免疫共沉淀检测人p65和SMRT蛋白间相互作用

第48卷 第10期 V o.l 48 N o.10 山 东 大 学 学 报 (医 学 版)
J OU RNA L O F SHA NDO NG U N I V ER SITY (HEA LTH SC IE N CES)
2010年10月
O c.t 2010
收稿日期:2010 06 17
基金项目:河南省医学科技攻关重大项目(200801004)。

作者简介:王春美(1983-),女,博士研究生,主要从事儿科血液病和肿瘤疾病的临床与基础研究。

通讯作者:盛光耀(1952-),男,教授,博士生导师,主要从事儿童血液病和肿瘤疾病的临床与基础研究。

E m ai:l s hen ggy666@yahoo
文章编号:1671-7554(2010)10-0051-05
免疫共沉淀检测人p65和SM RT 蛋白间相互作用
王春美1
,盛光耀1
,卢洁2
,邹湘1
,方营旗1
,白松婷1
,谢垒
1
(郑州大学1.第一附属医院儿科;2.公共卫生学院流行病学与统计学教研室,郑州450052)
摘要:目的 使用免疫共沉淀技术法检测人p65和S M RT 蛋白在儿童急性髓细胞白血病(AM L )细胞株THP 1中
相互作用。

方法 体外人工合成p65基因CD S 区碱基序列和S M R T C 645bp 对应的基因片段,分别克隆至p U C57载体,经酶切、测序正确后,PCR 扩增目的基因片段,酶切后亚克隆至带有HA 标签和M y c 标签的真核表达载体pC M V HA 和pC M V M y c ,测序、酶切鉴定正确后,共转染TH P 1细胞,免疫共沉淀法检测二者间相互作用。

结果 成功构建了人p65和S M RT 蛋白真核表达载体pCM V HA p65和pCM V M yc S M RT,共转染TH P 1细胞,抗HA 和M yc 多克隆抗体分别沉淀细胞裂解液,用抗M yc 和HA 单克隆抗体分别进行W estern B l o tti ng 检测,可以检测到HA p65和M y c S M RT 蛋白的表达。

结论 成功构建了人p65和S M RT 蛋白重组真核表达载体,在THP 1细胞株中表达后,免疫共沉淀证实p65和S M RT 蛋白间存在相互作用,为进一步探讨儿童AM L 发病机制和白血病的靶向治疗提供理论依据。

关键词:免疫共沉淀;p65;S M RT;髓细胞白血病中图分类号:R 733.71 文献标志码:A
Interacti ons bet w een p65and S MRT by Co I mm unoprecipitati on
W ANG Chun m e i 1
,SHENG Guang yao 1
,LU Ji e 2
,ZOU X iang 1
,FANGY i n g qi 1
,BA I Song ting 1
,X I E Le i
1
(1.D epart m ent o f Paediatr ics ,t he F irst A ff iliated H o s p ita;l 2.D epa rt m ent o f Epidem i o l o gy and H yg iene S t a tistics ,
Scho o l o f Pub lic H ea lt h ,Z hengzho u U n i v ersity ,Z hengzho u 450052,Ch i na)Ab stract :O b jective T o de t e r m i ne i n terac ti ons be t w een p65and S M RT pro te i ns i n the acut e m ye l o geno us leuke m ia ce ll li ne (TH P 1)by co i m m unoprec i pit a ti on .M ethod s T he hu m an p65g ene and S M RT g ene w ere synt he sized i n
v itro and cloned i nto the p U C57vecto r .Co rrespondi ng DNA w as a m p lified by PCR and the PCR produc ts w ere sub c l oned i n t o eukary o ti c vec t o rs o f pC M V HA and pCM V M yc after restriction enzym e d i g estion .T hen ,the se recom bi ned p l a s m ids w ere confir m ed by restr i c tion enzym e dige sti on and DNA sequenc i ng and co transfected into THP 1ce ll li ne s .T he interac ti ons be t w een p65and S M R T w ere detected by co i m m unoprec i p itati o n .Resu lts R estricti on enzym e s digesti on and DNA s equenc i ng show ed tha t t he recom bi nan t eukary o tic v ectors o f pCM V HA p65and pC M V M y c S M R T w ere co rrectl y constructed .A fter bei ng i m m uno prec i p itated by anti HA and anti M y c m u lti anti bodies ,fusion pro te i ns o f HA p65and M y c S M RT w ere i den tif i ed by W estern b l o tting w it h anti M yc and an ti HA anti bod i e s .Con cl u sion R ecom binant euka ryo tic v ecto rs o f pCM V HA p65and p CM V M y c S M RT w ere s uccessfull y con struc ted .T he i nteracti o n o f P65and S M RT sho ul d be i den tif i ed by co i m m uno prec i p itati on after co expressi on i n TH P 1ce ll line ,w hich can serve a s a t o o l for furt her study o f the pathogenesis o f AM L i n chil dren and targe ting t herapy o f l euke m i a .K ey w ords :Co i m m unoprecipita tion ;P65;S M RT;M ye l o cy tic L euke m i a
F M S 样酪氨酸激酶3(FM S like tyro sine ki n ase 3,FLT3)是 型受体酪氨酸激酶(RTK )受体家族的成员,其在急性白血病尤其是急性髓细胞白血病
(A cute M yelo cy tic Leuke m i a ,AM L )发病中起重要
作用[1]
,但具体机制尚不明确。

