MeCP2增加LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞的炎症因子分泌
小檗碱干预脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞mh-s分泌no、il-6等炎性介质
doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.01.008小檗碱干预脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞MH⁃S 分泌NO ㊁IL⁃6等炎性介质的机制研究孙 垚 朱 欢 张 跃 (南京医科大学附属儿童医院,南京210008) 中图分类号 R967 文献标志码 A 文章编号 1000⁃484X (2020)01⁃0042⁃05作者简介:孙 垚,男,硕士,住院医师,主要从事细胞与分子免疫及儿童康复医学方面研究㊂通讯作者及指导教师:张 跃,男,主任医师,主要从事儿童康复医学方面研究,E⁃mail:feiyuezhang@㊂[摘 要] 目的:观察小檗碱对脂多糖(LPS)诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌炎性介质的影响,并探讨其可能的机制㊂方法:体外培养小鼠肺泡巨噬细胞MH⁃S,用终浓度为0.5μg /ml 的LPS 刺激后,加入不同浓度的小檗碱作用24h㊂MTT 法检测小檗碱对MH⁃S 活力的影响;采用NO 测定试剂盒检测NO 的含量,ELISA 和RT⁃PCR 法检测TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12的蛋白和mRNA 水平;Western blot 法检测MH⁃S 细胞中iNOS㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65的水平㊂结果:小檗碱在浓度不超过5μmol /L 时,在24h 内对MH⁃S 细胞的活力几乎无影响,在10μmol /L 的浓度下对巨噬细胞的活力有抑制作用,并呈一定的时⁃效性㊂小檗碱能够显著降低MH⁃S 细胞中NO 的分泌量(P <0.05),并在蛋白和基因层面上剂量依赖性地降低TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12的水平㊂小檗碱能够显著下调iNOS㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65的表达量(P <0.05)㊂结论:小檗碱能够抑制iNOS 的活性,从而减少NO 的分泌,同时通过抑制TLR4/MyD88/IRAK⁃4通路而抑制NF⁃κB 的激活,进而发挥抗炎作用㊂[关键词] 小檗碱;小鼠肺泡巨噬细胞;诱导性一氧化氮合酶;TLR4/MyD88/IRAK⁃4信号通路;核转录因子κBMechanism of berberine on intervention of lipopolysaccharide⁃induced inflammatory mediators such as NO and IL⁃6in mouse alveolar macrophagesSUN Yao ,ZHU Huan ,ZHANG Yue .Nanjing Children′s Hospital Affiliated to Nanjing Medical University ,Nanjing210008,China[Abstract ] Objective :To investigate the effect of berberine on lipopolysaccharide(LPS)⁃induced inflammatory mediators inmouse alveolar macrophages and explore its possible mechanism.Methods :MH⁃S cells was cultured in vitro and stimulated with LPS ata final concentration of 0.5μg /ml and then treated with different concentrations of berberine for 24h.MTT assay was used to detect the effect of berberine on MH⁃S cells activity.The NO assay kit was used to detect the content of NO.ELISA and RT⁃PCR were used to detect the protein and mRNA levels of TNF⁃α,IL⁃6,IL⁃1and IL⁃12.The levels of iNOS,TLR4,MyD88,IRAK⁃4and NF⁃κB p65in MH⁃S cells were detected by Western blot.Results :Berberine not exceeding 5μmol /L had almost no effect on the viability of MH⁃S cells within 24h.Berberine inhibited the activity of macrophages at a concentration of 10μmol /L and showed a certain time⁃effect.Berberine significantly reduced the secretion of NO in MH⁃S cells(P <0.05)and dose⁃dependently decreased TNF⁃α,IL⁃6,IL⁃1and IL⁃12at the protein and gene level.Berberine significantly down⁃regulated the expression levels of iNOS,TLR4,MyD88,IRAK⁃4and NF⁃κB p65(P <0.05).Conclusion :Berberine can inhibit the activity of iNOS,thereby reducing the secretion of NO.At the sametime,it blocked the activation of NF⁃κB by inhibiting the TLR4/MyD88/IRAK⁃4pathway,thereby exerting an anti⁃inflammatory effect.[Key words ] Berberine;Mouse alveolar macrophages;Inducible nitric oxide synthase(iNOS);TLR4/MyD88/IRAK⁃4signalpathway;Nuclear factor κB(NF⁃κB) 肺泡巨噬细胞存在于肺泡内,是肺部巨噬细胞的主要种类,在正常生理环境下,其主要作用是清除组织内细胞碎片或无害抗原[1]㊂在肺组织受到致病微生物侵袭或者损伤时,肺泡巨噬细胞会启动强烈的促炎反应以维持组织稳态,但过度的炎性反应往往会加重组织损伤,从而诱发各种肺部疾病[2]㊂目前针对肺部炎症反应的治疗药物主要分为抗生素和糖皮质激素两类,前者以清除致病菌为主,后者以消除炎症为主[3⁃5]㊂然而,抗生素的过度使用极易出现耐药性,激素类药物又容易出现不良反应[6,7]㊂因此,寻求新的抗炎药物对于肺部炎症疾病乃至其他类炎症相关疾病的治疗具有重大意义㊂小檗碱(Berberine,BBR)主要存在于毛茛目毛茛科㊁小檗科㊁防己科及罂粟科植物中,此外在芸香科植物中也有较多分布,是一种具有广泛药理活性的生物碱类成分[8]㊂研究表明,小檗碱有很强的抗炎抑菌作用,其能通过对NF⁃κB㊁丝裂原活化蛋白激酶(mitogen⁃activated protein kinase,MAPK)㊁过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators⁃activated receptorγ)信号等通路的调节,影响免疫细胞之间的平衡,抑制炎症因子的分泌和表达㊁减轻组织损伤等多种作用途径来减轻或抑制炎症的产生与发展[9⁃12]㊂目前有关小檗碱体外抗炎作用机制的研究主要集中在单核细胞(THP⁃1)或腹腔巨噬细胞(RAW264.7)等,本文旨在研究小檗碱对LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌炎性介质的影响及其可能的作用机制㊂1 材料与方法1.1 材料 小鼠肺泡巨噬细胞株MH⁃S购自美国ATCC;BBR购自成都普瑞法科技开发有限公司, HPLC纯度≥98%;RPMI1640培养基㊁胎牛血清购自美国Gibco公司;脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)㊁MTT[3⁃(4,5⁃dimethyl⁃2⁃thiazolyl)⁃2,5⁃diphenyl⁃2⁃H⁃tetrazolium bromide]购自美国Sigma公司;TRIzon总RNA提取试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司;iTaq TM Universal SYBR Green supermix购自美国BIO⁃RAD公司;5×All in one RT⁃MasterMix购自上海斯信生物科技有限公司;一氧化氮(NO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;小鼠肿瘤坏死因子α(TNF⁃α)㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12ELISA试剂盒购自南京翼飞雪生物科技有限公司;一抗诱导性一氧化氮合酶(iNOS)㊁Toll样受体4 (TLR4)㊁髓样分化因子(MyD88)㊁白介素1受体关联激酶4(IRAK⁃4)㊁核转录因子κB(NF⁃κB)㊁β肌动蛋白(β⁃actin)及二抗HRP标记羊抗兔IgG(H+ L)购自沈阳万类生物科技有限公司㊂1.2 方法1.2.1 细胞培养 MH⁃S细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置37℃㊁5%CO2恒温培养箱中培养㊂待细胞生长至对数生长期时,将细胞接种于96孔板或6孔板中继续培养㊂1.2.2 MTT法检测小檗碱对MH⁃S细胞活力的影响 取对数生长期的细胞,接种于96孔板中,每孔约1×104个细胞,接种6h后,加入终浓度为0㊁1㊁5㊁10μmol/L的小檗碱㊂培养6㊁12㊁18㊁24h后弃去培养基,每孔加入MTT溶液(0.5mg/ml)100μl继续培养4h后弃去培养基,每孔加入100μl二甲基亚砜,充分溶解反应产物后,于490nm处测定各孔吸光度值,计算不同浓度小檗碱对细胞生长活力的影响㊂1.2.3 Western blot法检测小檗碱对LPS诱导MH⁃S细胞相关蛋白表达的影响 取对数生长期的细胞,接种于6孔板中,每孔约2×105个细胞,接种6h 后,除空白对照孔外,每孔加入终浓度为0.5μg/ml 的LPS溶液㊂设置模型孔(含LPS,不含小檗碱),其他每孔分别加入1㊁2㊁5μmol/L的小檗碱,继续培养24h后,用无菌管收集细胞上清液,进行细胞因子的检测㊂细胞用预冷的PBS洗涤2次后,每孔加入含蛋白酶抑制剂㊁磷酸酶抑制剂的细胞裂解液100~150μl,裂解后将细胞小心刮下离心取上清, BCA法检测细胞蛋白的浓度㊂调整蛋白浓度,取相同总量的蛋白进行SDS⁃PAGE电泳㊁转膜㊂转膜后用4%脱脂牛奶室温封闭2h,TBST清洗后加入一抗于4℃孵育过夜,TBST清洗后加入二抗于室温孵育2h,TBST清洗后进行化学发光㊁显影㊁定影㊂采用Image Pro⁃Plus6.0软件分析电泳条带灰度值,以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量㊂1.2.4 RT⁃PCR检测小檗碱对LPS诱导MH⁃S细胞炎症因子的影响 按照1.2.2中方法进行MH⁃S细胞的接板㊁给药㊂给药48h后,弃去上清液,用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤2次,加入TRIzon总RNA 提取试剂提取RNA㊂RNA逆转录参照逆转录试剂盒说明书将试剂混匀,放入逆转录仪器中进行转录㊂逆转录所得产物直接进行荧光定量PCR,参照试剂盒说明书在专用低位PCR反应孔板中加入相关反应物,引物序列见表1,参照试剂盒说明书所列程序进行反应㊂以β⁃actin做内参,所得结果将原始值进行2-ΔΔCt转换后进行统计学处理㊂1.2.5 细胞上清液NO㊁炎症因子的含量检测 按照相关试剂盒所附说明书的操作,绘制标准曲线,分别计算各细胞因子的含量㊂1.3 统计学方法 应用Graphpad Prism6.0软件进行统计学分析,结果以x±s表示,采用单因素方差分析(One way⁃ANOVA)对数据进行显著性检验,P< 0.05表示差异具有统计学意义㊂2 结果2.1 小檗碱对MH⁃S细胞活力的影响 结果如图1所示,小檗碱在1㊁5μmol/L的浓度作用24h,对MH⁃S细胞的生长活力几乎没有影响;在10μmol/L 的浓度下,能明显降低MH⁃S细胞的活力,在作用超过12h 开始具有统计学意义(P <0.05),呈一定的时效性㊂因此,小檗碱的给药浓度最大不能超过5μmol /L㊂2.2 小檗碱对LPS 刺激MH⁃S 细胞炎症因子的影响 结果如图2所示,0.5μg /ml 的LPS 作用MH⁃S 图1 小檗碱作用不同时间对MH⁃S 细胞活力的影响Fig.1 Effect of berberine on viability of MH⁃S cells atdifferent timesNote:Compared with the 0μmol /L group,*.P <0.05,**.P <0.01.