免疫组化方法(冰冻切片)

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冰冻切片免疫组化

1 冰冻切片4~8um,室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化,PBS洗,5分钟×3;
2 用3％另 %过氧化氢孵育5~10分钟另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液,室温20分钟;此配方不易产生脱片;配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml,混匀后使用,每次新鲜配制,消除内源性过氧化物酶的活性;PBS洗,5分钟×2;
3 5~10％正常山羊血清PBS稀释封闭,室温孵育10分钟;倾去血清,勿洗,
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜;
5 回收一抗,PBS冲洗,5分钟×3次;
6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗1%BSA-PBS稀释,37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~30分钟;
7 PBS冲洗,5分钟×3次;
8 显色剂显色DAB或AEC;
10 自来水充分冲洗,复染,封片;
如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话,建议还是抗原修复效果比较好,如果没在甲醛中浸泡,无需抗原修复;
如果你的片子切完后在冰箱中保存的话,做之前,从冰箱取出后先室温半小时,然后入37℃烤箱一小时,再进行免疫组化实验,掉片现象会少一点;我们以前片子从-20℃取出后,接着就做免疫组化,片子掉得很多;。

冰冻切片与石蜡切片的区别

1．冰冻切片是免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。

其最突出的优点是能够较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应采用冰冻切片。

新鲜的组织及已固定的组织均可作冰冻切片。

冰冻时，组织中水份易形成冰晶，往往影响抗原定位。

一般认为冰晶少而大时，影响较小，冰晶小而多时，对组织结构损害较大，在含水量较多的组织中上述现象更易发生。

冰晶的大小与其生长速率成正比，而与成核率（形成速率）成反比，即冰晶形成的数量愈多则愈小，对组织结构影响愈严重。

因此，应尽量降低冰晶的数量。

Fish认为冰冻开始时，冰晶成核率较慢，以后逐渐增加，其临界温度为-33。

C,从-30。

C降至-43。

C之间，成核率急剧增加达1018，然后再减慢。

基于上述理论可采取以下措施减少冰晶的形成。

（1）速冻，使组织温度骤降，缩短从-33。

C43。

C的时间，减少冰晶的形成。

其方法有二：①干冰-丙酮（酒精）法：将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不再昌泡时，温度可达-70℃C，用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。

将组织（大小为1cm××）投入异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内以备切片，或置-80℃低温冰箱内贮存。

②液氮法：将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用，或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

（2）将组织置于20%-30%蔗糖溶液1～3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

影响冰冻切片的因素较多，因此，技术难度较大，选择好的冰冻切片机是保证切片质量的关键。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

