菜心叶绿素测定方法比较研究

菜心叶绿素测定方法比较研究
任红;罗丰;许彦;许如意
【摘要】[目的]探讨研磨法和浸提法测定菜心叶片叶绿素含量的优劣及快速测定的步骤.[方法]以菜心为试材,浸提法设5个处理:95％乙醇、80％丙酮、丙酮∶乙醇=1∶1、丙酮∶乙醇=1∶2和丙酮∶乙醇=2∶1,Arnon研磨法作为对照,研究不同提取液对菜心叶片叶绿素提取效果和叶绿素稳定性的影响.[结果]浸提法要优于Arnon研磨法；浸提法中,混合液浸提法的提取率和提取液的稳定性都优于单一溶剂浸提法,其中菜心叶绿素提取效果最好的是丙酮与乙醇体积比为2∶1,单一的丙酮或乙醇浸提法效果较差.[结论]丙酮与乙醇体积比为2∶1的混合液浸提法直接浸提菜心叶片叶绿素的优点是步骤简单,操作方便,节省时间,稳定性好,可以快速测定大批量样品的叶绿素含量.%[Objective] The study aimed to explore the advantage and disadvantages for the determination of the chlorophyll content in the leaves of flowering Chinese cabbage by grinding method and leaching method and the steps of rapid determination.[Method] With the flowering Chinese cabbage as the tested material, the leaching method was set up 5 treatments as 95% ethanol, 80% acetone, acetone: ethanol = 1:1, acetone:ethanol = 1:2 and acetone; ethanol = 2: 1, Arnon grinding method as the CK, effects of the different extracts on the extraction effect of and stability in the leaves of the flowering Chinese cabbage.[Result] The leaching method was better than the grinding method. As for the leaching method, the extraction rate by the mixture liquid leaching method and the stability of mixture extracting liquid were better than that by a single solvent leaching method, in which, the leaching method including the
mixture liquid of the acetone and ethanol with the volume rate of 2:1 could get the best extraction effect on the chlorophyll in the flowering Chinese cabbage and the single acetone or ethanol got the worst extraction effects. [Conclusion] The mixture liquid of the acetone and ethanol with the volume rate of 2:1 in directly extracting the chlorophyll in the flowering Chinese cabbage had the advantages of simple steps, convenient operation, good stability and saving time, which could rapidly determine the chlorophyll content in the multitudinous samples.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2012(040)003
【总页数】2页(P1455-1456)
【关键词】菜心;叶绿素;提取;稳定性
【作者】任红;罗丰;许彦;许如意
【作者单位】三亚市南繁科学技术研究院,海南三亚572000;三亚市南繁科学技术
研究院,海南三亚572000;三亚市南繁科学技术研究院,海南三亚572000;三亚市南繁科学技术研究院,海南三亚572000
【正文语种】中文
【中图分类】Q945.11
叶绿素是植物叶片的主要光合色素，叶绿素含量是植物生理研究中的重要指标［1］。

叶绿素含量测定方法主要有分光光度计法、活体叶绿素仪法和光声光谱法。

但用手持叶绿素仪或光谱分析仪测得的是色素相对含量指标，并且不同种类植物叶片中的色素指标与实际叶绿素含量之间的关系方程式不同，即不能用一种关系来转换不同植物的色素含量［2］。

在日常试验中以分光光度计法应用最广泛。

因所用的溶剂不同又有多种测定方法，早期叶绿素测定广泛采用Arnon法［3］。

但该
方法由于先研磨后除渣，工作量大、步骤多，且容易受光氧化而引起偏差，不适宜田间大量样品的提取和测定［4］。

张宪政提出了丙酮、乙醇混合液法浸提叶绿素，证明利用混合液进行叶绿素浸提的可行性［5］;洪法水等研究表明，丙酮与乙醇混合液提取叶绿素存在协同效应，且二者在等摩尔混合时提取效果最好［6］;徐芬芬等研究认为，丙酮与乙醇体积比1∶1混合液浸提小白菜叶绿素效果最好［7］;而
麻明友等研究认为，丙酮与乙醇体积比2∶1混合液浸提叶绿素效果较好［8］。

