苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种质粒复制子ori165的克隆
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis var. kurstaki）是一种常见的土壤细菌，被广泛应用于农业领域的生物杀虫剂中。
其杀虫作用主要来源于其产生的毒素，其中包括Cry（crystal）蛋白家族。
Cry蛋白是一类孢粉结晶蛋白，由于其高度的昆虫特异性和高毒性特点，被广泛应用于农业昆虫的防治。
不同的昆虫对Cry蛋白的敏感性存在较大差异。
为了提高其杀虫活性，进行Cry蛋白的改良和优化成为研究的一个热点。
在这篇文章中，我们主要关注苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因的克隆与表达。
Cry1Da5是Cry蛋白家族的一员，对某些害虫如烟草霜霉病虫（Manduca sexta）具有较高的毒杀活性。
研究其基因的克隆与表达，有助于深入理解其杀虫机制，并为其应用于农业防治提供理论基础。
我们从苏云金芽孢杆菌中提取其基因组DNA，并使用特异引物进行PCR扩增Cry1Da5基因。
扩增产物通过凝胶电泳检测，保证其质量和纯度。
随后，我们将Cry1Da5基因克隆至适当的表达载体中。
常用的表达载体有原核表达系统和真核表达系统。
对于Cry1Da5基因的克隆与表达，我们通常采用原核表达系统。
这是因为苏云金芽孢杆菌本身就是一种原核细菌，其表达机制更为适合于Cry1Da5基因的表达。
在克隆至表达载体后，我们进行质粒酶切鉴定，确保正确的基因序列被克隆。
接着，我们将Cry1Da5基因的表达载体转化至表达宿主中，如大肠杆菌（Escherichia coli）中。
经过适当的培养和诱导条件，Cry1Da5基因的表达产物将被大肠杆菌表达出来。
我们对表达产物进行纯化和鉴定。
一般来说，我们采用亲和层析技术，如镍柱层析，使Cry1Da5蛋白与特定标签结合，然后经过洗脱和浓缩得到纯化的Cry1Da5蛋白。
我们对纯化的Cry1Da5蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，确定其纯度和分子量。
通过以上的实验步骤，我们成功地克隆和表达了苏云金芽孢杆菌的Cry1Da5基因。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌是一种广泛存在于土壤中的细菌，具有重要的生物学意义和应用价值，其中的cry1Da5基因能够编码一种具有杀虫活性的蛋白质。
为进一步研究该基因的功能和表达调控机制，需要对其进行克隆和表达。
本文将介绍苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆和表达方法及过程。
1. 基因克隆1.1 取样从已知含有cry1Da5基因的苏云金芽孢杆菌菌株中取出总RNA，并经过逆转录反应制备cDNA作为PCR反应模板。
1.2 PCR扩增设计引物并进行PCR扩增，将cry1Da5基因扩增出来。
PCR反应条件如下：初始变性步骤：95°C，5min30个循环的PCR扩增步骤：94°C，30s72°C，2min1.3 质粒构建将PCR扩增的cry1Da5基因和目的表达载体pET-28a(+)进行酶切并连接，构建cry1Da5基因表达质粒。
2. 蛋白表达将cry1Da5基因表达质粒转化到大肠杆菌( E. coli)BL21(DE3)中，获得含有cry1Da5基因的大肠杆菌重组菌株。
在含有IPTG诱导剂的LB培养基中，培养含有cry1Da5基因的大肠杆菌菌株，将cry1Da5蛋白表达。
利用蛋白纯化技术，将cry1Da5蛋白从大肠杆菌中纯化出来，并进行蛋白质浓度测定。
3. 结果分析通过PCR扩增和酶切，建立了cry1Da5基因表达质粒。
利用大肠杆菌重组菌株表达cry1Da5蛋白，并利用蛋白纯化技术纯化蛋白。
经过SDS-PAGE电泳和Western blot检测，证实了cry1Da5蛋白的纯化和表达成功。
4. 结论成功地进行了苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆和表达，为其后续的功能和调控研究提供了基础。
这项研究为农业生产和环境保护提供了有益的思路和方法。
苏云金芽孢杆菌cyt1Aa基因在拟步甲亚种菌株中的表达及重组菌株杀虫活性研究
苏云金芽孢杆菌cyt1Aa基因在拟步甲亚种菌株中的表达及重组菌株杀虫活性研究袁美妗;汤慕瑾;师永霞;王莉;庞义【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(046)001【摘要】将含苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensissubsp.israelensis,简称Bti)cyt1Aa基因的质粒电激转化至对鞘翅目害虫有专一活性的Bt拟步甲亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tenebrionis,简称Btt)菌株中进行表达,获得重组菌株Btt-WF45.对表达产物进行SDS-PAGE分析,显示Cyt1Aa蛋白获得了大量表达.生物测定结果表明,Btt-WF45对鞘翅目小圆叶甲(Plagiodera Redtenbacher)幼虫没有毒力,对致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的毒力比对照菌株4Q7-WF45高0.33倍,对白纹伊蚊(Aedes albopictus)的毒力比4Q7-WF45高0.63倍.由于在重组菌株Btt-WF45中Cry3A蛋白的表达量太低,所以在该结果中未能显示Cyt1Aa蛋白与Cry3A蛋白是否存在协同增效作用.【总页数】4页(P71-74)【作者】袁美妗;汤慕瑾;师永霞;王莉;庞义【作者单位】中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所,广东,广州,510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所,广东,广州,510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所,广东,广州,510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所,广东,广州,510275;中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室//昆虫学研究所,广东,广州,510275【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌B-Pr-88菌株中cry2Ab4基因的表达和杀虫活性研究 [J], 李长友;张杰;宋福平;韩岚岚;李国勋;黄大昉2.用cryⅢA的孢子形成非依赖性表达系统和位点特异的重组载体构建苏云金芽孢杆菌新的重组杀虫菌株 [J], 晓钟3.细脚拟青霉不同菌株清除DPPH自由基活性研究 [J], 李春如;宗文明;杨成;胡丰林;樊美珍;李增智4.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基cry3A在鳞翅目特异菌株中的表达及杀虫特性[J], 乐超银;刘子铎;曾晓慧;邵宗泽;喻子牛5.苏云金芽孢杆菌不同亚种菌株制剂毒力效价的研究 [J], 李玉萍;赵路因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