细胞24h 后,细胞上清液中NO㊁TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12的含量明显升高(P <0.01)㊂给予不同浓度的小檗碱刺激后,NO㊁TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12的水平有不同程度地下降,并呈一定的量效关系㊂2.3 小檗碱对LPS 刺激MH⁃S 细胞中TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12mRNA 的影响 结果如图3所示,0.5μg /ml 的LPS 作用MH⁃S 细胞24h 后,细胞中TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12等炎症因子mRNA 的表达量明显升高(P <0.01)㊂给予不同浓度的小檗碱刺激后,NO㊁TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12的mRNA 水平呈浓度依赖性地下调,并在剂量为5μmol /L 时,差异均具有统计学意义(P <0.05)㊂2.4 小檗碱对LPS 刺激MH⁃S 细胞中iNOS㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65的影响 结果见表2和图4,0.5μg /ml 的LPS 作用MH⁃S 细胞24h 后,细胞iNOS㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65蛋白表达量明显升高(P <0.01)㊂给予5μmol /L 的小檗碱刺激后,MH⁃S 细胞iNOS㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65蛋白表达量显著下调(P <0.05)㊂表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers for real⁃time PCRNameForward(5′→3′)Reverse(5′→3′)Product(bp)TNF⁃αCCTGTAGCCCACGTCGTAGGGGAGTAGACAAGGTACAACCC 148IL⁃6CTGCAAGAGACTTCCATCCAG AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG 131IL⁃1GAAATGCCACCTTTTGACAGTG TGGATGCTCTCATCAGGACAG116IL⁃12CTGTGCCTTGGTAGCATCTATG GCAGAGTCTCGCCATTATGATTC 169β⁃actinGGCTGTATTCCCCTCCATCGCCAGTTGGTAACAATGCCATGT154图2 小檗碱对MH⁃S 中NO (A )㊁TNF⁃α(B )㊁IL⁃6(C )㊁IL⁃1(D )及IL⁃12(E )表达量的影响Fig.2 Effect of berberine on expression of NO (A ),TNF⁃α(B ),IL⁃6(C ),IL⁃1(D )and IL⁃12(E )in MH⁃S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+,BBR-),*.P <0.05,**.P <0.01.表2 小檗碱对MH⁃S 中iNOS ㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65相对表达量的影响(x ±s ,n =3)Tab.2 Effect of berberine on relative expression of iNOS ,TLR4,MyD88,IRAK⁃4and NF⁃κB p65in MH⁃S cells (x ±s ,n =3)GroupsiNOSTLR4MyD88IRAK⁃4NF⁃κB p65Control 0.28±0.132)0.66±0.112)0.49±0.082)0.35±0.052)0.84±0.072)Model 2.01±0.162.47±0.422.73±0.171.89±0.102.19±0.24BBR 1.27±0.162)1.56±0.181)1.30±0.102)0.84±0.072)1.28±0.171)Note:Compared with the Model group,1)P <0.05,2)P <0.01.图3 小檗碱对MH⁃S 中TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12mRNA 的影响Fig.3 Effect of berberine on mRNA level of TNF⁃α,IL⁃6,IL⁃1and IL⁃12in MH⁃S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+,BBR-),*.P <0.05,**.P <0.01.图4 小檗碱对LPS 刺激MH⁃S 细胞中iNOS ㊁TLR4㊁MyD88㊁IRAK⁃4及NF⁃κB p65蛋白的影响Fig.4 Effect of berberine on expression of iNOS ,TLR4,MyD88,IRAK⁃4and NF⁃κB p65in MH⁃S cells induced by LPS3 讨论巨噬细胞是吞噬细胞的一种,是机体抵抗外来病原体侵袭的重要组成部分,其主要功能是对细胞碎片及病原体进行吞噬作用,激活免疫细胞并引起炎症反应㊂肺泡巨噬细胞长期存在于肺泡内,是肺部巨噬细胞的主要种类,是宿主抵御外部侵袭的第一道防线,在维持肺部免疫系统稳态过程中发挥关键作用[13]㊂在肺部受到外来或内在致病因素刺激后,肺泡巨噬细胞被激活并释放大量炎性介质如细胞因子㊁趋化因子㊁补体㊁危险信号分子等[14]㊂其中趋化因子能继续招募单核细胞和中性粒细胞,或作为刺激剂激活肺上皮细胞和间质巨噬细胞,从而建立肺部炎症微环境[15]㊂在炎性环境下,巨噬细胞表面Toll 样受体表达增加,刺激多种炎症因子的激活㊁表达㊁释放㊂研究表明,肺泡巨噬细胞的活化与多种肺部疾病相关,包括急性肺损伤㊁慢性阻塞性肺病㊁支气管哮喘㊁肺纤维化等[16⁃20]㊂巨噬细胞在受到LPS 等刺激下,会活化并释放大量炎症分子或因子,包括NO㊁TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12等[21]㊂NO 由iNOS 催化合成,在LPS 的刺激下,巨噬细胞大量合成并释放NO,在杀伤病原体的同时对周围正常细胞也造成损害[22]㊂TNF⁃α是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白,其作用于细胞表面时,与细胞膜表面受体结合后能形成复体,从而激活下游的一系列蛋白激酶,进而激活NF⁃κB 和JNK 信号通路,参与机体的炎症反应和免疫调节等病理过程[23]㊂IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12均属白介素家族,主要由巨噬细胞㊁小胶质细胞㊁淋巴细胞及上皮细胞等产生㊂在正常生理条件下含量极低,在病理状态下如COPD㊁肺损伤,该类白介素含量急剧升高㊂IL⁃6能够介导炎症反应,促进T 细胞和B 细胞的增生和分化,参与免疫调节,引起免疫性病理损伤[24]㊂IL⁃1是参与炎症反应的最重要的细胞因子之一,能诱导出与TNF⁃α相似的生理和代谢改变,并能与TNF⁃α产生相互协同作用[25]㊂IL⁃12作为一种重要的免疫调节因子,具有多种生理功能,其一方面能促进巨噬细胞产生一氧化氮合酶,释放活性氮,增强吞噬功能和局部炎症反应;另一方面能促进Th1型细胞分化,抑制Th2型细胞分化,促进IL⁃2㊁TNF⁃α等细胞因子的产生[26]㊂小檗碱是一种季铵类型的生物碱,常用于治疗各种炎症疾病及细菌感染㊂药理研究发现,小檗碱能改善细胞内脂滴的聚集和氧化应激,从而改善棕榈酸钠诱导的细胞凋亡[27];并能通过抑制抗原诱导的Lyn㊁Syk 和Gab2的磷酸化,从而抑制下游MAPK 通路,在过敏反应的体内模型中,小檗碱的使用通过上述途径抑制小鼠的被动皮肤过敏反应[28]㊂但有关小檗碱对肺泡巨噬细胞活化影响的相关研究较少,本文研究结果表明,小檗碱能够明显抑制LPS 刺激的巨噬细胞活化,降低NO 的分泌量,同时剂量依赖性地在蛋白层面及基因层面下调TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃1及IL⁃12等炎症因子的含量,具有显著的抗炎作用㊂Toll 样受体(toll⁃like receptors,TLRs)是一类天然免疫受体,在自然界动物体内广泛分布,主要表达于巨噬细胞㊁单核细胞㊁淋巴细胞等免疫细胞表面㊂TLRs 能够直接识别并结合病原体或其产物,引发一系列信号转导,进而导致炎性介质的释放[29]㊂TLR4是人类发现的首个TLRs 蛋白,其与相应配体结合后,能进一步激活NF⁃κB,从而促进各种炎性因子基因表达的激活㊂由LPS 激活的TLR4/NF⁃κB 信号通路主要分为MyD88依赖的信号通路及MyD88非依赖的信号通路㊂在细胞表面,TLR4与LPS结合后发生聚合将信号转导至胞内,与MyD88的羧基端结合,同时MyD88的氨基端与IRAK⁃4结合,并激活TRAF⁃6,进而激活IKKs复合物,NF⁃κB抑制物在IKKs复合物的作用下发生磷酸化并降解,使得NF⁃κB激活并转入细胞核内诱导细胞因子IL⁃1㊁IL⁃6及IL⁃12等的表达[30⁃32]㊂本实验研究结果发现,小檗碱能够通过抑制iNOS的活性,减少NO的释放,另一方面通过抑制TLR4/MyD88/IRAK⁃4通路的活化,进而抑制NF⁃κB 的激活,从而减少炎症介质的释放㊂参考文献:[1] Balhara J,Gounni AS.The alveolar macrophages in asthma:Adouble⁃edged sword[J].Mucosal Immunol,2012,5(6):605⁃609.[2] Allard B,Panariti A,Martin JG.Alveolar macrophages in theresolution of inflammation,tissue repair,and tolerance to infection [J].Front Immunol,2018,9:1777.[3] Motos A,Kidd JM,Nicolau DP.Optimizing antibioticadministration for pneumonia[J].Clin Chest Med,2018,39(4): 837⁃852.[4] 胡小芳,李 言,张 永.糖皮质激素辅助治疗社区获得性肺炎研究进展[J].中华医院感染学杂志,2017,27(2):477⁃480.Hu XF,Li Y,Zhang Y.Progress of study on glucocorticoids in adjuvant therapy of community⁃acquired pneumonia[J].Chin J Nosocomiol,2017,27(2):477⁃480.[5] Ariani F,Liu K,Jing Z,et al.Glucocorticosteroid in treatment ofsevere pneumonia[J].Mediators Inflamm,2013:865635. 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亚油酸对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞炎症因子释放的影响要点
ＬＡ，ａｎｄ ３０ ｍｉｎ
Ｉ．ｔｇ／ｍｌ ＬＰＳ １恤１
ａｄｄｅｄ ｉｎ ＬＰＳ ａｎｄ
ＬＡ
ｇｒｏｕｐｓ．Ａｔ ｌ ｈ ａｆｔｅｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ＬＰＳ．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｌｌ．１ｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４（ＴＬＲ４）ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｓｉｇｎａｌ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＭＡＰＫ、ｗａｓ ｋａｐｐａ
ｗａｓ
ａｎｄ ｐ－ｐ３８ ＭＡＰＫ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ｇｒｏｕｐ ＬＰＳ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ
ＬＰＳ ａｎｄ ＬＡ ａｎｄ
ｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ
ＭＡＰＫ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ｗａｓ
ｏｆ ＴＬＲ４，ｐ－ＮＦ－ＫＢ ｐ６５，ｐ－ＥＲＫ ｇｒｏｕｐ ｉｎ
的释放，其机制可能与抑制ＴＬＲ４信号通路的激活有关。 【关键词】
亚油酸；脂多糖类； 巨噬细胞；细胞因子类
Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ
ａｃｉｄ
ｏｎ
ｎｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ・ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ｏｆ ｍｉｃｅ
Ｃ组比较，ＬＰＳ组、ＬＡ，组、ＬＡ，组和ＬＡ，组细胞上清液ＴＮＦ—ｏｔ和ＩＬ－６的浓度升高（Ｐ＜０．０５）；与ＬＰＳ组 比较，ＬＡ．组、ＬＡ，组和ＬＡ、组细胞上清液ＴＮＦ—ｏｔ和ＩＬ－６的浓度降低（Ｐ＜０．０５）；与ＬＡ。组比较，ＬＡ：组 和ＬＡ，组细胞上清液ＴＮＦ—ｄ和ＩＬ一６的浓度降低（尸＜０．０５）；与ＬＡ：组比较，ＬＡ，组细胞上清液ＴＮＦ—ｄ
糖皮质激素对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞增殖和细胞因子的影响
㊃论 著㊃D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2015.12.008作者单位:100853北京,解放军医学院(王雯);100142北京,空军总医院呼吸内科(王东㊁方明明㊁张波)通信作者:张波,E m a i l :z h a n gb o h u x i @s i n a .c o m 糖皮质激素对脂多糖诱导小鼠巨噬细胞增殖和细胞因子的影响王雯 王东 方明明 张波ʌ摘要ɔ 目的 探讨脂多糖(L P S )和长期大剂量应用地塞米松对小鼠巨噬细胞R AW 264.7增殖活化及细胞因子表达的影响㊂方法 不同剂量地塞米松(10㊁50㊁100㊁150m g/L )作用于小鼠巨噬细胞R AW 264.724h 后,1m g /LL P S 再作用于细胞24h ,应用C C K -8检测R AW 264.7细胞增殖情况,E L I S A 检测炎症因子I L -6和趋化因子I L -8的表达水平㊂结果 1m g /LL P S 促进R AW 264.7细胞增殖并激活细胞产生大量I L -6和I L -8,不同剂量地塞米松干预细胞24h 后,R AW 264.7细胞增殖情况受到抑制,呈浓度依赖性㊂炎症因子I L -6和趋化因子I L -8表达水平也随地塞米松浓度增加而降低㊂结论 小剂量L P S 促进巨噬细胞增殖并活化产生大量细胞因子㊂而长期大剂量应用地塞米松抑制巨噬细胞的生长增殖,同时抑制炎症因子及趋化因子的表达,降低机体清除病原体的能力,造成了免疫抑制患者发生难以控制的感染㊂ʌ关键词ɔ 脂多糖;巨噬细胞;地塞米松;炎症因子;趋化因子E f f e c t o f d e x a m e t h a s o n e o nL P S -i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o na n d c y t o k i n e s i nR A W 264.7m a c r o p h a g e W a n g W e n *,W a n g D o n g ,F a n g M i n g m i n g ,Z h a n g B o .*M e d i c a lS c h o o lo f C h i n e s eP L A ,B e i j i n g 100853,C h i n aC o r r e s p o n d i n g a u t h o r :Z h a n g B o ,E m a i l :z h a n gb o h u x i @s i n a .c o m ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o e x p l o r e t h e ef f e c t o f d e x a m e t h a s o n e o n l i p o p o l y s a c c h a r i d e (L P S )-i n d u c e d c e l l p r o l i f e r a t i o na n dc y t o k i n e si n R AW 264.7m a c r o p h ag e .M e th o d s R AW 264.7m a c r o p h a g e s w e r e s ti m u l a t e dw i t h10,50,100o r150m g /Ld e x a m e t h a s o n ef o r24h o u r sb e f o r es t i m u l a t i o n w i t h1m g /L L P S ,t h e c e l l g r o w t h r a t ew a s d e t e c t e db y C C K -8.I n t e r l e u k i n -6(I L -6)a n d I L -8l e v e l sw e r em e a s u r e db y E L I S A.R e s u l t s I n v i t r ot r e a t m e n to f R AW 264.7m a c r o p h a ge s w i t h d e x a m e t h a s o n ei n h i b i t e d L P S -i n d u c e dc e l l p r o l if e r a t i o n a n d s u p p r e s s e d t h e p r o d u c t i o n o f I L -6a n d I L -8i n a d o s e -d e p e n d e n t .C o n c l u s i o n s H igh d o s e o f d e x a m e t h a s o n e b l o c k s t h e L P S -i n d u c e d R AW 264.7m a c r o p h a g e s c e l l p r o l i f e r a t i o na n d d e c r e a s e st h e p r o d u c t i o n o fi n f l a mm a t o r y c y t o k i n e sa n d c h e m o k i n e s .H i gh d o s eo f g l u c o c o r t i c o i d s l e a d s t ou n c o n t r o l l e d i n f e c t i o nb y s u p p r e s s i n g i mm u n e s ys t e m.ʌK e y wo r d s ɔ L i p o p o l y s a c c h a r i d e ;M a c r o p h a g e ;D e x a m e t h a s o n e ;C y t o k i n e s ;C h e m o k i n e s 糖皮质激素是应用最为广泛的治疗炎症和自身免疫性疾病的免疫抑制剂之一㊂临床上发现,糖皮质激素的长期大剂量应用能够导致免疫抑制患者并发感染的几率明显增加[1]㊂巨噬细胞构成机体防御病原微生物感染的第一道防线,在免疫应答中发挥重要作用㊂巨噬细胞通过识别㊁吞噬及抗原递呈清除抗原性异物,同时通过分泌肿瘤坏死因子α(T N F -α)㊁I L -6等炎症因子及I L -8等趋化因子,促进急性期免疫反应,加速对病原体的清除[2]㊂大量研究表明地塞米松与其受体作用影响巨噬细胞功能,从而影响机体的免疫应答[3],然而长期大剂量应用糖皮质激素导致患者易发生感染的原因尚不清楚㊂本研究拟通过对小鼠巨噬细胞R AW 264.7增殖情况及炎症因子㊁趋化因子水平的检测,探讨长期大剂量地塞米松对炎症水平的影响,从而进一步揭示糖皮质激素与感染之间的联系㊂1 材料与方法1.1 仪器与试剂 小鼠单核巨噬细胞R AW 264.7购自南京凯基生物公司细胞库;脂多糖(L P S )购自㊃119㊃国际呼吸杂志2015年6月第35卷第12期 I n t JR e s pi r ,J u n e 2015,V o l .35,N o .12S i g m a公司;地塞米松购自容生制药有限公司;C C K-8检测试剂盒购自碧云天生物公司;I L-6和I L-8E L I S A试剂盒购自凯基生物公司㊂主要仪器:台式冷冻离心机(湘仪);MMK3酶标仪(T h e r m o)㊂1.2 R AW264.7细胞培养及干预 R AW264.7细胞采用含10%灭活胎牛血清的R P M I1640培养基,在37ħ㊁5%C O2培养箱中培养㊂隔天传代,取4~5代生长状态良好的细胞,以5ˑ105个/m l的密度接种于6孔板中㊂实验分为3组:实验组加入不同浓度地塞米松,分别为10㊁50㊁100㊁150m g/L培养24h后,加入1m g/LL P S继续培养24h;阴性对照组加入等量1640培养基培养24h后,加入1m g/LL P S继续培养24h;空白对照组仅加入等量1640培养基㊂1.3 C C K-8细胞增殖实验 R AW264.7细胞接种于96孔板中,每孔加入0.1m l含0.5ˑ104~1ˑ104的细胞悬液㊂边缘孔用1640培养基填充,在37ħ㊁5%C O2培养箱中培养12h至细胞贴壁㊂根据实验分组向每孔中依次加入地塞米松及L P S或等量1640培养基,每个浓度设8个复孔,24h后全部弃培养基㊂每孔加入20μlC C K-8溶液,培养箱内继续孵育1h后,用酶标仪在450n m测定吸光度㊂1.4炎症因子检测酶联免疫法E L I S A测定细胞上清中I L-6和I L-8水平,按照试剂盒操作说明书进行㊂1.5统计学处理所有数据以x-ʃs表示,用S P S S 17.0进行方差分析及均数间的多重比较,P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1不同剂量地塞米松对R AW264.7细胞增殖的影响以空白对照组的O D值为参照,阴性对照组O D值最高,促进R AW264.7细胞增殖㊂不同剂量地塞米松干预R AW264.7细胞24h后,O D值明显下降且呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P< 0.05)㊂见表1㊂表1 C C K-8细胞增殖实验结果(x-ʃs,n=8)组别O D值空白对照组0.49ʃ0.02阴性对照组0.76ʃ0.01a实验组10m g/L0.68ʃ0.02a b50m g/L0.63ʃ0.02a b c100m g/L0.59ʃ0.02a b c150m g/L0.56ʃ0.02a b c d 注:与空白对照组比较,a P<0.05;与阴性对照组比较,b P< 0.05;与10m g/L组比较,c P<0.05;与100m g/L组比较,d P<0.052.2 E L I S A检测I L-6㊁I L-8水平阴性对照组I L-6和I L-8水平最高,随着地塞米松剂量增加,I L-6和I L-8表达水平明显下降且呈浓度依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)㊂见表2㊂表2各组I L-6和I L-8细胞因子水平(x-ʃs,n=4)组别I L-6(m g/L)I L-8(m g/L)空白对照组16.57ʃ2.7826.20ʃ1.42阴性对照组311.41ʃ12.25a198.67ʃ2.45a实验组10m g/L200.64ʃ6.50a b167.21ʃ3.88a b50m g/L160.40ʃ5.55a b c121.82ʃ4.83a b c100m g/L131.63ʃ4.50a b c94.87ʃ3.68a b c150m g/L51.42ʃ3.33a b c d46.03ʃ0.87a b c d注:与空白对照组比较,a P<0.05;与阴性对照组比较,b P< 0.05;与10m g/L组比较,c P<0.05;与100m g/L组比较,d P< 0.053讨论糖皮质激素作为抗炎及免疫抑制药物在临床上应用广泛㊂长期大剂量应用糖皮质激素会造成患者免疫力低下,增加感染的发生几率,而且感染发生后难以控制,病情发展迅速,患者病死率高,现已成为威胁免疫抑制患者生存的主要危险因素之一[4]㊂糖皮质激素抑制免疫应答的机制极为复杂[5]㊂以往的研究认为,糖皮质激素能够抑制巨噬细胞吞噬㊁加工及抗原呈递的功能[6-7]㊂但是目前的研究尚不能合理解释免疫抑制患者易发生严重感染的原因㊂机体针对感染的免疫分为天然免疫和获得性免疫㊂巨噬细胞在天然免疫应答中发挥重要作用[8]㊂机体在受到细菌及其产物如L P S感染后,通过激活巨噬细胞,产生大量炎症介质如T N F-α㊁I L-1和I L-6参与局部炎症反应,并产生I L-8等趋化因子,将多形核白细胞(P MN)等具有更强大吞噬功能的细胞招募到炎症部位清除病原体[9]㊂本研究采用不同剂量地塞米松长时间刺激小鼠巨噬细胞R AW264.7,模拟免疫抑制细胞模型,再用细菌致病性产物L P S(1m g/L)刺激,应用C C K-8和E L I S A研究地塞米松和L P S对小鼠巨噬细胞增殖及细胞因子水平的影响㊂从细胞增殖实验的结果来看,L P S能够明显促进小鼠巨噬细胞R AW264.7的增殖,上调机体识别㊁吞噬及清除病原体的能力㊂而地塞米松对巨噬细胞产生直接毒性作用, R AW264.7细胞经地塞米松作用后细胞生长受到抑制甚至死亡,并呈浓度依赖性㊂显微镜下可以观察到随着地塞米松浓度的增加,小鼠巨噬细胞的形态发生变化,胞内颗粒增加且伪足增多㊂地塞米松能够抑制巨噬细胞的生长增殖,并诱导其死亡[10]㊂㊃219㊃国际呼吸杂志2015年6月第35卷第12期I n t JR e s p i r,J u n e2015,V o l.35,N