目前对FLT3信号传导的研究,野生型主要集中在PI3K AKT 、SRC 通
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山 东 大 学 学 报 (医 学 版)48卷10期
路上[2 3],对在AM L发生、发展中有重要作用的核因子 B(N uclear Facto r K appa B,NF B)通路、辅抑因子维甲酸/甲状腺受体沉默因子(S ilenci n g M edtiato r fo r R eti n o ic A c i d and Thy ro id Ho r m one R ecepto r,S M RT),研究较少涉及。

本研究前期证实,FLT3抑制表达可下调THP 1细胞中NF B的活性,它可诱发p65由胞核移向胞浆,S M RT由胞浆移向胞核。

而NF B p65的过量表达,可以改变辅抑制子N COR的量,并使其在细胞浆中定位,从而下调了其转录抑制作用,S M RT与N C oR高度同源,p65改变可能也会引发S M RT的亚细胞定位的改变。

推测FLT3介导的NF B p65和S M RT相互作用在AM L发病中起重要作用。

本研究通过免疫共沉淀实验检测p65和S M RT蛋白间相互作用,进一步探讨AM L的发病机制。

1 材料与方法
1.1 细胞培养 儿童急性髓细胞白血病细胞株TH P 1购自中科院上海细胞所,使用含10%胎牛血清高糖DM E M培养基(含0.05m o l/L2 巯基乙醇、100U/mL青霉素、0.1m g/m L链霉素),置于37, 5%CO2培养箱中培养。

1.2 方法
1.2.1 人pUC57 S M RT重组质粒的构建 体外人工合成S M RT C645bp对应的DNA片段,并在该片段的5!端添加ATG起始密码子,将合成的SMRT 基因片段克隆至p UC57载体。

E coR∀和H ind 酶切、测序鉴定均由南京金斯瑞科技有限公司完成。

1.2.2 人pUC57 p65重组质粒的构建 体外人工分别合成RELA/p65基因CD S区碱基序列,并在该片段的5!段添加N heI酶切位点,3端添加xho lI酶切位点,将合成的RELA/p65基因片段克隆至p UC57载体的B a mH I和XbaI之间。

Kpn∀和H i n d 酶切、测序鉴定均由南京金斯瑞科技有限公司完成。

1.2.3 人SM RT C和p65基因片段的扩增
1.2.3.1 PCR扩增SMRT C基因 根据G enebank 上S M RT登陆号(NM 006312),设计S M RT C 645bp对应的上游引物和下游引物,且使其读码框与pCMV M yc载体读码框一致。