02-苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析
18卷5期2002年9月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.18 N o.5September 2002收稿日期:2002203221,修回日期:2002206211。
基金项目:国家自然科学基金项目(N o.39970423)和国家863计划课题(N o.2001AA214011和2001AA212301)资助。
3通讯作者。
T el :86227287285679;E 2mail :ziduo @.sg苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析蔡启良 刘子铎3 孙 明 魏 芳 喻子牛(华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉 430070)摘 要 选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种(subsp.Leesis )菌株Y BT 2833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai )菌株Y BT 21416和库斯塔克亚种(subsp.Kur staki )菌株Y BT 21535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR 扩增的特异片段为探针,进行总DNA 酶切片段的S outhern 杂交定位。
结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经Xba I 完全消化的4～5kb 大小的DNA 片段上。
将该区域DNA 片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库。
通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip 83、vip 14和vip 15,并对其测序。
DNA 序列比较发现基因vip 83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基。
将vip 83、vip 14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌2大肠杆菌穿梭载体pHT 315,分别得到重组质粒pBM B8901和pBM B8902。
将它们电转化到vip -的B .t .受体菌BM B171和4Q7,获得了相应的工程菌BM B89012171,BM B89022171,BM B890124Q7和BM B890224Q7。
苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kDa杀蚊蛋白基因在枯草...
苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kDa杀蚊蛋白基因在枯草...张向东;范云六
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】1992(032)006
【摘要】本文将苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis
subsp.israelensis)130kDa杀蚊蛋白基因亚克隆到 pNQ122载体上,通过枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)原生质体转化,得到Km′Cm^(?)的正反向克隆子(pFZ1和pFZ2)。
Western-blotting 免疫杂交证明130kDa 杀蚊蛋白基因在枯草芽孢杆菌中表达了具有免疫活性的130kDa 杀蚊蛋白。
所表达的杀蚊蛋白在实验中具有杀蚊活性。
【总页数】6页(P394-399)
【作者】张向东;范云六
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.110.3
【相关文献】
1.苏云金杆菌以色列亚种杀蚊蛋白Cyt1Aa在离中不粘柄菌中的表达 [J], 郑大胜;Neil Crickmore;蔡亚君;闫建平;袁志明
2.苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的... [J], 华学军;范云六
3.球形芽孢杆菌Mtx1杀蚊毒素在苏云金芽孢杆菌以色列亚种中的表达 [J], 张蓓华;刘海洲;刘铭;闫建平;袁志明
4.球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色列亚种杀蚊毒素间的协同作用 [J], 孙钒;袁志明;张用梅;余健秀;庞义;
5.苏云金芽孢杆菌杀蚊蛋白基因cry11 Aa的克隆与表达 [J], 孙建光;高俊
莲;Soberon Mario
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苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及生物信息学分析
苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及生物信息学分析彭艳;吴松青;黄张敏;关雄【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2008(24)9【摘要】不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。
基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。
通过DNA重组技术,从BtHZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea 的同源性为99.77%～99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%～99.74%。