本文将详细介绍这些步骤。

二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。

比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。

2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。

固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。

3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。

脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。

4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。

三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。

这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。

2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。

这一步需要注意，避免样品受到外界污染。

四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。

这一步可以通过加热或酶解等方式实现。

2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。

常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。

3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。

这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。

4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。

观察过程需要使用荧光显微镜进行。

五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。

该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。

在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。

冰冻切片实验技术

实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。

冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。

冰晶小而多，对组织结构损害大。

因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。

具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。

用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。

将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。

此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。

②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

冰冻切片一般用恒冷切片机。

切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。

【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。

【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。

第三节冰冻切片介绍

第三节冰冻切片介绍冰冻切片术是一种常用的组织学技术，可以用于研究人体组织和动物组织的结构和功能。

它可以提供组织的横断面，便于观察不同结构的细胞和组织。

本文将介绍冰冻切片的原理、步骤和应用。

一、冰冻切片的原理冰冻切片是通过将组织固定在低温下进行切割，从而得到组织横切面的方法。

冷冻技术能够减少组织的变性和破坏，可以保留细胞和组织原有的形态和结构。

在常温下，组织中的脂质和蛋白质会被破坏，切片过程中也容易产生伤口和变形。

而低温冷冻可以减少这些问题的发生，使切片更加准确和可靠。

二、冰冻切片的步骤1.组织固定：将新鲜组织（或已加工处理的组织）固定在适当的固定液中，如4%的甲醛。

固定的时间根据组织的性质和要研究的问题而定，一般在几小时到几天之间。

2.组织置于冰箱中冷冻：将固定的组织置于冷冻器中进行冷冻，通常是在-20摄氏度以下。

冷冻的时间根据组织的大小和要研究的问题而定，约为几小时到一天。

3.制备冰冻切片：将冷冻的组织取出，放在切片机的架子上。

使用冰冷的刀片对组织进行切割，得到所需的冰冻切片。

切片的厚度根据组织的性质和要研究的问题而定。

4.切片上薄片：将冰冻切片绕在切片刀上，并用玻璃刀刮去多余的细胞和组织。

然后将切片放在玻璃片上，并以适当浓度的甘油溶液滴在切片上，使切片保持湿润。

5.染色和保存：根据需要将切片进行染色，使用常用的染色方法如血液染色、免疫染色等。

染色完成后，将切片放在一个干燥的玻璃片上，然后用封闭剂将切片封闭，以防止切片的变形和损坏。

最后，将切片保存在适当的环境中，避免阳光暴晒和湿气侵入。

三、冰冻切片的应用冰冻切片技术在医学研究和临床诊断中有广泛的应用。

1.病理学研究：冰冻切片可以用于观察组织的病理变化，如细胞增生、坏死和变异等。

通过冰冻切片技术，可以更加准确地诊断和鉴定疾病。

2.免疫组化染色：冰冻切片可以进行免疫组织化学染色，用于检测和定位特定蛋白质的表达。

通过这种方法，可以研究细胞和组织中特定分子的分布和功能。

冰冻切片的免疫组化染色

冰冻切片的免疫组化染色1. 新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为5～6 m。

2. 载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3. 如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4. 染色前用冷丙酮在4℃固定10-20分钟。

5. PBS 洗2次,每次5分钟,(必要时应用0.1%柠檬酸钠+0.1%triton打孔既抗原修复)。

6. 3% H2O2灭活内源性过氧化物酶,20分钟,避光。

7. 用PBS 洗2次,每次5分钟。

8．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。

9．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2 小时（也可置于4℃冰箱过夜）。

10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

11．滴加二抗（辣根过氧化物酶标记）， 37℃，40 分钟。

12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

15．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。

16．自来水（细水）充分冲洗。

17．苏木素复染，室温，1-5min，自来水冲洗。

（时间可调节，最好在镜下观察，核染上就好不要过染）。

18．自来水冲洗返蓝，15 分钟。

(可调节)19．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 95%，2 分钟 100%，2 次，5 分钟。

20．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各5 分钟21．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

备注：若用DAB呈色，可经酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。

若用AEC，则不能用酒精脱水，用吸水纸去周围组织多余的水份，直接将水溶性封片剂（例如明胶甘油）封片。

冰冻切片免疫组化

冰冻切片免疫组化步骤
1.从-20°取出片子平衡到室温
2.PBS洗2min 3遍
3.0.3%H2O2 10min（避光）--用PBS将30% H2O2稀释100倍
4.PBS洗2min 3遍
5.10%FBS封闭30-60min（室温）；可以配置10%FBS约10ml，用PBS稀释
6.一抗（10%FBS配置），60min，室温孵育（注意封闭后不用洗！）
7.PBS洗2min 3遍
8.1‰链霉素（带HRP）30min 室温孵育，同样链霉素用10%FBS稀释；若为二抗则也是
用10%FBS稀释，接着孵育半小时。

9.PBS洗2min 3遍
10.将玻片擦拭干净，带组织部分保持湿润，DAB显色（bufferA 1ml + bufferB 1滴），用1ml
枪加在载玻片后，进行镜下观察，待特异性蛋白显色适当时，用PBS洗去DAB。

11.苏木素2min （待染色效果改变颜色）
12.1‰盐酸乙醇分化（迅速刷三次）
13.PBS水中洗净有机溶剂
14.75%、80%、95%、100%酒精脱水
15.二甲苯2min
16.二甲苯2min
17.中性树脂封片
Ps:盖玻片先用盐酸乙醇刷一下，然后用水洗干净，最后泡在二甲苯里，在封片前用无尘纸头擦干净，再封片。