S M RT F m y c:5! CG GAATTC GG ATGAATAT CAGCCAGCCTGG 3!(含EcoR I酶切位点)
S M RT R m yc:5! CCG CTCGAG TCACTCGCT GTCGGAGAG 3!(含Xho I酶切位点)
以pUC57 S M RT为模板,PCR扩增目的片段,反应体系为50 L,三蒸水38.5 L,10#Taq Buffer (含M gC l2)5 L,dNTP2L,Taq酶0.5 L,模板DNA2 L,上下游引物各1 L。

反应条件:94预变性2m i n;9430s,60退火40s,72延伸1m i n,30个循环,72延伸10m i n,4终止。

PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,G IS凝胶系统中检测是否出现预期中的S M RT基因片段带(约650 bp)。

1.2.3.2 PCR扩增p65基因 根据G enebank上P65登陆号(NM 021975),设计P65上游引物和下游引物,上游引物引入X ho l∀酶切位点,下游引物引入K pn∀酶切位点,使其读码框与pC M V HA载体的读码框一致。

F:5!CCG CTCGAG GTATGGACGAACTGTTCC3! (含X ho l∀酶切位点)
R:5!GG GGTACC TTAGGAGCTGATCTGACTC3! (含K pn∀酶切位点)
以pUC57 p65为模板,扩增p65基因片段,反应体系为50 L,三蒸水38.5 L,10#Taq Buffer (含M gC l2)5 L,dNTP2 L,T aq酶0.5 L,模板DNA2 L,上下游引物各1 L。

反应条件:94预变性3m i n;9430s,55退火30s,72延伸1m i n,30个循环,72延伸5m in,4终止。

PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,G IS凝胶系统中检测是否出现预期中的S M RT基因片段带(约1700 bp)。

1.2.4 人S M RT基因和P65基因真核表达载体的构建 上述PCR产物回收纯化后,分别用EcoR∀和Xho l∀、Kpn∀和X ho l∀酶切出目的产物,然后用T4DNA连接酶和用相同限制性内切酶消化的pCM V M y c和pCMV HA真核表达载体连接,转化大肠杆菌E.co li DH5,挑取阳性克隆,LB培养基扩大培养,提取质粒,酶切鉴定,同时送菌液进行测序鉴定。

1.2.5 细胞转染和免疫共沉淀 因为THP 1采用常用的L ipo fecta m ine2000转染效率比较低,本试验采用电转方法进行转染,具体步骤如下:电转前24h 细胞换培养基,收集细胞并计数。

电转缓冲液用无血清的高糖DM E M,细胞稀释至1#106/m L。

电转条件:电压200V、电容950UF,电转前后冰浴10m in,电转后72h收集细胞。

细胞沉淀用1mL的PB S重悬。

4,S i g m a公司离心机,1000r/m i n离心2m i n,弃上清,加100 L R I PA裂解细胞,冰浴30m in,12000r/m in离心5m in,上清转移至新管
王春美,等.免疫共沉淀检测人p65和S M RT 蛋白间相互作用
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中,并分别加入1 g 抗HA 、抗M yc 多克隆抗体和免疫前血清,4 反应2h 。

按每管(样品)准备5 L A g rose A /G B eads 及5 L (1 g )抗体计算一次实验所用B eads 及抗体的总量,将抗体和Beads 混合,补充ly sis buffer 至每管均匀分配到50 L Beads 及抗体的混合物,将Beads 及抗体的混合物按每管50 L 分配到1.5mL EP 管中,将EP 管固定到混匀器上匀速旋转,免疫沉淀3h 。

1.2.6 W estern B l o t 法检测p65和SM RT 蛋白间相互作用 将免疫沉淀后的溶液于4 ,3000r /m i n 离心3m i n ,弃上清,加入1#裂解液重悬,4 3000r/m in 离心3m i n 。

洗涤Beads ,每次500 L,洗涤3次。

弃上清,Beads 珠子加入35 L 的1#裂解液和等体积2#SD S 上样缓冲液,混匀后煮沸10m i n ,制备SD S 聚丙烯酰胺凝胶,每孔上样量10 L,常规电泳、转膜、封闭,加入一抗(鼠抗人HA 和兔抗人m yc 单克隆抗体1∃200稀释)4 过夜孵育及相应的二抗(羊抗鼠HRP I gG 单克隆抗体和羊抗兔HRP IgG 单克隆抗体1∃1000稀释)室温孵育1h ,ECL 发光液处理后暗室内曝光胶片,于室温下自然风干,扫描仪扫描结果保存。