o.12此外,研究表明地塞米松下调L P S激活巨噬细胞产生的I L-6炎症因子㊂I L-6是一种具有广泛生物学活性的细胞因子,在机体免疫应答及炎症反应中发挥重要作用㊂I L-6可诱导B细胞和细胞毒T 淋巴细胞增殖和分化,调节免疫反应[11]㊂此外, I L-6也是急性期炎症因子,诱导肝脏产生多种急性期蛋白,同时作为内源性致热源,参与炎症反应[12]㊂A n d r i j e v i c等[13]和M c H u g h等[14]认为I L-6与患者肺部感染的轻重程度及预后有关,是造成呼吸道炎症的重要因素之一㊂也有一些学者认为I L-6是T N F-α和I L-1的反调控/抗炎因子,具有抑制炎症反应的作用[15]㊂I L-6与多种呼吸系统疾病的发生㊁发展密切相关,地塞米松通过下调I L-6的表达,降低急性期炎症因子水平及可能存在的局部内源性负反馈机制,造成了病原体的不易被清除㊂I L-8是由单核巨噬细胞释放的趋化性细胞因子,可诱导中性粒细胞㊁嗜酸粒细胞㊁P MN等迁徙和活化[16]㊂I L-8是P MN的强趋化剂,其通过受体与G蛋白耦联,促进细胞内游离C a2+浓度一过性升高,引起P MN脱颗粒,释放蛋白水解酶和花生四烯酸等炎性介质,促进炎症反应[17]㊂大量研究表明趋化因子I L-8促进炎症细胞激活㊁迁移至感染部位,调控急慢性炎症反应,在机体免疫应答中发挥重要作用[18]㊂本研究结果表明长期大剂量应用地塞米松下调趋化因子I L-8的表达,减弱招募中性粒细胞和P MN的能力,使得细胞性防御反应受阻,局部病原体清除率降低,造成感染难以控制㊂因此,结合细胞增殖实验及细胞因子水平的检测,我们认为长期大剂量应用糖皮质激素能够抑制巨噬细胞的增殖,并下调炎症因子I L-6和趋化因子I L-8的表达,减弱局部保护性炎症反应,这可能是免疫抑制患者易发生难以控制感染的机制之一㊂目前,我们的实验尚处在体外实验阶段,仍有很大局限性㊂糖皮质激素调控机体免疫应答的确切机制需要动物实验和临床试验的进一步研究㊂参考文献[1]S a f d a r A,R o d r i g u e z G H.A e r o s o l i z e da m p h o t e r i c i n Bl i p i dc o m p l e xa sad j u n c t i v et re a t m e n tf o r f u ng a l l u n g i n f e c t i o ni np a t i e n t s w i t h c a n c e r-r e l a t e d i mm u n o s u p p r e s s i o n a n dr e c i p i e n t so f h e m a t o p o i e t i c s t e m c e l lt r a n s p l a n t a t i o n[J].P h a r m a c o t h e r a p y,2013,33(10):1035-1043.[2] L iH S,W a t o w i c hS S.I n n a t ei mm u n er e g u l a t i o nb y S T A T-m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m s[J].I mm u n o l R e v,2014,261(1):84-101.[3] B a r t n e c k M,P e t e r s F M,W a r z e c h a K T,e t a l.L i p o 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《2024年灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞某些细胞因子的影响》范文
《灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞某些细胞因子的影响》篇一一、引言灵芝，作为一种传统中药材，具有广泛的药理作用，其中包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等。
其中，灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，其生物活性已得到广泛研究。
巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，在机体对抗病原微生物感染和免疫调节中发挥关键作用。
本研究旨在探讨灵芝多糖对LPS（脂多糖）诱导的小鼠腹腔巨噬细胞某些细胞因子的影响，以期为灵芝多糖的药理作用提供更深入的机制理解。
二、材料与方法1. 材料实验所需灵芝多糖、LPS等试剂均购自专业供应商。
实验动物为小鼠，饲养于本实验室动物房。
2. 方法（1）小鼠腹腔巨噬细胞的分离与培养：采用常规方法分离小鼠腹腔巨噬细胞，并进行培养。
（2）实验分组与处理：将小鼠随机分为对照组、LPS组、灵芝多糖组及灵芝多糖+LPS组。
各组分别进行相应处理，包括LPS 刺激、灵芝多糖干预等。
（3）细胞因子检测：采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中某些细胞因子的含量。
三、结果1. 灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的形态学影响通过显微镜观察，发现LPS刺激后，小鼠腹腔巨噬细胞的形态发生明显变化，细胞体积增大，胞质内出现大量颗粒。
而加入灵芝多糖后，这种形态变化得到一定程度的改善。
2. 灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞某些细胞因子的影响（1）IL-6含量：与对照组相比，LPS组小鼠腹腔巨噬细胞中IL-6含量显著升高；而加入灵芝多糖后，IL-6含量有所降低。
（2）TNF-α含量：与LPS组相比，灵芝多糖+LPS组小鼠腹腔巨噬细胞中TNF-α含量降低。
（3）其他细胞因子：其他如IFN-γ、IL-10等细胞因子在各组间的变化趋势也得到了观察和记录。
四、讨论本研究结果表明，灵芝多糖对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的形态学变化具有一定的改善作用，同时对某些细胞因子的表达也有一定影响。
这表明灵芝多糖可能具有调节巨噬细胞功能的作用，从而在免疫调节和抗炎等方面发挥重要作用。
中性粒细胞胞外诱捕网放大脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应
中性粒细胞胞外诱捕网放大脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应赵宁;李勇;邵强;杨云;陈家泉;彭巍;胡世林;钱克俭;刘芬【摘要】Objective To observe the amplification effect of neutrophil extracellular traps (NETs) on inflammatory response ofalveolar macrophages induced by lipopolysaccharide (LPS). Methods Neutrophils were isolated and extracted from peripheral bloodof C57 BL/6 mice by using a mouse peripheral blood neutrophil separation kit. NETs were induced by PMA (100 nmol/L). Observa-tion of NETs by fluorescence microscopy and scanning electron microscopy. NR8383 rat alveolar macrophages were cultured invitro and divided into ⑴controlgroup:adding equal volume PBS;⑵NETs group:adding prepared (1.7×106 cell/ml) NETs;⑶LPSgroup: adding 1 mg/L LPS; ⑷LPS+NETs group:LPS combined with NETs co-stimulation. All groups were stimulated for 12 hours.Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the contents of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis fac-tor-α (TNF-α) in the supernatant of cells. Results Fluorescence microscopy showed that the nucleus of neutrophils in the controlgroup was complete, and there was no extracellular co-localized reticular structure between DNA and NETs. DNA reticular struc-ture could be seen in PMA stimulation group and co-localized with NETs. Scanning electron microscopy also showed that thechromatin of neutrophils was released into extracellular structure, suggesting that the formation of NETs was successfully inducedby PMA.LPS and NETs were used to stimulate alveolar macrophages for 12 hours respectively, the contents of IL-1β and TNF-αin supernatant of alveolar macrophages were significantly higher than those in control group.The contents of IL-1β in supernatantof LPS+NETs group were significantly higher than those of LPS group (P＜0.05). There was no significant difference in TNF-α insupernatant between LPS +NETs group and LPS group (P＞0.05). Conclusion NETs can amplify LPS-induced inflammation inalveolar macrophages. NETs increased LPS-induced alveolar macrophage inflammatory factor release, suggesting that NETs canamplify LPS-induced alveolar macrophage inflammatory response.%目的观察中性粒细胞胞外诱捕网 (NETs) 对脂多糖 (LPS) 诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应的放大作用.方法采用小鼠外周血中性粒细胞分离试剂盒分离提取C57BL/6小鼠外周血中性粒细胞.采用佛波酯 (PMA) (100nmol/L) 诱导中性粒细胞形成NETs, 采用荧光显微镜及扫描电子显微镜观察NETs.体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383, 分为⑴对照组:加入等体积PBS;⑵NETs组:加入制备好的 (1.7×106个/ml) NETs;⑶LPS组:加入1mg/L LPS;⑷LPS+NETs组:LPS联合NETs共刺激, 各组均刺激12h.采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测细胞上清液中白细胞介素-1β (IL-1β) 、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 含量.结果荧光显微镜下观察示对照组中性粒细胞核形态完整, 无DNA与NETs的胞外共定位网状结构, PMA刺激组可见DNA网状结构, 且与NETs共定位;扫描电子显微镜下也观察到中性粒细胞染色质呈网状结构释放至胞外, 提示PMA诱导NETs形成成功.采用LPS、NETs分别刺激肺泡巨噬细胞12h, 细胞上清液中的IL-1β、TNF-α含量均较对照组显著升高, LPS+NETs组上清液中的IL-1β含量较LPS 组显著升高 (P＜0.05), 上清液中的TNF-α较LPS组相比差异无统计学意义 (P＞0.05).结论 NETs增加LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症因子释放, 提示NETs可以放大LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应.【期刊名称】《江西医药》【年(卷),期】2019(054)001【总页数】4页(P23-26)【关键词】中性粒细胞胞外诱捕网;肺泡巨噬细胞;炎症反应白细胞介素-1β;肿瘤坏死因子-α【作者】赵宁;李勇;邵强;杨云;陈家泉;彭巍;胡世林;钱克俭;刘芬【作者单位】南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院肿瘤科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006;南昌大学第一附属医院重症医学科, 南昌 330006【正文语种】中文【中图分类】R-332中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是中性粒细胞受到炎症刺激后，细胞核内组分如解聚的DNA、组蛋白和颗粒蛋白等释放至细胞外形成的一种网状纤维结构[1]。