说明一抗配置，如果一抗为100ug（RD）则可以加入100ul的pbs，使浓度在1ug/ul，同时分装抗体。

冰冻切片免疫组化染色步骤

冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。

它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。

本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。

这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。

步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。

冰冻切片实验技术

冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。

冰晶小而多，对组织结构损害大。

因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。

用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。

此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。

②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

冰冻切片一般用恒冷切片机。

切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。

【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。

【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。

（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。

冰冻切片抗原修复方法

冰冻切片抗原修复方法1. 简介冰冻切片抗原修复方法（Frozen section antigen retrieval）是一种常用的免疫组化技术，用于增强冰冻切片中抗原的可检测性。

在免疫组化实验中，抗原修复是一个关键步骤，可以恢复因组织冷冻而导致的蛋白质变性和损伤，提高抗体与抗原的结合效率。

本文将介绍冰冻切片抗原修复的原理、常用方法和操作步骤，并讨论其优缺点及注意事项。

2. 原理冰冻切片中的组织在制备过程中会发生蛋白质变性、结构破坏等现象，导致抗原的空间构象改变或者被掩埋。

这些问题会影响后续免疫组化实验的结果。

需要通过抗原修复来恢复被破坏的蛋白质结构和增强抗体与抗原之间的亲和力。

抗原修复的主要机制有以下几种：•热诱导解离（Heat-induced epitope retrieval，HIER）：通过高温加热使组织中的蛋白质变性解离，恢复抗原的空间构象。

•酶诱导解离（Enzyme-induced epitope retrieval，EIER）：通过酶的作用使组织中的蛋白质变性解离，恢复抗原的空间构象。

•酸碱诱导解离（pH-induced epitope retrieval，PIER）：通过改变溶液pH值使组织中的蛋白质变性解离，恢复抗原的空间构象。

3. 常用方法3.1 热诱导解离法热诱导解离法是最常用的抗原修复方法之一。

其步骤如下：1.取出冰冻切片，放置在玻璃切片上。

2.准备缓冲液，常用的有Tris-EDTA缓冲液、Citrate缓冲液等。

根据实验需求选择合适的缓冲液。

3.将切片放入含有缓冲液的容器中。

4.将容器放入恒温水浴中，在合适的温度下进行加热。

常见温度为95°C，加热时间为10-30分钟。

5.取出切片，冷却后进行下一步的免疫组化实验。

3.2 酶诱导解离法酶诱导解离法是利用酶的作用来恢复抗原的空间构象。

其步骤如下：1.取出冰冻切片，放置在玻璃切片上。

2.准备含有适量酶的缓冲液，常用的酶有胰蛋白酶、蛋白酶K等。

免疫组化方法(冰冻切片)

免疫组化方法（冰冻切片）A. 所需溶液和试剂1.二甲苯2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级）3.苏木精（可选）4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a.10%中性福尔马林b.丙酮c.甲醇d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1XPBS中。

5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizmabase ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。

用浓盐酸将pH调节到7.6。

6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。

100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。

7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。

保存在-20°C。

8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。

9.配制时，将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

10.检测系统：根据厂家说明书使用。

已有的检测系统*。

11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。

B. 切片1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。

这可以避免切片时样品断裂。

2.将样品切成大约6-8 µm厚，铺在带正电性的玻片上。

3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。

（这有助于切片贴紧玻片）C. 固定注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。

a.10%中性福尔马林：室温10分钟。

立即进行染色操作。

b.冰丙酮：-20°C 10分钟。

风干。

立即进行染色操作。

c.甲醇：-20°C 10分钟。

立即进行染色操作。

冰冻切片漂片

免疫荧光操作步骤（漂片，冰冻切片）免疫组化步骤：1.将脑片放到，6孔板（或12孔板），按照二抗说明书，加3%双氧水封闭10min（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）；（二抗不同，操作步骤有差别），本实验室使用的二抗试剂盒为中杉金桥超敏二步法试剂盒；2.吸去双氧水，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3.然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4.然后，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃；5.然后，PBS洗净两遍；剩下步骤见二抗试剂盒说明书。

