的扩增引物，使扩增片段包括某一个或数个限制性内切酶识别序列， 在PCR扩增后用该限制酶切割PCR产物；应用特定的核酸内切限制酶切割有 关的DNA 分子，经过电泳，原位转膜印迹，探针杂交，放射性自显影后， 分析与探针互补的DNA 片段在长度上的简单变化。
Methanococcus maripaludis C5 海沼甲烷球菌
PCR-DEEG
变性梯度凝胶(DGGE)和温度梯度凝 胶(TGGE)：在聚丙烯酰胺中加入甲 酰胺(DGGE) ，从正极到负极梯度递 加，或是形成温度梯度(TGGE )。电 泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度 或温度时，双链部分解开，造成泳动 速度发生变化，从而达到分离效果。 而且染色后的凝胶用成像系统分析。 PCR-DEEG可以半定量地测定样品 DNA浓度的大小，反映微生物群落组 成的变化。
它可以在群落水平上提供几乎无穷尽的、反映基因型多样性的可靠证据，可 作为一种能高度灵敏检测污染环境下微生物种群变化的方法。
由于16S rDNA的限制性片段长度多态性(RFLP)分析(ARDRA)所产生的片段多，分
析起来工作量大。人们又在此基础上发展了一种高效、灵敏的方法末端标记限制性
片段长度多态性分析(T-RFLPs )。该方法在用通用引物PCR扩增16SrDNA时，在其
4:1的H2/CO2 ，放置在4℃保存 用悬浮液冷冻保存法保藏产甲烷菌
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
核酸探针杂交技术
METHANOGEN
利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针；探针可
以是长探针(100 ~ 1000 bp)，也可以是短的寡核苷酸(10 ~ 50 bp)。根据所用的
METHANOGEN
产甲烷菌菌落特性及 分子生物学研究
Euryarchaeota
内容
METHANOGEN
1
厌氧发酵微生物概述
2 产甲烷菌分类及代谢途径
3
产甲烷菌富集与纯化
4
微生物群落研究方法
5
分子多样性研究
Euryarchaeota
†厌氧发酵微生物概述
METHANOGEN
不产
基质分解菌群
纤维素降解细菌 半纤维素降解细菌 淀粉降解细菌 脂肪降解细菌
pH值
产甲烷菌最适宜的Eh为-350 mV 或更低，过高则停止生长甚至死 亡。 中温Eh 应低于-300~-380 mV 高温厌氧消化系统-500~-600 mV
氧化还原电位(Eh)
Euryarchaeota
†产甲烷菌富集与纯化方法
METHANOGEN
样品采集
水沉积物、沼泽、苔原、稻田、瘤胃、盲肠、地热温泉等
†厌氧发酵微生物的发展史
1868 Bechamp 甲烷形成是微生物 学过程
1899 俄国 奥姆良 将厌氧分解纤的 微生物分为两类 1916奥氏甲烷杆菌
1901荷兰 Sohngen氢和二 氧化碳的混合气 能发酵成甲烷
METHANOGEN
1901-1903年巴斯 德研究所的Maze 马氏甲烷球菌.
1936 H A Barker 发现沼气发酵分为 产酸和分解酸形成 甲烷两个阶段
PCR-SSCP
DNA 的突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中的 构象不同（单链构象多态性），利用迁移率的差别可使各种序列不同的单链分离开来。
实时荧光定量PCR
荧光标记引物
上游 3' 引物 5'
R
Q
5' 下游 3' 引物
Euryarchaeota
†菌株的系统分类学分析方法
CO2 + H2 → CH4 + 2H2O 4CH3OH → 3CH4 + CO2 + 2H2O CH3COO- + H2O → CH4 + HCO3-
ΔG′0= -131 kJ ΔG′0= -319 kJ ΔG′0= -31 kJ
Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
颗粒污泥外观特征
METHANOGEN 颗粒污泥表面的菌群
中一条引物的5’末端用荧光素进行标记，对标记了的末端片段进行多态性分析。这
种方法有效而快速。
Euryarchaeota
†微生物群落研究方法进展
METHANOGEN
RAPD分析
利用随机引物对目的基因组DNA进行PCR扩增，产物经电泳分离后显色，分析扩增产 物DNA片段的多态性，此即反应了基因组相应片段由于碱基发生缺失、插入、突变、重 排等所引发的DNA多态性。