lps诱导Hepg2细胞炎症模型步骤
lps诱导Hepg2细胞炎症模型步骤
1、细胞铺板：选择生长状况良好的小鼠巨噬细胞RAW264.7消化，离心后重悬计数，选择合适的细胞浓度稀释（2～3×104/孔）。
2、铺板：将重悬好的细胞液倒入加样槽中，吹打细胞，混匀加样，每孔加入100 µL ，2～3列加样后重新吹打均匀（细胞易沉降），边缘孔每孔加入100 µLPBS。
3、放入细胞培养箱，5 % CO2 、37 ℃条件下继续培养过夜。
4、配药：样品S，配制10 mg/mL溶于1 mL无菌水；样品A，配制200mg/mL溶于1 mL DMSO，分别用高糖DMEM（含10%FBS）稀释成不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8 和1 mg/mL）。
5、将96孔板过夜培养后将完全培养液倒出，按设置的浓度梯度提取物加药，每个浓度设置3个重复样，培养24 h。
6、将已加药培养过夜（加药时细胞接近平铺满孔底）的96 孔板中培养基倒出，每个孔中加入50 µL亚甲基蓝染液。
7、放入细胞培养箱孵育1 小时后取出，洗去亚甲基蓝染色液。
8、测OD 值：每孔加100 µL洗脱液，培养液震荡15 min，放入酶标仪，继续震荡3 min后，595 nm 波长读数。
9、分析数据，需要先得出对照组的平均值，各个实验数据/对照平均值×100%得出细胞存活率，算出各个数值之间的偏差，分析药物对细胞的毒性。
麦角甾醇对LPS诱导的肺损伤小鼠的抗炎作用研究
麦角甾醇对LPS诱导的肺损伤小鼠的抗炎作用研究葛金林;曾余丰;钱俊敏;金晨慈【摘要】目的研究麦角甾醇对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的抗炎作用研究.方法取50只雄性BABL/c小鼠随机分为5组:空白对照组、模型组、地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇低剂量组(20 mg/kg)、麦角甾醇高剂量组(40 mg/kg).空白对照组和模型组按体积给予生理盐水,地塞米松组(2 mg/kg)、麦角甾醇组(20、40 mg/kg)灌胃给予相应药物.给药1h后,除空白对照组,其余各组小鼠气管滴注20 μg LPS.检测小鼠肺干湿重比(W/D),肺泡灌洗液(BALF)中超氧化物歧化酶(SOD)水平、丙二醛(MDA)含量,血清与肺泡灌洗液炎性细胞因子(TNF-oα、IL-1β、IL-6)水平.取各组小鼠肺组织做HE染色,并检测肺组织Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、NF-κBP65、p-IκBoα、IκBα蛋白表达.结果麦角甾醇20、40 mg/kg能显著提升LPS诱导的急性肺损伤小鼠血清SOD水平,降低MDA含量;改善血清及肺泡灌洗液炎症因子水平和肺组织病理学改变;降低肺组织Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、p-IκB α蛋白表达.结论麦角甾醇对LPS诱导的急性肺损伤小鼠有保护作用,其作用可能与Rho/ROCK/NF-κB信号通路有关.%Objective To investigate the anti-inflammatory effect of ergosterin on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI).Methods Totally 50 BABL/c mice were divided into 5 groups randomly:control group,model group,dexamethasone group (2 mg/kg),ergosterin (20 mg/kg),ergosterin (40 mg/kg).The mice were given ergosterin or dexamethasone at 1 h before intratracheal instillation of LPS.The lung wet-to-dry weight (W/D) ratio,the level of super oxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),and thelevels of tumor necrosis factor-oα (TNF-α),interleukin-1 β (IL-1 β) and interleukin-6 (IL-6) in BALF were detected.The protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65,NF-κBP65,p-IκBoα and IκBα in lung tissue was analyzed.Results Ergosterin of 20 mg/kg and 40 mg/kg could increase the level of SOD and decrease the content of MDA,and improve the levels of pro-inflammatory cytokines in serum and BALF and pathological changes.It could also decrease the protein expression ofRho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65 and p-IκBα in lung tissue.Conclusion Ergosterin can ameliorate the LPS-induced acute lung injury in mice and its related mechanism might be related to inhibition of Rho/ROCK/NF-κB pathway.【期刊名称】《实用药物与临床》【年(卷),期】2017(020)012【总页数】5页(P1361-1365)【关键词】麦角甾醇;肺损伤;Rho/ROCK/NF-κB【作者】葛金林;曾余丰;钱俊敏;金晨慈【作者单位】温州市中西医结合医院呼吸内科,浙江温州325000;温州市中西医结合医院呼吸内科,浙江温州325000;永嘉县人民医院呼吸内科,浙江温州325100;温州市中西医结合医院呼吸内科,浙江温州325000【正文语种】中文急性肺损伤是指各种直接和间接致伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全[1]。
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达【摘要】目的：研究脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤机制。
方法：实验分为正常对照组、模型组及抗体组；正常对照组小鼠腹腔腔内注射等量0.9%NaCl。
模型组腹腔内注射LPS（4 mg/kg）。
抗体组在造模前8～10 h，应用小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2（TLR4/MD2）复合物抗体腹腔内注射50 μg。
各组均在造模5 h后留取血和肺组织，采用细菌内毒动态浊度法检测血浆LPS的含量，HE染色判定小鼠肺组织病理变化，RT-PCR测定小鼠肺组织TLR4基因表达，Western-blot测定TLR4蛋白表达；ELISA检测小鼠血清中TNF-α的水平。
结果：和正常对照组比较，模型组及抗体组小鼠血浆内毒素含量显著升高（P<0.05），模型组小鼠肺组织HE染色呈ALI表现；和模型组比较，抗体组TLR4 mRNA、蛋白及TNF-α的表达明显下调（P<0.05）。
结论：急性肺损伤机制可能与LPS和TLR4受体结合介导TNF-α信号途径相关。
【关键词】脂多糖；急性肺损伤； Toll样受体4；肿瘤坏死因子-αExpression of Toll Like Receptor 4 and TNF-α on Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide inMice/GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng.//Medical Innovation of China，2015，12（24）：016-019【Abstract】 Objective：To study mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice.Method：The mice were randomly divided into normal control group， model group and antibody group.Control group was given 0.9%NaCl. Model group of acute lung injury was induced by LPS at a dose of 4 mg/kg. Aitibody group mice were given anti-TLR4/MD antibody（50 μg）before 8-10 h of building model group. Blood and lung tissue were taken after modeling in 4 hours. A mount of endotoxin in plasma was measured by kinetic turbidimetric assay.Degree of lung damage was grated by HE staining. Expressions of TLR4 at both mRNA and protein levels were measured by RT-PCR and Western Blot.Content of TNF-α in mice serum was detected by ELISA.Result：Compared with the control group，endotoxin in serum，in model group and ayibody group significantly increased（P<0.05），with obvious ALI lung damages in model pared with the model group，antibody group presented that expression of TLR4 mRNAand protein lower regulated（P<0.05） and ELISA results of TNF-αsignificantly decreased （P<0.05）.Conclusion：The mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide may be related to TLR4 signal passway that mediates the TNF-α level.【Key words】 Lipopolysaccharide； ALI； Toll like receptor 4； TNF-αFirst-author’s address：The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001，Chinadoi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.24.006 急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是在创伤、重症感染、休克等等非心源性疾病过程中，肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭[1]；脂多糖（LPS）诱导的ALI在重症感染后早期出现[2]，并且死亡率较高[3]。
甲酰肽受体-2促进LPS诱导的BV-2细胞炎症反应