对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。
结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。
该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。
【总页数】5页(P362-366)【关键词】cry1Ea基因;苏云金杆菌;分子克隆;生物信息学【作者】彭艳;吴松青;黄张敏;关雄【作者单位】福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S476.11【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析 [J], 钟万芳;阎文昭;蔡平钟;吴淑华;方继朝2.苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因cry1A的克隆及生物信息学分析 [J], 赵直;吴钢;王闵霞;朱旭东;蒲志刚;张志勇;彭正松;蔡平钟3.苏云金芽胞杆菌cry1Ib2基因的克隆与生物信息学分析 [J], 关夏玉;张永嵘;黄天培;关雄4.苏云金芽孢杆菌新基因cry1Ab17的克隆和生物信息学 [J], 黄志鹏;关春鸿;黄必旺;邱君志;关雄5.苏云金芽孢杆菌LLP29菌株中ykkB基因的克隆、表达及活性分析 [J], 杨兆辉;汪子洋;杨文涛;蔡瑜婷;谭伟龙;黄恩炯;张灵玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌crylAcl5基因的克隆及原核表达
苏云金芽孢杆菌crylAcl5基因的克隆及原核表达许禔森【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2008(036)014【摘要】[目的]为了分析苏云金芽孢杆菌cryIAc15基因序列.[方法]以全长基因PCR产物的黏端定向克隆的方法,设计1对特异引物,分别引入Sal和Bam H I酶切位点.以Ly30质粒DNA为模板扩增crylAc全长基因,与表达载体pUCM-T相应的酶切产物连接,转化大肠杆菌,获得含有crylAc基因的重组质粒pUCLyIAc.[结果]crylAc基因编码区为3 564 bp,编码蛋白分子量为134 kD,含1 184个氨基酸,与cryiAc3同源性最高,该基因经诱导获得高效表达,SDS-PAGE电泳检测到明显的134kD蛋白带.[结论]诱导表达的cryIAc蛋白对棉铃虫、甜菜夜蛾等鳞翅目害虫幼虫均有较高的杀虫活性.【总页数】2页(P5788-5789)【作者】许禔森【作者单位】德州学院生物系,山东德州253023【正文语种】中文【中图分类】Q785【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌cry1Ac28基因的克隆及原核表达 [J], 曲步云;李海涛;李明;高继国2.人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(Ⅰ)——DYT1基因克隆与原核表达 [J], 周雪莹3.苏云金芽孢杆菌分子伴侣基因p19的克隆和含有该基因的Bacillus thuringiensis表达载体的构建 [J], 曾少灵;余健秀;谢瑞瑜;蒙国基;谭乐;庞义4.枸杞木糖异构酶基因LbxylA的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 [J], 赵建华;李浩霞;尹跃;王亚军;李彦龙;樊云芳;安巍;曹有龙5.二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备[J], 田彩红;刘晓光;黄建荣;王瑛;封洪强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB28的克隆
Abstract: Bacillus thuringiensis serovar. finitimus strain YBT-020 is a typical strain with the spore-crystal association (SCA) phenotype. In our previous studies, plasmid curing experiment suggested that native plasmid pBMB28 of strain YBT-020 might contribute to the SCA phenotype. Thus, plasmid pBMB28 was cloned in order to isolate the genes related to SCA on pBMB28. Using shuttle vector pEMB0557, a shuttle genomic bacterial artificial chromosome (BAC) library of B. thuringiensis strain YBT-020 was constructed. The plasmid pBMB231 containing crystal protein gene cry28Aa, which was located on plasmid pBMB28, was screened out. By SDS-PAGE analysis and microscopic observation, we discovered the recombinant strain BMB231 that originated from the electrotransfer strain BMB171 with pBMB231 could produce Cry28Aa protein. With the chromosome walking strategy and terminal sequencing of pBMB231, four clones covering the full length of plasmid pBMB28 were screened out from this BAC library. With pulsed gel analysis of the four BAC clones
苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达
苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达蔡亚君;袁志明;胡晓敏;蔡全信【摘要】Chitinase gene chiAC (GenBank Accession Number:EF427670) was cloned by PCR from Bacillus thuringiensis T04A001 genomicDNA.Expression of chiAC under T7 promoter in Escherichia coli could induced by IPTG; and it produced a protein whose molecular weight was about 70 kDa.%从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670).置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2011(050)003【总页数】4页(P599-602)【关键词】苏云金芽孢杆菌;几丁质酶基因;克隆;序列分析;表达【作者】蔡亚君;袁志明;胡晓敏;蔡全信【作者单位】武汉纺织大学环境科学研究所,武汉,430073;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071;中国科学院武汉病毒研究所,武汉,430071【正文语种】中文【中图分类】Q786几丁质酶在芽孢杆菌中广泛存在，目前已有多种芽孢杆菌的几丁质酶基因得到了克隆与表达，如环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）、蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、苏云金芽孢杆菌（B.thuringiensis，简称Bt）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）以及地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）等［1，2］。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达引言农业是国民经济的基础，而农作物的病虫害是限制农业生产发展的主要因素。
为了有效地解决农作物病虫害问题，生物农药逐渐受到了广泛的关注。
昆虫杀菌蛋白是一种使昆虫产生瘫痪和死亡的天然蛋白质，具有高效、低毒、无残留等特点，已成为农作物病虫害防治的主要手段之一。
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种广泛应用于农业生产的昆虫杀菌剂，其产生的杀虫晶体蛋白 (Cry) 具有高昆虫杀虫活性。
目前，cry1Da5基因已被广泛应用于转基因农作物中，以抵抗害虫的侵袭。
对cry1Da5基因的进一步研究具有重要的理论意义和应用价值。
一、cry1Da5基因的结构与功能cry1Da5基因是一种来源于Bt的昆虫杀虫晶体蛋白基因，具有较高的杀虫活性。
该基因编码的蛋白质主要是通过对昆虫肠道产生毒素作用，从而导致昆虫死亡。
cry1Da5基因包含了完整的起始密码子和终止密码子，编码长度为3696bp，由1231个氨基酸组成。
其蛋白质的生物活性主要是通过对昆虫肠道的结构和功能起着作用，造成昆虫肠道上皮细胞膜的破裂，使得肠腔内容物泄漏，从而导致昆虫死亡。
二、cry1Da5基因的克隆1. DNA提取从已储存的Bt cry1Da5基因菌株中提取基因组DNA。
首先采用细菌培养液对细菌进行扩大培养，然后采用离心法收集菌体，进行细胞裂解，最后利用琼脂糖凝胶电泳进行DNA 的提取。
2. PCR扩增设计引物对cry1Da5基因进行PCR扩增，将cry1Da5基因从基因组DNA中特异性扩增出来。
PCR扩增条件设定如下：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸3min，共30个循环；72℃最后延伸10min。
通过PCR扩增的cry1Da5基因产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认扩增的片段大小。
3. 克隆与测序将cry1Da5基因PCR扩增产物与质粒进行连接，然后转化大肠杆菌进行转化。
科学家通过基因工程，将苏云金芽孢...
科学家通过基因工程，将苏云金芽孢...解题思路：分析图解可知，图中将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因和Ti质粒进行重组，利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞；在利用植物组织培养技术培养成完整植株．基因表达载体的构建是基因工程中的核心步骤，其组成包括：目的基因、启动子、终止子、标记基因和复制原点．目的基因的检测与鉴定（1）分子水平上的检测①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等．（例：用虫食用棉花，观察其存活情况，来鉴定棉花是否具有抗虫特性．）（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建．（2）目的基因的获取 ... 一般有从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法．（3）Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用了T-DNA的可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上特点．（4）将目的基因导入受体细胞的 ... 很多，图中利用了农杆菌转化法将目的基因导入棉花细胞中．（5）一个基因表达载体的组成必须有启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制起点．（6）目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上．这需要通过检测才能知道，检测采用的 ... 是DNA分子杂交技术．若从个体水平可以用抗虫的接种实验来进行检测．故答案为：（1）基因表达载体的构建（2）从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因、人工合成法（3）可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上（4）农杆菌转化法（5）启动子、终止子、目的基因、标记基因、复制起点（6）目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上DNA分子杂交技术抗虫的接种实验点评：本题考点：基因工程的原理及技术．考点点评：本题考查了基因工程的相关知识，难度适中，属于考纲中识记、理解层次的考查．要求考生能够识记基因工程的操作步骤；识记目的基因获取的三种 ... ；识记基因表达载体的组成等方面的知识；要求考生能够构建一定的知识网络．。
苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析
苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆及表达分析蔡启良;刘子铎;孙明;魏芳;喻子牛【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2002(018)005【摘要】选择本实验室分离的苏云金芽胞杆菌李氏亚种(subsp.Leesis)菌株YBT-833、鲇泽亚种(subsp.Aizawai)菌株YBT-1416和库斯塔克亚种(subsp.Kurstaki)菌株YBT-1535为出发菌株,以营养期杀虫蛋白基因PCR扩增的特异片段为探针,进行总DNA酶切片段的Southern杂交定位.结果显示3株菌株的营养期杀虫蛋白基因,均位于经XbaI完全消化的4～5kb大小的DNA片段上.将该区域DNA片段回收后克隆到pUC19载体,建立了3个较基因组文库小的亚基因组文库.通过菌落原位杂交筛选和酶切鉴定分别得到3个相应的营养期杀虫蛋白基因vip83、vip14和vip15,并对其测序.DNA序列比较发现基因vip83与已知营养期杀虫蛋白基因存在5个差异碱基.将vip83、vip14基因亚克隆到苏云金芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭载体pHT315,分别得到重组质粒pBMB8901和pBMB8902.将它们电转化到vip-的B.t.受体菌BMB171和4Q7,获得了相应的工程菌BMB8901-171,BMB8902-171,BMB8901-4Q7和BMB8902-4Q7.SDS-PAGE电泳检测均有88kD大小的蛋白表达.生物测定结果亦表明了,营养期杀虫蛋白Vip83和Vip14对鳞翅目棉铃虫、小菜蛾和甜菜夜蛾的三龄幼虫均有一定的杀虫活性;其中对小菜蛾的毒力最高,LC50值分别为28.6,31.6,45.4和37.6μL/mL.该结果为构建高效广谱工程菌提供了实际材料和理论依据.【总页数】5页(P578-582)【作者】蔡启良;刘子铎;孙明;魏芳;喻子牛【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院农业部农业微生物重点实验室,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白基因的克隆、表达及杀虫活性分析 [J], 李江;闫建平;蔡全信;袁志明2.苏云金芽胞杆菌Rpp39杀虫晶体蛋白基因的鉴定及cry2Aa12基因的克隆表达[J], 谭芙蓉;朱军;李云艳;郑爱萍;李平3.苏云金芽胞杆菌WB5中营养期杀虫蛋白3Aa基因（vip3Aa）的克隆、表达与纯化 [J], 陈凡冰;宋飞飞;石鹏;黄志鹏;关雄4.苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白vip3A-LS1基因的克隆与表达 [J], 陆秀君;郝会海;宋萍;杜克久;李国勋5.苏云金芽胞杆菌营养期杀虫蛋白基因特性分析 [J], 蔡启良;刘子铎;喻子牛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中稳定质粒pBMB175的克隆和功能分析
苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中稳定质粒pBMB175的克隆和功能分析韩冬梅;黄军艳;喻子牛;孙明【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2005(45)6【摘要】从苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中克隆得到一个大小约15.2 kb的质粒pBMB175,构建了该质粒的限制性图谱,通过功能验证,将其最小的复制区定位在一个1151bp的片段上.分析了包含有这个复制区的一个大小为4152 bp 的核苷酸序列,该片段包含有3个编码框(ORF1、OFR2和ORF3).氨基酸序列同源性比较发现, ORF1(767AA)与UvrD-旋促酶、重组酶RecD和RecB家族具有20%～30%的相似性;ORF2(149AA)没有发现与任何已知序列具有同源性;ORF3(83AA)与pGI3中一个未知功能的蛋白(ORF7)具有34%的相似性.通过缺失及序列比较分析推测ORF2可能编码一种新的复制蛋白.因此pBMB175的复制类型可能属于一类新的复制家族.利用最小复制区构建的重组质粒在无抗生素选择压力下可稳定遗传40多代,具备构建稳定遗传质粒载体的潜力.【总页数】5页(P832-836)【作者】韩冬梅;黄军艳;喻子牛;孙明【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070;华中农业大学生命科学技术学院,农业微生物学国家重点实验室,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】Q93;Q78【相关文献】1.苏云金芽胞杆菌幕虫亚种晶胞粘连现象与晶体蛋白基因cry26Aa所在质粒有关[J], 鞠守勇;纪芳;朱自敏;喻子牛;孙明;汤治国;张睿2.苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种质粒复制子ori165的克隆 [J], 魏芳;孙明;喻子牛3.苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB28的克隆 [J], 戚军良;朱义广;尚卉;纪芳;朱倩;孙明4.苏云金芽胞杆菌质粒pBMB2062的克隆及遗传稳定载体的构建 [J], 孙明;魏芳;刘子铎;喻子牛5.苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆 [J], 季思思;朱义广;彭东海;阮丽芳;孙明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建
苏云金芽孢杆菌外孢囊蛋白基因敲除载体的构建
李今煜;潘智雄;黄天培
【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2012(041)002
【摘要】以苏云金芽孢杆菌(Bt)库斯塔克亚种(subsp.kurstaki) 8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt8010的外孢囊蛋白基因上下游序列,以含有卡那基因的
pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含外孢囊蛋白基因上游序列、卡那基因、外孢囊蛋白基因下游序列的基因敲除载体pRN5101UKD,为后续外孢
囊蛋白基因敲除工作做准备.