6.DAB配方为：10mgDAB固体加到20ml0.01MPBS，临用时加100-200微升30%双氧水，注意避光。

7.显色10min，看片子染色深浅情况适当调整显色时间。

一般3分钟显色就比较明显，如果20分钟仍未显色，则看下面的参考。

8.然后PBS洗两遍，转移到载玻片，自然晾干。

干燥天气2-3h，潮湿天气3-4h。

9.脱水：70%酒精3min，95%酒精3min，100%酒精3min，100%酒精2min，二甲苯2min，二甲苯3-5min。

如果片子上盐分较多，在70%酒精前在双蒸水1min。

免疫荧光步骤及注意事项：1，将脑片放到6空板的山羊血清封闭液中，封闭20-40min；（如果是从切片保护液取出，则要用PBS洗一遍）2，吸去山羊血清，PBS洗两遍，将脑片周围的水用吸水纸或卫生纸擦净，注意不要碰到脑片；3，然后按照一抗说明书，将一抗按比例稀释，加入PBS稀释后的一抗，一般，大鼠脑片一张需50微升一抗稀释液，小鼠脑片为30微升；注意不要让液体流到边上；如果流到边上，要重新加或者加大量，使脑片完全浸入液体；4，4℃，过夜（18h或者24h），不建议使用37℃，如果荧光亮度不强，可以延长孵育时间到48或72小时；5，然后，PBS洗净两——三遍，按照二抗说明书稀释的荧光二抗，室温孵育2小时。

免疫组化染色步骤-冰冻切片

免疫组化染色步骤主要试剂：Triton X-100（上海生工，货号：0694-100ml ）；0.3% 和0.03% H 2O 2（国药集团，分析纯AR ，30%, 货号：10011218）； 5% normal goat serum （ S-1000，Lot ：Y0123，Vector ）；一抗：Truus rabbit anti- human AVP(23-06-‘86)（1:1000）【荷兰赠送】；二抗：biotinylated goat anti-rabbit IgG （1:200; catalog-BA-1000 Lot NO. X0524, vector ,burlingame, USA ）；ABC Kit ：peroxidase standard PK-4000, vectastain®, vector , USA （1:200） DAB ：0.05% 3,3’-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)溶液配制：1、10× Tris Buffered Saline (TBS) 、10× TBST 配方：24.2 g Tris base ，80 g NaCl ，adjust pH to 7.6 with HCl (use at 1×).10×TBST （3% Triton ）：30ul Triton-100 + 970ul TBS （37℃）2、 0.3% H2O2 + 0.5%Triton + TBS ：【注意避光，提前20min 配，37o C 水箱溶解Triton 】 99ml TBS （1×） 500µl Triton【先把Triton 溶解在TBS 中后，再加入H 2O 2。

】3、抗体配制方法：抗体 + 羊血清 + TBST （0.3%Triton-100），即TBST 来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

冰冻切片的免疫组化染色步骤冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。

取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。

冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。

室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。

也可根据需要选择其它的固定方式。

PBS洗，5分钟×3。

用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×3。

下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。

石蜡切片免疫组化染色步骤三步法（以SP试剂盒为例）1. 石蜡切片脱蜡至水。

2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。

3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。

4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5. PBS冲洗，2分钟×3次。

6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

7. PBS冲洗，2分钟×3次。

8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。

9. PBS冲洗，2分钟×3次。

10. 显色剂显色（DAB或AEC）。

11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。

一种术中快速冰冻切片免疫组化染色方法

一种术中快速冰冻切片免疫组化染色方法1.前言免疫组化染色（IHC）是一种常用于病理诊断和分子生物学研究的技术。

其原理是利用抗体与被测试样品中特定抗原的特异性结合来检测其中抗原的存在。

IHC的优势在于其能够在组织切片中定位蛋白的细胞类型和位置，从而提供有价值的信息。

然而，该技术需要较长的时间来制备标本，特别是病理检测需要处理大量的样品，使 IHC 的处理时间成为严重的制约因素。

为了解决这个问题，一种称为快速冰冻切片免疫组化染色（FFICS）的方法被开发出来。

该方法基于IHC，结合了Plastic Embedding Method和Cryosection Method，可以同时实现样本的快速处理和高质量的IHC结果，成为目前最为先进的组织学分析技术之一。