甲酰肽受体-2促进LPS诱导的BV-2细胞炎症反应王青;宋丽娟;尉杰忠;杨智超;姜维佳;李艳花;郭文娟;马存根【摘要】目的考察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活的BV-2细胞中甲酰肽受体-2(formyl peptide receptor-2,FPR2)的表达及其对细胞炎症反应的作用.方法 1 mg· L-1的LPS刺激BV-2细胞12 h,建立体外小胶质细胞炎症模型.Western blot 法检测FPR2的表达;分别用FPR2特异性激动剂MMK-1和拮抗剂Boc-2孵育LPS-BV-2细胞后,ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)的分泌情况;Western blot法检测下游信号分子NF-κB的磷酸化;Transwell小室法考察LPS-BV-2细胞的迁移情况.结果 LPS可使BV-2细胞上的FPR2表达上调,并激活NF-κB.与LPS组比较,激动剂MMK-1可促进LPS-BV-2细胞的TNF-α、IL-1β的分泌和趋化,拮抗剂Boc-2可抑制这些反应.结论 LPS可诱导BV-2细胞膜表面FPR2表达上调,FPR2可使LPS诱发的炎症反应增强.%Aim To investigate the expression of formyl peptide receptor-2 (FPR2) in lipopolysaccharide (LPS)-induced-BV-2 cells,and detect FPR2's influence on inflammatory response induced by LPS.Methods After 1mg · L-1 LPS acting on BV-2 cells at 12 h,the extrinsic inflammatory model was established.We used the Western blot assay to test the levels of FPR2 protein.And the expressions of phosphorylated NF-κB,TNF-α and IL-1β were investigated when the LPS-induced-BV-2 was incubated with FPR2's agonist MMK-1 and antagonist Boc-2.Transwell assay was also used to detect the LPS-inducedBV-2 migration induced by MMK-1 and Boc-2.Resuits LPS up-regulated the expression of FPR2,and when its agonist was acted on LPS-induced-BV-2,the levels of phosphorylated NF-κB,TNF-αand IL-1β were significantly higher than those of LPS group.In addition,the chemotaxis of LPS-induced-BV-2 also increased by MMK-1.These effects were abolished by Boc-2.Conclusions LPS can increase the expression of FPR2 on BV-2 cells,and FPR2 enhances the inflammatory response induced by LPS.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2018(034)002【总页数】6页(P202-207)【关键词】脂多糖;BV-2细胞;FPR2;小胶质细胞;炎症因子;细胞趋化【作者】王青;宋丽娟;尉杰忠;杨智超;姜维佳;李艳花;郭文娟;马存根【作者单位】山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西大同大学脑科学研究所,山西大同037009;山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西大同大学脑科学研究所,山西大同037009;山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西中医药大学国家中医药管理局益气活血重点研究室,山西太原030024;山西大同大学脑科学研究所,山西大同037009【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R322.8;R364.5;R392.11;R392.12小胶质细胞(microglia, MG)分布于整个中枢神经系统，属于单核吞噬细胞，是中枢神经系统最主要的免疫防线。
IL-2对布鲁菌侵染小鼠巨噬细胞释放细胞因子及吞噬能力的调节作用
中 图 分 类 号 ：￥８５２．６１４
文 献 标 识 码 ：Ａ
文 章 编 号 ：１００７—５０３８（２０１８）０４—０００１—０６
白介 素 ２（ＩＬ一２）是 一 种 调 控 免疫 应答 的重 要 因 子 ＿１］，它 具 有多 向性 作 用 （主 要 是 对 淋 巴细 胞 生 长 、 增 殖 、分 化 的促进 ），对机 体 的免 疫应 答 和抗 病 菌 、病 毒 等有 重要 作 用 ，能 活 化 Ｔ 细 胞 ，促 进 细 胞 因 子 产 生 ，刺激 自然杀 伤细 胞 （ＮＫ 细 胞 ）增 殖 ，提高 ＮＫ 细 胞 杀伤 活性 及 产 生 细 胞 因子 ＿２］，淋 巴 因子 激 活 的 杀 伤 细胞 （ＬＡＫ 细胞 ）的诱 导 产生 ；促进 Ｂ细 胞增 殖 和 分 泌抗体 ；具 有 广 泛 的 生 物 活性 （激 活 巨 噬 细胞 ，参 与抗 体反 应 、造 血 和 肿 瘤 监 视 ）。单 核 一巨 噬 细胞 受 到 ＩＬ－２的持续作 用 后 ，其 抗 原 递呈 能 力 、杀 菌 力 、细 胞毒 性均 明显增 强 ，分 泌某 些 细胞 因 子 的 能 力也 得 到加 强 。
研究 发 现 ，ＩＬ一２对 于一 些 疾 病 的 治疗 或癌 症 细 胞 的作 用 已取 得 了 一 系 列 的成 果 ｜４ ］。Ｒｏｖｉｅｌｌｏ Ｇ 等 研 究 结果 表 明 ，ＩＬ一２对 黑 色 素 瘤 或 肾 以外 的 实 体 肿瘤 有 重 要 作 用 。Ａｂｈｉｓｈｅｋ Ｋ 等 详 细 阐述 了 ＩＬ一２与登 革热 严重 程度 的关 系 ，结 果 表 明 ＩＬ一２对 登 革 热治 疗 有 重 要 的 作 用 。 熊一 全 等［ｇ］就 ＩＬ一２增 强 淋 巴细 胞 对乳 腺 癌 细 胞 的杀 伤作 用研 究 ，表 明 ＩＬ一２ 能促 进 淋 巴细胞 对 ＭＣＦ一７的杀 伤作 用 。但对 于 ＩＬ一 ２在 布鲁 菌病 （简称 布 病 ）炎症 反 应 中 的作 用 尚不 清 楚 ，由于布病 是 一 种 世 界 范 围 内流 行 的高 度 接 触 性
CRISPLD2蛋白对内毒素-诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠炎性因子表达的影响
CRISPLD2蛋白对内毒素-诱导急性呼吸窘迫综合征小鼠炎性因子表达的影响刘雪峰;李文放;林兆奋【摘要】目的探讨CRISPLD2蛋白对内毒素-诱导急性呼吸窘迫综合征(LPS-ARDS)小鼠体内炎性因子表达的影响.方法采用数字表法将40只雄性昆明小鼠随机分5组:对照组(A组),气道内滴入0.1 mg内毒素(LPS);rCRISPLD2蛋白1组(B 组)、rCRISPLD2蛋白2组(C组),小鼠尾静脉分别注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白,6 h后气道内滴入0.1mg LPS;rC-RISPLD2蛋白3组(D组)、rCRISPLD2蛋白4组(E组),予小鼠气道内滴入0.1mg LPS,6 h后予小鼠尾静脉分别注射1.0、0.4 mg rCRISPLD2蛋白.每组小鼠在LPS气道滴入后第12 h收集支气管肺泡灌洗液(BALF),离心后计数沉淀中性粒细胞,测量上清液及血标本中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及IL-6.结果 B、C组BALF中的中性粒细胞计数(0.31±0.07、0.76±0.08)ng/L、TNF-α(8.88±17.37、134.63±24.44)ng/L、IL-1β(48.63±15.61、99.75±12.30)ng/L、IL-6(80.75±21.03、140.12±29.29)ng/L均明显低于A、D、E组(1.64±0.10、1.73±0.13、1.65±0.08),差异有统计学意义(P<0.05);B组以上检测值均明显低于C组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 CRISPLD2蛋白可下调LPS所诱导的炎症因子表达水平,并且呈现一定的剂量依赖关系.%Objective To investigate the effect of CRISPLD 2 protein on the expression of inflammatory cytokine in LPS-in-duced acute respiratory distress syndromes ( ARDSs) mice.Methods Forty male Kunming mice were randomly divided into 5 groups;the control group (group A), which was given 0.1mg LPS via the intratracheal instillation;the rCRISPLD2 group 1 (group B) and the rCRISPLD2 group 2 (group C), whichwere respectively treated with 1mg and 0.4mg rCRISPLD2 by tail vein, and after 6 hours rC-RISPLD2 was injected intratracheally;the rCRISPLD2 group 3 (group D) and the rCRISPLD2 group 4 (group E), which were first given 0.1mg LPS intratracheally and then were injected with 1mg and 0.4mg rCRISPLD2 by tail vein.At hour 12 after intratracheal in-jection of LPS in the mice of all the groups , bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was collected.After centrifugation, the number of neutrophils was counted , and the levels of TNF-α, IL-1βand IL-6 were detected in supernatant fluid and blood samples .Results The number of neutrophils(0.31 ±0.07、0.76 ±0.08), T NF-α(8.88 ±17.37、134.63 ±24.44), IL-1β(48.63 ±15.61, 99.75±12.30) and IL-6 (80.75 ±21.03,140.12 ±29.29)in serum and BALF in groups B and C were all significantly lower than those of group A , D and E, and statistical significance could be noted , when comparisons were made between these groups (P<0.05).The detected data of group B were obviously lower than those of group C , also with statistical significance (P<0.05).Conclusion rCRISPLD2 could down-regulate the expression levels of LPS-induced inflammatory factors , and dosage dependence could be noted to a certain extent .【期刊名称】《海军医学杂志》【年(卷),期】2017(038)006【总页数】3页(P503-505)【关键词】CRISPLD2蛋白;内毒素;急性呼吸窘迫综合征;炎症因子【作者】刘雪峰;李文放;林兆奋【作者单位】200003 上海,上海长征医院急救科;200003 上海,上海长征医院急救科;200003 上海,上海长征医院急救科【正文语种】中文【中图分类】R576急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是由多种肺内外因素所诱发的以顽固性低氧血症为主要临床表现的一组临床综合征[1]，肺泡上皮细胞以及肺毛细血管内皮细胞的弥漫性损伤是其病理特征。
肺泡Ⅱ型上皮细胞与巨噬细胞之间的相互作用在急性呼吸窘迫综合征中的影响
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通信作者:宋元林,Ema
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【摘要】
急性呼吸窘迫 综 合 征 的 病 死 率 较 高, 特 异 性 的 治 疗 方 法 还 未 出 现。 在 病 理 进 程
中,肺泡 Ⅱ 型上皮细胞和巨噬细 胞 之 间 的 相 互 作 用 对 病 情 产 生 了 一 定 的 影 响, 因 此 开 发 基 于 细