2 结 果
2.1 人pUC 57 S M RT 和pUC 57 p65重组质粒的构建与鉴定结果 将获得的重组质粒p UC 57 SMRT
和pUC57 p65进行EcoR ∀和H ind 、Kpn ∀和H ind 双酶切初步鉴定,结果见图1、2,并进一步测序,结果表明,
其核苷酸序列与设计的完全一致。

图1 酶切鉴定p U C 57 S M RT 重组质粒
1:p U C57质粒;2:p U C 57 S M RT 质粒E coR ∀和H ind 双酶切;M:3000bp DNA L adder F ig .1 R ecom bi nant plas m i d o f p U C 57 S M RT d i g ested by re
str i c tion enzym es 1:pUC 57p l a s m id ;2:p U C 57 S M RT dige sted by EcoR ∀and H i nd ;M :3000bp DNA
m arker
图2 酶切鉴定p U C57 p65重组质粒
1:pUC 57质粒;2:p U C57 p65质粒K pn ∀和H i nd 双酶切;M :3000bp DN A L adde r F i g.2 R ecom binant p l a s m i d o f p U C 57 p65d i g ested by re
str i c ti on enzym e s 1:pUC 57p las m i d;2:p U C57 p65d i g est ed by K pn ∀and H i nd ;M :3000bp D NA m arker
2.2 PCR 扩增人SM RT 基因和p65基因 分别将pUC57 S M RT 和pUC57 P65PCR 产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳,在645bp 和1656bp 处呈现与预期产物相对分子量大小相符的DNA 条带,结果见图3、4。

图3 PCR 扩增S M RT 基因
1、2:S M RT 基因;M:2000bp DNA L adder F i g.3 S M RT g ene am plified by PCR
1、2:S M RT g ene ;M :2000bp D NA m arker
图4 PCR 扩增p65基因
M:2000bp DNA L adder ;1:p65基因F i g.4 p65gene a m p lified by PCR
M:2000bp DNA m arker ;1:p65gene
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山 东 大 学 学 报 (医 学 版)48卷10期
2.3 人SM RT 和p65真核表达载体的构建和鉴定结果 将获得的pCM V m y c S M RT 和pC M V HA p65重组质粒分别进行EcoR ∀和Xho l ∀、K pn ∀和X ho l ∀双酶切鉴定,1.5%的琼脂糖凝胶电泳,分别可见645bp 和1656bp 的目的条带及
3.8kbp 的载体带,见图5、6。

进一步测序表明,pC M V m yc S M RT 和pC M V HA p65中插入的序列与G enebank 中对应的碱基序列一致,
读码框架和设计相符。

图5 酶切鉴定重组质粒pCM V M yc S M RT
M :7000bp DN A L adde r ;1:pCM V M yc S M RT EcoR ∀和H i nd 双酶切F ig .5 R ecom binant p l as m i d o f p CM V M y c S M RT d i g est ed
by re str i c tion enzym e s M :7000bp D NA m arker ;1:pCM V M y c S M RT d i g ested by EcoR ∀and H ind
图6 酶切鉴定重组质粒pCM V HA p65
M :7000bp DN A L adde r ;1:pCM V HA p65K pn ∀和X ho l ∀双酶切F ig .6 R ecom b i nan t plas m i d o f pCM V HA p65d i g ested by
restricti o n enzym es
M :7000bp DNA m a rker ;1:pC M V HA p65dige s ted by K pn ∀and X ho l ∀
2.4 电转THP 1细胞 将带有GFP 标记的空质粒pEGFP C1同条件下转染,24h 时以荧光显微镜观察,初步判断转染效果,见图7。