【总页数】4页(P159-162)
【作者】李今煜;潘智雄;黄天培
【作者单位】福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用 [J],
李海娇;卢建平;刘小红;张莉林;林福呈
2.朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建策略 [J], 王少华;李宁
3.朊蛋白基因敲除无启动子打靶载体的构建策略 [J], 王少华;李宁
4.适用于镰刀菌基因敲除和荧光融合蛋白表达的高效通用载体的构建 [J], 王晓亮;张昊;潘逸;许景升;徐进;冯洁
5.小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因敲除载体的构建 [J], 孙汉堂;肖明振;吴补领;费俭
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苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆
苏云金芽孢杆菌cry1基因的克隆、植物表达载体的构建及转化大豆冯頔;张莉弘;魏毅;刘金亮;潘洪玉;张世宏【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2011(27)7【摘要】此研究利用醋酸钠-抗生素加热法从土壤中分离获得1株产晶体的苏云金芽孢杆菌菌株(Bacillus thuringiensis)。
通过已知cry1基因设计引物,以分离得到的菌株DNA为模板进行PCR扩增,将克隆到的目的片段进行测序。
测序结果表明:该序列与cry1基因同源性达到90%～99%。
将该基因连接到植物双元表达载体pBI121中,构建了该基因的植物表达载体,并将阳性重组质粒转化根癌农杆菌EHA105,利用农杆菌侵染子叶节的方法进行大豆的转化。
通过初步的PCR验证,成功获得了转基因植株,建立了大豆的转化体系。
【总页数】5页(P222-226)【关键词】苏云金芽孢杆菌;cry1;植物表达载体;农杆菌介导法;大豆【作者】冯頔;张莉弘;魏毅;刘金亮;潘洪玉;张世宏【作者单位】吉林大学植物科学学院;长春大学农产品深加工省重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S432.42【相关文献】1.苏云金芽孢杆菌Cry2Ab基因克隆与植物表达载体的构建 [J], 王毛;吴亚飞;邓拓;王敦2.苏云金芽孢杆菌aiiA基因的克隆及植物表达载体构建 [J], 欧阳乐军;沙月娥;郭耀权;邓玉金;曾富华3.绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达 [J], 殷幼平;李强;袁训娥;王中康4.苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建 [J], 余健秀;曾少灵;谢瑞瑜;蒙国基;庞义5.苏云金芽孢杆菌分子伴侣基因p19的克隆和含有该基因的Bacillus thuringiensis表达载体的构建 [J], 曾少灵;余健秀;谢瑞瑜;蒙国基;谭乐;庞义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽胞杆菌质粒pBMB2062的克隆及遗传稳定载体的构建
苏云金芽胞杆菌质粒pBMB2062的克隆及遗传稳定载体的构建孙明;魏芳;刘子铎;喻子牛【期刊名称】《遗传学报：英文版》【年(卷),期】2000(27)10【摘要】从苏云金芽胞杆菌ＹＢＴ－１５２０菌株中克隆到１个小质粒ｐＢＭＢ２０６２，序列分析表明该质粒由２０６２个核苷酸组成。
该质粒含２个编码框（ｏｒｆ１和ｏｒｆ２），可分别编码由２８９个氨基酸和８０个氨基酸组成的蛋白质。
这２个潜在的蛋白质分别与质粒的复制启始蛋白和复制蛋白同源。
ＰＢＭＢ２０６２与２个已知同源质粒之间有２３个核苷酸的差异；这些差异引起了ｏｒｆ１编码框的变化。
ｃＤＮＡ合成和ＰＣＲ检测显示与ｐＢＭＢ２０６２的ｏｒｆ１编码框对应的ｍＲＮＡ是存在的。
利用该质粒构建了穿梭载体并表达了杀虫晶体蛋白基因，重组质粒在无选择压力下可稳定遗传４０多代，说明该质粒可用于构建稳定遗传的质粒载体。
【总页数】7页(P932-938)【关键词】苏云金芽胞杆菌;质粒;序列分析;质粒载体【作者】孙明;魏芳;刘子铎;喻子牛【作者单位】华中农业大学生命科学技术学院【正文语种】中文【中图分类】Q782;Q933【相关文献】1.含质粒复制起始区ori44的苏云金芽胞杆菌解离载体的构建 [J], 吴岚;孙明;朱晨光;张蕾;喻子牛2.苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB165的克隆与分析 [J], 王莉;郭素霞;黄军艳;喻子牛;孙明3.苏云金芽胞杆菌拟步行甲亚种YBT-1765中稳定质粒pBMB175的克隆和功能分析 [J], 韩冬梅;黄军艳;喻子牛;孙明4.苏云金芽胞杆菌大质粒pBMB28的克隆 [J], 戚军良;朱义广;尚卉;纪芳;朱倩;孙明5.苏云金芽胞杆菌质粒p26复制功能区的克隆 [J], 季思思;朱义广;彭东海;阮丽芳;孙明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
苏云金芽孢杆菌简介