本文将详细介绍FFICS的原理、流程、应用、特点与不足。

2.FFICS 的原理FFICS的原理是通过联合使用冷凝板和尼龙网的方式将组织切片快速凝固并定位，同时保持细胞和蛋白质的完整性，达到快速冰冻的效果。

整个过程相对简单，无需在制备样本过程中加入某些成分。

开发者还采用了独特的化学剂和缓冲液来优化快速切片免疫组化染色过程。

FFICS 可以快速将组织切片制备成一系列用于免疫组化染色的样品，并且可以长时间保存冷藏状态，达到对迅速进行冷冻切片的 IHC 要求。

3.流程样品准备：收集组织标本后，作为开放试验样品，标本必须经过有效的去除病毒和感染性物质的处理。

给定的组织样本需要在3h内切割，并在这段时间内加入切冻车内的冷凝板。

4.应用由于FFICS方法的流程相对简单，因此被广泛应用于病理学和生物医学领域，包括胚胎学、细胞生物学、肿瘤学、免疫学、中枢神经系统、心血管疾病研究等多个领域。

更重要的是，FFICS方法可以广泛用于临床病理学研究，特别是在预后处理和药物研发方面，对于准确诊断并制定治疗方案具有重要意义。

5.特点FFICS方法具有许多优势，使其成为免疫组化分析的得力工具。

免疫组化基本操作流程

免疫组化基本操作流程免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测细胞或组织中特定蛋白质的表达水平、定位以及相互作用。

以下是免疫组化基本的操作流程：1.组织固定首先，需要对待检测的组织进行固定。

最常用的方法是将组织置于10%的缓冲福尔马林溶液中，通常时间为24-48小时。

这个步骤的目的是保持组织的形态结构和维持蛋白质的空间位置。

2.制作切片将固定的组织切成5-10微米厚度的切片。

通常使用旋转切片机或者冰冻切片技术来进行切片。

切片后将其放置在载玻片上，通常是带有阳离子的载玻片，如聚胺脂涂层载玻片。

3.抗原恢复固定的组织样本通常会导致部分蛋白质的变性，从而减少抗体的结合能力。

为了恢复这些变性蛋白质的免疫原性，可以进行抗原恢复步骤。

这个步骤通常涉及将切片加热到一定温度，使用酶处理或者盐溶液处理。

常用的抗原恢复方法包括热蒸汽煮沸法、酶消化法等。

4.阻断非特异结合在进行抗体结合之前，需要对样本进行非特异结合的阻断。

这个步骤的目的是防止抗体发生非特异性的结合，从而降低假阳性结果的产生。

通常使用牛血清蛋白（BSA）、奶粉或者干酪蛋白等蛋白质来进行非特异结合的阻断。

5.抗体染色接下来，将切片与目标蛋白质特异性的一抗体一起孵育。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，具体使用什么抗体取决于试验的目的。

抗体与样本中的特定蛋白质结合后，形成抗原-抗体复合物。

6.检测与显色为了检测抗原-抗体复合物的形成，需要进行二次抗体结合。

二抗与一抗结合，并且经常标记有荧光素或着色剂，用以可视化抗原-抗体复合物。

常用的二抗有荧光标记物（如荧光素、荧光染料等）或酵素标记物（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）。

7.盖片封装在检测和显色后，将玻片放在显微镜下进行观察和分析。

可以使用透明封装剂将玻片封装，以保护样本不受污染和光照损伤。

总结：免疫组化是一种重要的实验技术，被广泛应用于生物医学研究和临床诊断。

它通过特异性抗体的结合能力来检测目标蛋白质的存在、定位和相互作用。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。

它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。

以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。

2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。

3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。

4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。

脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。

2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。

抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。

2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。

阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。

一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。

一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。

2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。

4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。

5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。

洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。

可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。

2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。