笔者在前人研究的基础上，以常规Arnon法作为对照，对研磨法和浸提法进行了
研究，进一步探讨叶绿素含量测定各方法的优劣及快速测定的步骤，为菜心田间大样本叶绿素含量测定提供依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料菜心叶片;上海光谱仪器有限公司生产的723PC型可见分光光度计;
丙酮、乙醇都为分析纯，95%乙醇直接采购。

1.2 试验设计按体积比配制浸提液，设6个处理，A:95%乙醇;B:80%丙酮;C:丙酮∶乙醇=1∶1;D:丙酮∶乙醇=1∶2;E:丙酮∶乙醇=2∶1。

A、B、C、D、E 处理采用
浸提法，以 Arnon法作为对照。

将新鲜菜心叶片洗净，用吸水纸吸干表面水分，去大叶脉后，将叶片剪碎成约0.2 cm×1.0 cm的小细丝，混匀备用。

Arnon法:称取0.1 g上述样品，放入研钵中，加入少量石英砂和80%丙酮研磨，定容至20 ml，过滤，取滤液在645和663 nm波长下测定吸光度。

重复3次。

浸提法:称取0.1 g上述样品，放入50 ml的塑料管中，分别加入上述5种不同的
浸提剂20 ml。

在室温暗室下浸提约24 h，用肉眼观察叶组织完全变白，即说明浸提完全，分别以提取试剂为对照，在645和663 nm波长下测定吸光度。

每处理重复3次。

为研究叶绿素在各个提取液中的稳定性，分别在第1、2、5、8天重复测定各个处理中叶绿素a和叶绿素b的含量。

1.3 数据处理研究表明，各参比浸提液的吸收光谱基本相似，即所有浸提液的叶绿素溶液的化学性质基本相同，叶绿素含量采用Arnon法的修正公式。

用Microsoft Office Excel 2003及SAS9.0统计软件处理数据。

按Arnon公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量及叶绿素总量。

式中，A663 nm和A645 nm分别为波长663和645 nm下的吸光度值;V为提取液的体积;W为叶片的鲜重。

2 结果与分析
2.1 不同提取液对叶绿素提取效果的影响从表1可明显看出，不同提取方法对菜心叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量有极显著性影响(P＜0.01)。

C与E处理提取的叶绿素总量差异不显著，含量较高，分别为1.489和1.535 mg/g，显著高于对照;其次为D和B处理，叶绿素总量分别为1.401和1.381 mg/g;Arnon研磨法得到的叶绿素总量最低，为1.170 mg/g。

单独用丙酮、乙醇浸提液提取或丙酮研磨法，效果均不如混合浸提液效果好。

这可能和丙酮与乙醇间存在协同萃取效应有关，促进了叶绿素的快速提取。

丙酮研磨法提取效果最差，可能与研磨和过滤过程中不可避免的损失有关。

2.2 不同提取液对叶绿素稳定性的影响用不同提取溶剂提取的菜心叶片叶绿素，在室温下放置1、2、5、8 d后测定提取液中叶绿素含量，结果见表2。

从表2可
以看出，除了B处理外，其他处理的叶绿素a、叶绿素b及总量均随时间变化呈下降趋势;B处理叶绿素a、叶绿素b及总量在第2天达到最大值，这可能是由于丙酮提取速度较慢引起的。