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同的细胞类型组成。其中,ATⅡ 是合成和分 泌 肺 泡 表 面 活
性物质的主要细 胞, 并 且 被 认 为 是 肺 泡 上 皮 的 祖 细 胞。 在
[
4]
刺激下,其可分化为 以 促 进 炎 症 为 主 的 M1 型 巨 噬 细 胞 或
的起始阶段,采 取 ATⅡ 补 充 替 代 治 疗 并 不 利 于 ARDS 的
而加重炎症反应。
以抑制炎症、促进修复为主的 M2 型巨噬细胞 [6]。 M1 型 巨
2 ATⅡ 与肺巨噬细胞在 ARDS 急性炎症期的交互作用
患者发展为危重 疾 病 [1]。 低 潮 气 量 通 气、 神 经 肌 肉 阻 滞 等
醛肽类蛋白酶体抑制剂对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响
醛肽类蛋白酶体抑制剂对LPS诱导小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响徐波;邢丞;李敏;孙婉;崔景荣【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2009(025)005【摘要】目的:探讨醛肽类蛋白酶体抑制剂MG132对脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞Raw264.7 核转录因子-κB(NF-κB)活化、炎性因子一氧化氮(NO)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)分泌以及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响.方法:利用报告基因检测法分析转染细胞(pNiFty-SEAP/HEK293)中NF-κB的活性;采用DAF-2DA荧光探针法检测Raw264.7细胞内NO的产生;蛋白免疫印迹法探讨细胞中iNOS和IκB-α蛋白表达情况;酶联免疫吸附法测定Raw264.7细胞上清中TNF-α的含量.结果:预先加入MG132能够显著抑制LPS诱导的TNF-α分泌,其抑制率由5 μmol/L 时的36.7%升高到10 μmol/L时的60.4%.反映NO含量的荧光强度值随着MG132给药浓度的增加而降低,其抑制率从2 μmol/L时的29.5%达到10μmol/L的55.9%.预刺激后MG132可使胞浆中iNOS蛋白表达减少,IκB-α蛋白却明显增加,NF-κB的活性随着给药浓度的升高而不断降低.结论:MG132能够抑制LPS诱导的TNF-α和NO的产生,减少iNOS表达,具有抗炎作用.其作用机制可能与IκB降解受阻,导致NF-κB活性降低有关.【总页数】5页(P988-992)【作者】徐波;邢丞;李敏;孙婉;崔景荣【作者单位】北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083;北京大学医学部天然药物及仿生药物国家重点实验室,北京,100083【正文语种】中文【中图分类】R363【相关文献】1.血管活性肠肽对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞表达MMP-9的影响 [J], 刘永平;管茶香;白洪波;秦晓群;刘惠君2.肾上腺素对脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞炎症介质表达的影响 [J], 张力;叶笃筠;吴萍;万敬员;张代娟;吴涛;周小燕3.TLR2和TLR4受体封闭肽对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的影响[J], 钱英红;徐博然;刘博;曹金山;关红;毛伟4.紫锥菊不定根对LPS诱导的小鼠巨噬细胞促炎介质的影响 [J], 韩璐;田文;高原;廉美兰;朴炫春5.雷公藤内酯醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症相关因子的影响 [J], 陈楠楠; 毕懿康因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
白藜芦醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO和炎性因子生成的调控
白藜芦醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO和炎性因子生成的调控张申;卫涛涛【期刊名称】《怀化医专学报》【年(卷),期】2007(006)002【摘要】目的探讨白藜芦醇（Res）对内毒素（LPS）诱导小鼠腹腔巨噬细胞核因子-κB（NF—κB）活化及炎性细胞因子（TNF—α、IL—1β、IL-6）基因表达的调节，为Res的临床运用提供理论依据。
方法分别用LPS或Res＋LPS处理体外培养的小鼠巨噬细胞，采用电子顺磁共振（EPR）自旋捕集技术直接检测巨噬细胞产生的NO，电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测细胞中NF—κB活性，逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中TNF—α、IL—1β、IL-6 mRNA和蛋白的表达。
结果表明LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量在刺激后2—12h明显高于正常对照组（P〈0．01），而Res＋LPS组NO含量、NF—κB活性和TNF—α、IL-1β、IL-6含量均显著低于LPS组（P〈0．01）。
结论提示LPS可诱导巨噬细胞NF—KB活化，导致TNF-α、IL-1β、IL-6基因表达增强，而Res能抑制NF—κB活化而调节TNF—α、IL-1β、IL-6基因的表达。
【总页数】5页(P9-13)【作者】张申;卫涛涛【作者单位】怀化医专医学检验系,湖南怀化418000;中国科学院生物物理研究所,北京100101【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.黄药子甲醇提取物对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞释放NO及iNOS表达的影响 [J], 刘佳;王蝉;刘培;钱之玉2.TLR2和TLR4受体封闭肽对LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α表达的影响[J], 钱英红;徐博然;刘博;曹金山;关红;毛伟3.LPS和PMA诱导小鼠腹腔巨噬细胞的PKC—α和PKC—ε的激活与转位 [J], 林明群;张宗梁4.雷公藤内酯醇对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎症相关因子的影响 [J], 陈楠楠; 毕懿康5.ERK1/2信号通路参与LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达的调节 [J], 苏踊跃;罗向东;杨宗城因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
LBP对LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子的调节作用
LBP对LPS刺激巨噬细胞分泌细胞因子的调节作用舒旷怡;张颖;杨锦红;任凭;杨爱平;余玲玲;李向阳【摘要】目的采用脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖(LPS)以不同比例、不同方式刺激THP-1细胞分泌细胞因子,探讨LBP在LPS转运和活化过程中的调节作用,以及单核巨噬细胞受LPS活化后其炎性和负炎性因子分泌的平衡情况.方法将THP-1细胞进行增殖和传代后,经PMA刺激,转化为巨噬细胞.实验分为4个组:LPS组(用不同浓度LPS单独刺激)、LBP组(用不同浓度LBP单独刺激)、LBP/LPS预孵育组(LBP和LPS以不同浓度比例混合,37℃孵育15min)、LBP/LPS不孵育组(先加一定浓度LPS,再以不同浓度比例加入LBP).分别培养4、12、24h后,吸出上清液,发光法检测TNF-α,IL-10和IL-6水平,并进行统计学分析.结果 THP-1细胞为悬浮生长,用PMA诱导转化后变为巨噬细胞,变为贴壁生长.分别用1、10、100、1000ng/ml LPS单独刺激巨噬细胞分泌TNF-α,1ng/ml和其他组间均有统计学差异(P<0.05),其余3组间无统计学差异(P>0.05).用LBP刺激巨噬细胞,LBP浓度为1000ng/ml时,TNF-α和IL-6分泌达到最高.LBP/LPS不孵育组中,TNF-α和IL-6分泌曲线在LBP/LPS为10出现最高峰.LBP/LPS预孵育组的TNF-α和IL-6分泌曲线较平缓,无明显分泌高峰.LPS浓度为1000ng/ml时IL-10为8±0pg/ml,其余组IL-10均小于5pg/ml.经析因分析,LPS和LBP之间有交互关系(F=3.425,P<0.01),两者是否预孵育和培养时间有交互作用(F=4.240,P=0.026),LBP浓度和是否预孵育之间有交互作用(F=4.896,P<0.01).LPS浓度和是否预孵育,LPS浓度和培养时间,LBP浓度和培养时间均无明显交互作用(P>0.05).结论 LPS是活化单核巨噬细胞的重要物质,LPS在高浓度时刺激巨噬细胞分泌细胞因子具有饱和现象.LBP本身在高浓度时具有刺激巨噬细胞的活性,低浓度的LBP能增强LPS对巨噬细胞的活化,高浓度LBP则起到负性调节作用.体外单核细胞经PMA分化成巨噬细胞后,再用LPS刺激,IL-10无明显分泌,引起炎性和负炎性因子的严重失衡.【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2010(035)008【总页数】5页(P937-941)【关键词】脂多糖类;脂多糖结合蛋白;肿瘤坏死因子α;白细胞介素-10;白细胞介素-6【作者】舒旷怡;张颖;杨锦红;任凭;杨爱平;余玲玲;李向阳【作者单位】325027,温州,温州医学院附属第二医院检验科;325027,温州,温州医学院第二临床学院;325027,温州,温州医学院附属第二医院检验科;325027,温州,温州医学院检验学院生命科学学院联合学院;325027,温州,温州医学院第二临床学院;325027,温州,温州医学院附属第二医院检验科;325027,温州,温州医学院附属第二医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R349.5在革兰阴性杆菌引起的败血症中,内毒素是最关键的激活因子。
野生蒙古口蘑多糖通过NFE2L2通路对LPS诱导的巨噬细胞发挥抗炎和抗氧化调节作用
野生蒙古口蘑多糖通过NFE2L2通路对LPS诱导的巨噬细胞发挥抗炎和抗氧化调节作用武春燕;冯福应【摘要】目的:研究蒙古口蘑多糖提取物对脂多糖诱导小鼠单核巨噬细胞的抗炎和抗氧化保护作用的机理.方法与结果:蒙古口蘑多糖提取物对RAW264.7的作用与LPS模型组相比,蒙古口蘑多糖提取物在下列浓度0.01、0.1、1、10μg/mL均能有效抑制NO、TNF-α和IL-6的产生;在浓度为10μg/ml的蒙古口蘑多糖提取物作用下,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的mRNA的表达量均显著升高;免疫印迹的结果表明,除NF-κB外NFE2L2、iNOS和HO-1的蛋白的表达量均有不同程度的升高.结论:蒙古口蘑多糖提取物对LPS诱导的RAW264.7具有保护作用,其抗炎抗氧化的机制通过NFE2L2和iNOS信号通路实现,而不主要通过NF-κB信号通路发挥作用.【期刊名称】《现代农业》【年(卷),期】2018(000)010【总页数】3页(P79-81)【关键词】蒙古口蘑多糖提取物;RAW264.7细胞;脂多糖;诱导型一氧化氮和酶【作者】武春燕;冯福应【作者单位】内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特 010018【正文语种】中文1 实验材料与方法1.1 材料、试剂及仪器CCK-8kit、LPS、RNA 提取试剂盒、GoScript reverse transcription mix Oligo （dT）、Thunderbird SYBRqPCRMix、RPMI1640培养基、胎牛血清FBS（BI）、Anti-NFE2L2antibody、iNOSRabbitPolyclonal antibody、NF-κB RabbitPolyclonalantibody、HO-1 RabbitPolyclonalantibody、Anti-GAPDHMonoclonal Antibody、HRPaffinipureGoatAnti-RabbitigG （H+L）、HRPaffinipureGoatAnti-MouseigG（H+L）、超敏ECL化学发光试剂盒、MouseIL-6ELISAkit（小鼠白细胞介素-6）、MouseTNF-α ELISAkit。
血管紧张素Ⅱ协同LPS诱导巨噬细胞活化和凋亡的研究