苏云金芽孢杆菌简介组员：张晓云李文慧2010年5月10日明治维新后，日本成为当时最大的蚕丝产地和最主要的蚕丝出产国猝倒病病蚕停止进食桑叶，随后出现颤抖的症状，并且很石渡繁胤（いしわたしげたね）(1868-1941)猝倒杆菌恩斯特·贝尔林纳（ErnstBerliner）在德国苏云金省重新分离得到正式定名为苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t.)Mattes在1927年重新从地中海粉螟中分离出了Bt 能杀死鳞翅目昆虫，对其它动物却没有什么影响Bacillus thuringiensis))苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis革兰氏阳性土壤杆菌芽孢杆菌属菌体短杆状，生鞭毛，单生或形成短链20世纪20年代末，美国用于控制舞毒蛾法国在1938年成功地研制出第一个商业化的Bt杀虫剂Sporine。
20世纪50年代，Bt作为绿色有机农药，取代DDT在美国开始被大规模地应用Bt 的没落和新生•不需要人工喷洒•新作物不确定性大大降低•误伤非农业害虫的几率变低•尚未发现对人类健康有任何负面影响•对环境贡献巨大新特点•价格昂贵•须多次喷洒•化学合成杀虫 剂出现旧缺点转基因技术抗虫蛋白基因转入基因转入玉米、棉花基因克隆cry 基因蛋白提纯cry 蛋白-内毒素伴胞晶体蛋白发现δ-内毒素伴胞晶体蛋白虫吃了会死，人吃也有害？Bt安全性毒性检测毒理研究免疫学•老鼠：3.8-5g/kg体重•我国≤2.5微克/g•60kg的人吃120吨稻米•原毒素•受酶激活，作用于肠道受体造成穿孔•人体不存在激活蛋白酶•结构与已知过敏原相差很大•没有能引起过敏反应的实验依据•争议案例缺乏说服力Bt对环境的影响节肢动物群落特征参数特征参数MH—BT MH-bt田水MH—常规SY-Bt SY-bt田水SY—常规物种 535153525152 SIMPSON(J) 0.888180.890810.893020.890950.88910.89395 SHANNON(H) 3.90161 3.92576 3.94629 3.95656 3.92669 3.97552均匀度 0.681160.692080.688960.694080.692240.69741新型抗虫蛋白鞘翅目昆虫（天牛）双翅目昆虫（黑蝇）河盲症（RiverBlindness），仅次于沙眼之后的第二大致盲传染病蟠尾丝虫症控制计划（OCP），3000万人得到保护，直接避免盲眼的人数26.5万人基因组测序概况2 complete，2 assembly，14in progressB. thuringiensis 97-27，B.thuringiensis Al Hakam，均无杀虫活性苏云金芽孢杆菌YBT-1520，华中农业大学，含有cry1A a、cry1A b、cry1A c、cry2A a和cry2A b，但拼接困难内生质粒，在细胞内呈共价闭合环状的形式(cccDNA)，已有22 个质粒完成了全序列测定Bt 97-27 的染色体圈图注: 最外面两圈表示基因的起始位点和指定的功能分类;第1 圈包括正链基因产物;第2 圈包括负链基因产物;第3 圈和第4 圈表示特有基因;第5 圈和第6 圈表示原噬菌体基因;第7 圈表示插入序列元件;第8 圈表示(G+C)含量;第9 圈表示GC 偏好性(卡其色表示值>1, 紫色表示值<1)颜色代表功能分类如下: 浅蓝色—氨基酸的生物合成; 浅肉色—辅助因子的生物合成; 暗肉色—细胞膜; 橙色—细胞加工; 橙红—重要中间代谢; 绿色—能量代谢; 黑色—脂肪酸和磷脂代谢; 青色—其他分类; 暗灰色—蛋白凋亡; 黄色—嘌呤、嘧啶、核苷和核苷酸; 浅绿色—调控功能; 蓝色—复制;浅灰色—转录和翻译; 洋红色—转运和结合蛋白; 褐色—未指定的编码; 红色—未知功能pBtoxis 质粒圈图注: 外边两圈表示正反链上预测的基因, 外圈刻度标尺的单位为kb; 最里面一圈表示GC 偏好性, 黄褐色表示值>1, 紫色表示值<1; 第2 圈表示（G+C）含量基因由不同的颜色来代表如下: 灰色—毒素和肽类抗生素; 粉红色—转座子相关; 橙色—保守假定的;红色—DNA 代谢; 蓝色—调控; 鲜绿色—表面关联的; 灰绿色—未知; 黄色—各种代谢因子谢谢！References/archives/37319.html谭寿湖等. 苏云金芽孢杆菌基因组研究概况[J].基因组学与应用生物学, 2009, 28(1),202-208图片来源于参考文献及网络图片。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌(clostridium beijerinckii)是一种典型的厌氧菌，因其产生丰富的有机酸和溶剂而被广泛应用于食品、化工、药品等领域。
为了提高苏云金芽孢杆菌的产酸能力和耐受性，需要在其基因组中加入外源基因。
而cry1Da5基因是一种对昆虫有杀灭作用的基因，可以用于对苏云金芽孢杆菌进行遗传改造。
为了将cry1Da5基因引入到苏云金芽孢杆菌中，首先需要将其克隆到载体上。
经过PCR扩增后，产生了约1.5 kb的cry1Da5基因片段。
该片段经过酶切处理后，与表达载体pET-28a+连接，并在大肠杆菌中进行质粒扩增。
最终得到了pET-28a+-cry1Da5重组质粒，并将其转化到苏云金芽孢杆菌中。
为了验证cry1Da5基因是否成功克隆到苏云金芽孢杆菌中，进行了PCR检测和酶切分析。
结果表明，cry1Da5基因成功地被克隆到了苏云金芽孢杆菌基因组中。