2.5 W ester n B lo t 法检测免疫共沉淀结果 用鼠抗HA 和兔抗m y c 单克隆抗体作为一抗,鼠抗兔HRP IgG 和羊抗兔HRP Ig G 单克隆抗体作为二抗进行W ester n b l o tting 分析,结果显示,pC M V M yc SMRT 和pCMV HA p65蛋白可以共沉淀下来,见图8、9。

图7 荧光显微镜下THP 1细胞转染结果(#100)
F i g.7 T ran sfec tion effect o f pE
G FP C 1i n THP 1cell li ne
(#100)
图8
anti HA 蛋白印迹1:i npu;t 2:an ti M yc 沉淀;3:空白对照组F i g.8 A n ti HA resu lts de tected by W B
1:i npu;t 2:anti M y c i m m unoprec i pit a ted com plex ;3:B lank con tro
l
图9
anti M y c 蛋白印迹1:i npu;t 2:an ti HA 沉淀;3:空白对照组
F i g.9 A n ti M y c re sults detec t ed by W B
1:i npu;t 2:anti HA i m m uno prec i p itated com p l ex;3:B lank con tro l
3 讨 论
从全细胞提取物中利用免疫共沉淀技术来检测
蛋白间的相互作用是一种极为有效的检测方法,该技术既可以验证已知蛋白质之间的相互作用,还可
以验证已知蛋白与未知蛋白间的相互作用。

而且本方法所研究的相互作用蛋白均是在宿主体内经翻译后修饰的天然蛋白,可以真实反映正常生理条件下蛋白质间的相互作用,因此是一种行之有效的验证蛋白质之间相互作用的方法。

本实验即是采用此法验证S M RT 和p65蛋白间相互作用。

转录抑制在调节细胞生长、分化、凋亡中有重要的作用,辅抑因子SMRT 及N COR 是调节真核生物基因表达的基本成分,它们能和核受体特异性结合,在核受体和基础转录因子之间发挥中介作用[4]
,并且二者高度同源。

其中S M RT 最早是在酵母双杂交系统中研究与维甲酸/甲状腺受体相互作
王春美,等.免疫共沉淀检测人p65和S M RT蛋白间相互作用55
用蛋白时发现的,定位于人类第12号染色体(12q24),其c DNA全长8826bp,编码2424aa。

近年研究显示[5],S M RT介导的转录抑制与AM L的发生关系密切。

核因子 B(nuc l e ar facto r kappa B,NF B)是一类核转录因子,能与多种基因启动子或增强子 B 位点特异性结合,从而正性调节与细胞增殖、免疫相关的多种基因的转录,NF B家族有5个成员: p50/p105、p65、C Re l、p52/p100和Re l B,彼此结合以同源或异源二聚体形式存在,其最常见的是由p50和p65组成的异源二聚体。

在绝大多数静止期的细胞中,NF B因子与其阻遏物I B蛋白相结合,以非活性形式存在于细胞质中。

当I B被体内、外因素诱导活化后,p50/p65二聚体进入核内,与靶基因启动子的DNA结合,p65末端的反式激活结构域可以与其启动子序列相互作用来促进转录。

p50不含活性结构域,不具激活转录功能,所以p65是执行NF B信号功能的关键因子[6]。

研究证实, AM L细胞中多存在N F B通路的持续激活[7 9]。

Takaha shi等[10]研究证实,野生型FLT3过表达可诱导NF B报告基因的上调。

E spono sa等[11]证实N F B p65的过量表达,可改变核辅抑因子N COR的量,并使其在胞浆中定位,而S M RT与N COR是高度同源的。

再结合本研究前期的结果,推测TH P 1细胞中FLT3表达可介导NF B p65和S M RT相互作用。

本实验首先体外合成了S M RT C 645bp对应的基因片段和p65基因的全部编码序列,克隆至pUC57载体,酶切及测序正确后,PCR 扩增其目的片段,再酶切,胶回收目的片段,分别亚克隆至带有标签的pCM V M y c载体和pCMV HA 载体,共转染THP 1细胞,通过免疫共沉淀的方法验证SM RT与p65在活体细胞内存在着相互作用,进一步探讨儿童AM L的发病机制,并为其靶向治疗措施的选择提供依据。

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(编辑:徐苗蓁)。