Euryarchaeota
†产甲烷菌的基因组特征
目 Order 甲烷杆菌目 Methanobacteriales 甲烷球菌目 Methanococcales
甲烷火菌目 Methanopyrales 甲烷八叠球菌目 Methanosarcinales
甲烷微菌目 Methanomicrobiales
甲烷胞菌目 Methanocellales
制备感受态大肠杆菌
Euryarchaeota
†产甲烷菌的基因组特征
METHANOGEN
产甲烷菌基因组大小一般介于1.6×106~5.7×106 bp之间 甲烷杆菌目、甲烷球菌目和甲烷火菌目的基因组均为1.7×106 bp左右。 甲烷八叠球菌目的基因组大小有较大差异，长度在3.4×106 bp、5.7×106 bp，
科 Family 甲烷杆菌科 Methanobacteriaceae
甲烷球菌科 Methanococcaceae
甲烷火菌科 Methanopyraceae 甲烷八叠球菌科 Methanosarcinaceae
甲烷鬃毛状菌科 Methanosaetaceae 甲烷微菌科 Methanomicrobiaceae 甲烷规则菌科 Methanoregulaceae 甲烷螺菌科 Methanospirillaceae 甲烷胞菌科 Methanocellaceae
也有的基因组大小仅为2.2×106 bp。 甲烷微菌目和甲烷胞菌目的基因组大小在2.8×106~3.5×106 bp之间。
产甲烷菌的基因组一般由一条环状染色体组成,也有一些产甲烷菌除了含一条 染色体之外，还存在环状染色体外元件ECE，而且染色体和ECE 的GC 含量 有较大差别
产甲烷菌基因组的GC 含量在30%~65%之间，这与产甲烷菌 所生存的环境有密切的关系，产甲烷菌生长所处的环境温度 越高，一般GC 含量也越高。值得注意的是，甲烷球菌目的 菌株GC 含量均较低，基本介于30%~35%
种
Genus 热自养甲烷热杆菌
Methanothermobacter thermautotrophicus str. Delta H 马堡甲烷热杆菌
Methanothermobacter marburgensis str. Marburg 詹氏甲烷球菌
Methanococcus jannaschii DSM2661 海沼甲烷球菌
产琥珀酸丝状菌 溶纤维丁酸弧菌 白色瘤胃球菌 牛链球菌 溶脂厌氧弧菌
甲烷菌
沃尔夫互营单细胞菌
挥发酸生成菌群 产氢产乙酸菌 中温丙酸氧化菌 同型产乙酸菌 伍德乙酸杆菌
乙酸梭菌
嗜热自养梭菌
提供生长和产甲烷所需要的基质
嗜甲基丁酸杆菌
创造适宜的氧化还原电位条件 为产甲烷菌清除有害物质
产甲 烷菌
Euryarchaeota
2
生长繁殖困难
•十几天~几十天才出现菌落 •菌落一般圆形、透明、边缘整齐 •菌落特别小，很容易遗漏。
METHANOGEN
可利用的底物很少： CO2、H2、乙酸、甲醇、
甲基胺等 Euryarchaeota
†产甲烷菌的生物学特性
3
独特的产甲烷菌辅酶
•甲烷吠喃(MFR)
•甲烷喋呤
•辅酶M(CoM)
•辅酶F430 •辅酶F420 •HS-HTP
4
特殊的细胞壁结构
•无肽聚糖骨架
脂蛋白
•蛋白质亚基和大量杂多糖组成 肽聚糖
•不受青霉素抑制
•细胞内无细胞色素C
METHANOGEN 孔道蛋白 脂多糖 Euryarchaeota
†产甲烷菌的分类
氢营养型：利用氢气和二氧化碳
METHANOGEN
根据可利 用底物
乙酸盐营养型：乙酸
甲基营养型：甲醇、三甲基胺、二甲肽硫化合物以及 其他的一些醇如异丙醇、异丁醇、乙醇、环戊醇
METHANOGEN
产甲烷菌16S rDNA序列分析：由于16S rDNA序列的保守性及物种之间的差别 性，产甲烷菌目前系统分类的主要依据为16S rDNA序列的分析。
16S rDNA序列的分析分为以下几个过程：
DNA的制备
扩增片段 的纯化
测序及结果分析
16S rDNA序列的扩增
质粒DNA的提取
扩增片段 的转化
根据生 长温度
嗜冷产甲烷菌：Topt < 25℃了 苔原湿地、湖底沉积物
嗜温产甲烷菌：Topt ≈ 35℃ 厌氧消化器、淡水沉积物
嗜热产甲烷菌：Topt ≈ 55℃ 海底沉积物、热泉等
极端嗜热产甲烷菌：Topt > 80℃
Euryarchaeota
†产甲烷菌甲烷生产途径
H2/CO2途径
甲基途径
METHANOGEN 乙酸途径