血管紧张素Ⅱ协同LPS诱导巨噬细胞活化和凋亡的研究李妍;张宸豪;方芳;王长文;陈爽;李强;赵良中;陈为【摘要】为了研究血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞活化和凋亡的影响,在体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,流式细胞术分析不同浓度AngⅡ对细胞TLR4表达的影响;AngⅡ处理细胞8h后用LPS诱导细胞,流式细胞术分析细胞内活性氧(ROS),pH值,细胞凋亡和线粒体膜电位.通过研究发现,AngⅡ以浓度依赖的方式上调小鼠巨噬TLR4表达,而在AngⅡ与LPS协同诱导后,细胞内ROS含量显著增加,pH值下降幅度也较LPS单独作用组增大;与LPS单独作用比较,An gⅡ与LPS协同诱导增加了巨噬细胞凋亡和线粒体损伤效应.表明AngⅡ对LPS活化巨噬细胞具有增敏作用,同时也促进LPS诱导的细胞凋亡.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2015(051)002【总页数】3页(P3-5)【关键词】血管紧张素Ⅱ;脂多糖;巨噬细胞【作者】李妍;张宸豪;方芳;王长文;陈爽;李强;赵良中;陈为【作者单位】吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院公共卫生学院,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院检验学院,吉林吉林132013;吉林医药学院基础医学院,吉林吉林132013【正文语种】中文【中图分类】R363血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）中重要的效应因子，与AngⅡ1型受体（AngⅡtype 1，AT1)结合可促进血管平滑肌收缩，参与血压调节[1]。
单核巨噬细胞也表达AT1，在AngⅡ诱导后，其Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）表达增加；而TLR4与脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）结合可介导巨噬细胞活化信号转导[2]。
厄洛替尼对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应和小鼠急性肺损伤的影响
厄洛替尼对脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应和小鼠急性肺损伤的影响王晓菲;秦再生【摘要】目的:探讨厄洛替尼对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞产生的炎症反应和小鼠急性肺损伤(ALI)的影响,阐明其作用机制.方法:原代培养的小鼠骨髓来源的巨噬细胞随机分为对照组、厄洛替尼组、LPS组和LPS+厄洛替尼组.采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;Western blotting法检测各组巨噬细胞中ERK1/2和p38磷酸化水平.16只C57BL/6小鼠随机分为对照组(生理盐水灌胃3d,腹腔注射生理盐水1次)、厄洛替尼组(45 mg·kg-1厄洛替尼预处理3d,腹腔注射生理盐水1次)、LPS组(生理盐水灌胃3d,腹腔注射5 mg·kg-1LPS)和LPS+厄洛替尼组(45 mg·kg-1厄洛替尼连续3d灌胃,腹腔注射5 mg·kg-1 LPS).ELISA法检测各组小鼠血清中TNF-α的表达水平;Western blotting 法检测各组小鼠肺组织中ERK1/2和p38磷酸化水平;HE染色观察各组小鼠肺组织病理形态表现.结果:与对照组比较,厄洛替尼组巨噬细胞和小鼠血清中TNF-α水平、ERK1/2和p38蛋白磷酸化水平差异无统计学义(P＞0.05),小鼠肺组织形态无明显改变;与厄洛替尼组比较,LPS组巨噬细胞和小鼠血清中TNF-α水平明显升高(P＜0.05),巨噬细胞和肺组织中ERK1/2和p38蛋白磷酸化水平明显升高(P＜0.05),小鼠肺组织出现ALI改变;与LPS组比较,LPS+厄洛替尼组巨噬细胞和小鼠血清中TNF-α表达水平明显降低(P＜0.05),巨噬细胞和肺组织中ERK1/2和p38蛋白磷酸化水平降低(P＜0.05),小鼠肺组织ALI病理状态改善.结论:厄洛替尼可以抑制巨噬细胞炎症通路蛋白ERK1/2和p38的磷酸化水平及炎症因子TNF-α的生成,降低ALI小鼠的全身炎症反应,在一定程度上对ALI有保护作用.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(042)003【总页数】6页(P457-461,后插1)【关键词】厄洛替尼;巨噬细胞;肿瘤坏死因子α;急性肺损伤【作者】王晓菲;秦再生【作者单位】南方医科大学南方医院麻醉科,广东广州510515;南方医科大学南方医院麻醉科,广东广州510515【正文语种】中文【中图分类】R563巨噬细胞是机体的固有免疫细胞，当外来病原体进入机体后，可以被细菌内毒素激活而产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素1β((interleukin-1β，IL-1β)和白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)等。
巨噬细胞炎症蛋白-2和细胞凋亡在内毒素诱导急性肺损伤发病中的作用探讨
巨噬细胞炎症蛋白-2和细胞凋亡在内毒素诱导急性肺损伤发病中的作用探讨肖敏;范红;文富强;冯玉麟;王刚【期刊名称】《中国现代医学杂志》【年(卷),期】2007(17)11【摘要】目的探讨巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)和细胞凋亡在小鼠内毒素诱导急性肺损伤发病机制中的作用.方法以脂多糖气管内注射建立小鼠急性肺损伤模型,进行肺组织病理、肺水含量、支气管肺泡灌洗液白细胞总数和中性粒细胞分类计数、TNF-α和MIP-2浓度检测,并作肺组织凋亡细胞计数.结果气管内注射LPS后.肺水含量、肺泡灌洗液白细胞总数和中性粒细胞分类计数、TNF-α和MIP-2浓度及肺组织凋亡细胞计数均明显升高,且随时间推移呈逐渐变化的趋势.结论 MIP-2是炎症早期的促炎性细胞因子,其在早期短期急剧释放可趋化和激活中性粒细胞并诱导肺组织细胞凋亡,从而启动与维持炎症反应.【总页数】5页(P1304-1308)【作者】肖敏;范红;文富强;冯玉麟;王刚【作者单位】四川大学华西医院呼吸科,四川,成都,610041;四川大学华西医院呼吸科,四川,成都,610041;四川大学华西医院呼吸科,四川,成都,610041;四川大学华西医院呼吸科,四川,成都,610041;四川大学华西医院呼吸科,四川,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】R-332;R392.12【相关文献】1.巨噬细胞炎症蛋白-2在内毒素性急性肺损伤中的作用 [J], 金敬顺;陈正堂;李胜亮2.高迁移率族蛋白1在内毒素急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能改变中的作用[J], 杨庆华;冯英凯;胡明冬3.脂多糖诱导多形核白细胞和肺泡巨噬细胞凋亡异常在急性肺损伤发病中的意义[J], 宋勇;毛宝龄4.内毒素诱导大鼠急性肺损伤巨噬细胞炎症蛋白-2的表达及巨噬细胞的作用 [J], 金敬顺;陈正堂;李胜亮5.内毒素诱导急性肺损伤巨噬细胞炎症蛋白-2的表达 [J], 金敬顺;陈正堂;李胜亮因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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网 络 出 版 时 间 ：2018 - 4 - 27 9 :40 网 络 出 版 地 址 ： http ://k n s . cnki. n e t/k c m s/d e ta il/3 4 . 1065. < 20180426. 1 4 1 1 .0 1 5 . htm l
MeCP2 增 加 LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞的炎症因子分泌
甲基化 C p G 结合蛋白（methyl-CpG-Xinding pro tein 2 ，MeCP2 )是一种甲 基化调控蛋白 ，能够特异性 与甲基化D F A 结合，形成复合物来抑制目的蛋白转 录。众多文献[ 1_2] 报道，M e C P 2 能够通过调控甲基 化水平参与细胞的增殖、迁移、凋亡等多种生理病理 过程。研究[*23] 表 明 M e C P 2 可 以 通 过 PTCH1/GLIS1 通路调控人急性单核细胞白血病单核细胞株分泌白 介 素 （interleukin，IL )- 6 和 肿 瘤 坏 死 因 子 （tumour necrosis factor，T N F ) - 的表达，但是 M e C P 2 在炎症 性肺病中的作用未见报道。该 研 究 通 过 / R N A 沉 默等技术抑制M e C P 2 的表达，探讨其对小鼠肺泡巨 噬细胞小鼠肺泡巨噬细胞（M H - S )分泌炎症因子IL1 ( 、IL-6和 T N F - 的作用，为炎症性肺病提供基础 研究。
group (cultured
with 5 0 % E P C - C M and
1 0 0 % E P C - C M group (cultured with 1 0 0 % E P C - C M ) •The proliferation activity of the A D S C s were tested by the
郑 松 w ，王殿超w ，张 磊 3
摘 要 目 的 探 讨 甲 基 化 C p b 结 合 蛋 白 （M 5 P 2 ) 对 小 鼠 肺 泡 巨 噬 细 胞 M H -S分 泌 炎 症 因 子 的 作 用 。方 法 采 用 M e C P 2 -siR N A 抑 制 M eC P 2 表 达 ，使 用 Q - P C R 、E L IS A 和 W e / e m X 9 方 法 检 测 M e C P 2 、白 介 素 （] ) - 1 ( 1 1 6 、肿 瘤 坏 死 因 子 （T F F ) > 、p > 6 5 和 p - I KB & 的 表 达 情 况 。 结 果 Q P C R 和 E L I S A 结 果 显 示 脂 多 糖 （L P S ) 能 够 诱 导 M H - S 分 泌 炎 症 因 子 I L - 1 ( 、I L - 6 和 T F F - & 并 且 M e C P 2 表 达 也 随 之 显 著 升 高 （！ < 0 . 0 1 ) 。 使 用 M 5 P 2 - / R F A 抑 制 M 5 P 2 表 达 后 ，炎 症 因 子 I L - 1 ( 、I L > 和 T F F > 表 达 明 显 降 低 ，同 时 p - 6 5 和 p - I KB & 表 达 也 显 著 下 调 （！ < 0 . 0 1 ) 。 结 论 抑 制 M 5 P 2 表 达 能 够 抑 制 L P S 刺 激 M H - S 细 胞 分 泌 炎 症 因 子 ，可 能 是 通 过 抑 制 N F > B 的 活 化 ，但 具 体 机 制 尚 需 进 一 步 研 究 。
CCK-8 method. Alizarin redstaining and A L P staining was used to qualitative analysis A D S C osteogenetic differen
tiation ability. Quantitative teselial progenitor cells(EPCs). E P C - C M was divided into three different concentrations:the control
group (cultured with L G - D M E M ) ，5 0 % E P C - C M
2018 -0 1 -3 1 2 收 基 金 项 目 ：国家自然科学基金青年科学基金（编 号 :81100302) 作 者 单 位 : 1 安徽省胸科医院，合 肥 230022
2 安徽医科大学胸科临床学院，合 肥 230022 3 安徽医科大学药学院，安徽省天然药物活性研究重点实 验 室 ，合 肥 230032 作 者 简 介 : 郑 松 ，男 ，本 科 ，主 治医师； 张 磊 ，女 ，副 教 授 ，硕 士 生 导 师 ，责 任 作 者 ，E -m ail: a m uleizhang@ 163. com
表明mecp2可以通过ptchlglisl通路调控人急性单核细胞白血病单核细胞株分泌白介素interleukinil石和肿瘤坏死因子tumournecrosisfactortnf一仅的表达但是mecp2在炎症性肺病中的作用未见报道
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安 徽 医 科 大 学 学 报 " 2018 May;5)(5)
conditioned medium (E P C - C M ) on
the proliferation and osteoblastic diferentiation ability
enchymal stem cells (ADSCs) .Methods In vitro，isolation，culture and identificated adipose mesenchymal stem
关 键 词 M e C P 2 ; M H - S ; 炎 症 因 子 ；F F - B 中图分类号 R 3 4 & R 5 6 2 .1 ;R 5 6 3 文 献 标 志 码 A 文 章 编 号 1000 -1 4 9 2 (2 0 1 7 )0 5 -0 7 3 4 -0 5 d o i ：1 0 . 1 9 4 0 5 / j . c n k i. is s n 1 0 0 0 - 1 4 9 2 . 2 0 1 7 . 0 5 . 0 1 5