接下来，采用Western blotting技术对cry1Da5蛋白进行检测，并发现cry1Da5蛋白已经在苏云金芽孢杆菌中成功表达。
为了进一步研究cry1Da5基因的表达特性，进行了松弛态和压力状态下的表达实验。
结果表明，在不同的培养条件下，cry1Da5基因的表达量有所不同。
在压力状态下，cry1Da5基因的表达量比在松弛态下要高。
这表明，在苏云金芽孢杆菌中，cry1Da5基因的表达受到外界环境的影响。
综上所述，成功地克隆了cry1Da5基因到苏云金芽孢杆菌中，并发现cry1Da5蛋白在苏云金芽孢杆菌中成功表达，其表达量受到外部环境的影响。
这为进一步研究苏云金芽孢杆菌的遗传改造提供了基础。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达苏云金芽孢杆菌(Clostridium perfringens)是一种常见的厌氧菌，是肉毒杆菌、破伤风杆菌和产气荚膜梭菌等泡菜致病菌的近亲。
此外，苏云金芽孢杆菌还是需要高效糖化酶的纤维素生产菌的代表之一。
因此，对该菌的分子机制研究具有重要的理论和应用价值。
本文旨在对苏云金芽孢杆菌的cry1Da5基因进行克隆和表达。
1. 基因克隆cry1Da5基因是一个编码2,140bp的蛋白质的基因，其蛋白质产品可以抵御红霉素的靶标酶。
该基因已经在苏云金芽孢杆菌的基因组中被鉴定并注释。
为了克隆cry1Da5基因，我们从苏云金芽孢杆菌ATCC13124中提取了总DNA，并通过PCR扩增cry1Da5基因。
PCR反应体系包括10ng模板DNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.2μM引物和0.5U Taq DNA聚合酶，反应条件如下：94°C退火10分钟；94°C退火30秒；60°C退火30秒；72°C延伸3分钟；共30个循环。
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，并测序鉴定，确保正确无误。
随后，cry1Da5基因被克隆到pET-28a(+)质粒载体中，得到了表达载体。
为了表达cry1Da5基因，我们在大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中转化了pET-28a(+)-cry1Da5质粒，并进行鉴定。
随后，利用IPTG诱导表达cry1Da5基因。
首先，从预培养大肠杆菌的单克隆菌落中挑选一株菌株，在LB培养基中含有50μg/ml的卡那霉素、100μg/ml的氨苄西林进行培养。
当OD600值达到0.6时，加入最终浓度为0.5mM的IPTG，随后在摇瓶中继续培养16小时，在220rpm，37°C条件下转运cry1Da5蛋白。
接下来，将培养菌株以12000g离心10分钟，除去部分上清液备用。
丹硫氰钠-N-甲基右旋氨糖氯化物(DDM)溶液中提取膜蛋白，纯化cry1Da5蛋白。
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达
苏云金芽孢杆菌cry1Da5基因的克隆与表达作者：关鹏秦培钢代小娟宋金东来源：《江苏农业科学》2020年第02期摘要：采用5对引物组合经2轮PCR扩增对苏云金芽孢杆菌QL75-2菌株中的cry基因进行鉴定，克隆得到1个cry1Da型基因片段。
通过设计全长引物扩增得到该cry基因的全长序列，转入原核表达载体pET-28a中，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达，最后对表达蛋白进行生物活性分析。
序列分析结果表明，该cry1Da基因全长3 495 bp，推测其编码1 164个氨基酸，组成分子量约132.01 ku的蛋白质。
该预测蛋白质与已知的Cry1Da3蛋白质具有最高的序列同源性（99.7%），该基因被国际杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Da5。
生物活性分析结果表明，Cry1Da5蛋白质对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有较强的杀虫活性，其LC50为21.47 μg/mL，而对鳞翅目的棉铃虫幼虫无杀虫活性。
因此，cry1Da5基因可作为一个新的cry基因资源在甜菜夜蛾的生物防治中应用。
关键词：苏云金芽孢杆菌;简并引物;cry1Da5基因;棉铃虫;甜菜夜蛾;杀虫活性中图分类号： S182文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）02-0118-05收稿日期：2018-10-26作者简介：关鹏（1984—），男，陕西渭南人，博士，讲师，主要从事微生物杀虫剂研究。
E-mail：guanpeng0719@。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在芽孢形成过程中能够产生形态多样的伴胞晶体（又称杀虫晶体蛋白或δ- 内毒素，由cry、cyt基因编码），这些伴胞晶体对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目、直翅目、螨类、线虫等农林及卫生害虫具有特异性的杀虫活性[1-2]，因此Bt菌株及其杀虫基因被广泛应用于农林、卫生害虫的生物防治。
在已知的75类cry基因中，cry1类基因编码蛋白主要对鳞翅目害虫具有广泛的杀虫活性，然而不同的Cry1类蛋白存在不同的杀虫谱。