表1 不同提取液对叶绿素提取效果的影响(24 h)注:表中同列不同小写字母表示差异极显著(P＜0.01)，相同字母表示差异不显著。

提取方法叶绿素含量∥mg/g叶绿素a 叶绿素b 叶绿素总量A 0.910 d 0.373 a 1.283 c B 1.045 c 0.336 c 1.381
b C 1.104 b 0.385 a 1.489 a D 1.044
c 0.357 b 1.401 b E 1.161 a 0.374 a
1.535 a Arnon法(CK)0.844 e 0.326 c 1.170 d
叶绿素提取液放置8 d后，叶绿素a下降了1.76% ～8.31%，叶绿素b下降了1.50% ～5.60%，叶绿素总量下降了1.69% ～7.44%。

说明在这些提取液中，叶绿素b比叶绿素a稳定。

处理E在第8天叶绿素总量仅下降1.69%，为最
低;Arnon法提取的叶绿素总量第8天下降最高，为7.44%。

方差分析显示，各个处理在第1、2天测定的叶绿素a、叶绿素b及叶绿素总量差异不显著，说明放置2 d不影响叶绿素含量，但叶绿素提取液不宜长时间放置。

试验结果表明，叶绿素在不同提取液中稳定性的大小依次为:丙酮∶乙醇=2∶1 ＞丙酮∶乙醇=1∶2 ＞丙酮∶乙醇=1∶1＞丙酮＞乙醇＞Arnon法。

这说明，单一浸提剂所得叶绿素含量较低且不稳定，而混合液浸提叶绿素含量较高且较稳定。

表2 不同提取液对叶绿素稳定性的影响 mg/g处理第1天叶绿素a叶绿素b叶绿素总量叶绿素总量A 0.910 0.373 1.283 0.902 0.371 1.273 0.892 0.3第2天叶绿素a叶绿素b叶绿素总量第5天叶绿素a叶绿素b叶绿素总量第8天叶绿素a 叶绿素b 61 1.253 0.855 0.352 1.207 B 1.045 0.336 1.381 1.064 0.347 1.411 1.042 0.333 1.375 0.988 0.322 1.310 C 1.104 0.385 1.489 1.096 0.384 1.480 1.075 0.376 1.451 1.045 0.368 1.413 D 1.044 0.357 1.401 1.034 0.354 1.388 1.022 0.343 1.365 0.992 0.343 1.335 E 1.161 0.374 1.535 1.158 0.372 1.530
1.151 0.369 1.520 1.140 0.369 1.509 Arnon 法(CK) 0.844 0.326 1.170 0.858 0.328 1.186 0.823 0.310 1.133 0.774 0.309 1.083
3 结论
室温下，采用不同比例的丙酮、乙醇混合溶剂提取菜心叶片中叶绿素。

试验结果表明，浸提法要优于研磨法;浸提法中混合液提取叶绿素，比单独用乙醇或者丙酮浸提液提取效果好。

当丙酮与乙醇的体积比为2∶1时，提取最为充分，这与麻明友等［8］和明华等［2］的研究结果相同。

不同体积比例的丙酮、乙醇混合溶剂，提取效果不同，这是由于2种提取液间存在不同程度的协同萃取反应。

混合液浸提法不但所得叶绿素含量高于研磨法，且稳定性也优于研磨法。

随时间的延长，各种提取方法均为叶绿素a降解值远远大于叶绿素b。

说明叶绿素a降解速度快于叶绿素b，这与杨敏文等的研究结果一致［9］。

可见，影响叶绿素提取效率的关键是叶绿素a的提取速度及其稳定性保持。

试验结果表明，叶绿素在1～2 d内比较稳定，一般在1 d内就能提取完全;由于材料的不同，可根据剪碎的尺寸差异适当选择提取时间。

丙酮与乙醇体积比为2∶1时直接浸提菜心叶片叶绿素的主要优点是步骤简单，操作方便，省略研磨、冲洗、离心或过滤等步骤，节省时间，稳定性好，这对于快速测定大批量样品叶绿素含量具有实际意义。

参考文献
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科技，2006，27(6):140 －143.
［9］杨敏文.快速测定植物叶片叶绿素含量方法的探讨［J］.光谱实验室，2002，19(4):478 －481.。