胡方芳-临床微生物标本常见细菌培养和鉴定

三 细菌鉴定的基本依据
• 基本结构：形态与染色 • 生长特性：培养特性 • 细菌代谢产物：生化反应： • 细菌免疫学特征：血清学试验： • 遗传特征：分子生物学实验 • 其他：质谱分析技术、色谱分析技术等
四 细菌鉴定基本步骤
• （一） 挑选可疑菌落 • （二） 涂片染色 • （三） 生化反应试验 • （四） 血清学试验 • （五） 其他相关试验
• 粪便：接种血平板、SS平板和麦康凯平板 置普通温箱 35℃孵育
• 脓液及创伤感染分泌物：血平板 置普通温箱 35℃孵育
• 生殖道：接种血平板和淋球菌平板 置CO2温箱 35℃孵 育
一 常见细菌培养
• 培养特性： 1 适宜生长温度：大多数病原菌35-37℃，某些在
低温（李斯特菌属 4 ℃ 缓慢生长）或高温下生 长 2 气体环境：需氧菌、兼性厌氧、微需氧（5%O2、 10%CO2 如肺炎链球菌、淋病奈瑟氏菌等）、厌 氧菌
菌）、辣味（金黄色葡萄球菌）等
（3）菌落溶血特征 α溶血/草绿色溶血： β溶血： γ溶血/不溶血：
链球菌的溶血现象
2 液体培养基 （1）均匀浑浊生长 （2）沉淀生长 （3）表面生长（菌膜）
（二） 涂片染色
• 染色：革兰染色：革兰阳性菌、革兰阴性菌 • 形态、大小和排列：球形、杆形、螺旋形，菌体
大小，单个、成双、葡萄状等
-
迁移生长 +
洋葱 类鼻疽 巴斯特 其他
铜绿
- 靛基质
其他
沙雷 枸橼 肠杆菌 嗜麦芽 不动 沙门 其他
+
变形杆菌
大肠
革兰阴性球菌
氧化酶（+） G- Co：
脑膜炎双Co 卡他布兰汉
淋球菌
血平板 + 巧克力 + 普通平板 （除卡他）
脑膜炎双Co 22℃ 卡他莫拉菌 22℃ + DNA + 淋球菌 常见阴道、眼部
+
葡萄球菌 、微球菌
凝固酶
+
-
金葡
CONS
猪葡
微球
中葡 路登葡 PYR+
G+ Co 触酶
β溶血
甲溶
A群 PYR+ 杆菌肽
+
B群 CAMP+ PYR-
C、G 群 停乳 VP- 葡萄糖苷酶 + 咽唊 VP+ 葡萄糖苷酶 -
肺链 OP+ 胆溶 +
草链 OP- 胆溶 肠球 PYR+ 氯化钠+
胆七+
G+ b
（四） 血清学试验
凝集试验：
1 直接凝集：沙门菌、志贺菌、致病性大肠埃希菌、霍乱 弧菌、链球菌等鉴定；肥达反应（伤寒、副伤寒）
2 间接凝集：隐球菌抗原检测
制动试验：霍乱弧菌的快速试验 荚膜肿胀试验：肺炎链球菌
（五） 其他检测技术
• 分子生物学技术：
借助半自动、自动化鉴定仪器 • 生物梅里埃：ATB、VITEK2（compact） • 赛默飞：Sensititre • BD；Phoenix100 • …...
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污染细菌判断
• 一套血培养中只有其中一瓶报阳 • 且报阳时间>48小时 • 下列细菌阳性（除非>1次血培养分离出）: 凝固酶阴性葡萄球菌、棒状杆菌 、微球菌、 丙酸杆菌、芽孢杆菌
（二） 呼吸道标本
• 类型：鼻咽拭子、痰和经气管 采集的标本。
• 上呼吸道存在正常菌 群，在采集标本与结果分析时 应予考虑。
3 葡萄球菌碳水化合物氧化、发酵试验（ O-F试验）：区别葡萄 球菌（发酵）和微球菌（氧化）
4 甲基红试验（MR）：主要用于大肠埃希氏菌（阳性）和克雷伯 氏菌（阴性）
5 V-P试验：主要用于大肠埃希氏菌（阴性）和克雷伯氏菌（阳性）
6 七叶苷水解试验：主要用于肠球菌属（阳性）鉴定，D群链球菌 （阳性）
消化球菌、消化链球菌、炭疽芽 瓦菌、拟杆菌属、梭杆菌属、嗜血杆
孢杆菌、破伤风梭菌、产气荚膜 菌属、产碱杆菌属、无色杆菌属、鼠 脓液、创伤分泌物
梭菌、溃疡棒状杆菌、结核分枝 疫耶氏菌、鼻疽、假鼻疽伯克霍尔德
杆菌、丝状真菌、诺卡菌、放线 菌、弧菌属、气单胞菌属、卡他莫拉
菌、酵母样菌
菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌
3 生长pH:大多数为pH7.2-7.6。个别细菌，如霍乱 弧菌在碱性（pH8.4-9.2）生长
4 特殊要求：
（1）生长因子：嗜血杆菌（X、V因子）等
二 细菌鉴定的基本原则
• 必须用细菌纯培养物做鉴定： 单个菌落的分离
• 选择有鉴别价值和可靠的试验 • 必须进行质量控制：在相同实验条件下 • 选择快速简单的试验
• 酶类试验
1 氧化酶试验：肠肝菌科和非发酵菌鉴别 2 触酶试验：葡萄球菌阳性，链球菌阴性 3 凝固酶试验：金黄色葡萄球菌 4 DNA酶试验：卡他布兰汉菌、金黄色葡萄球菌、沙雷菌 5 CAMP试验等：B群链球菌
• 抑菌或敏感试验
（1）Optochin敏感试验（OP试验）：肺炎链球菌敏感 （S）
（2）新生霉素敏感试验（NV）：表皮葡萄球菌敏感 （S），腐 生葡萄球菌耐药（R）
结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌、放线菌、诺卡菌、酵母 肺炎克雷伯菌及其他肠杆菌科细菌、假单胞菌
样菌、丝状真菌
属、军团菌属菌种、多杀巴斯德菌
五 各类标本中的常见病原菌
标本
革兰阳性菌
革兰阴性菌
金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、 伤寒及其他沙门菌、志贺菌属、致病
蜡样芽胞杆菌、艰难芽胞梭菌、 大肠埃希菌、弧菌属、气单胞菌属、
革兰阴性菌 脑膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌伤寒及其他沙门 菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肠杆菌属、 沙雷菌、铜绿假单胞菌、假单胞菌属、不动杆 菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、 布氏杆菌、流感嗜血杆菌、胎儿弯曲菌、拟杆 菌、梭杆菌 脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌、流感嗜血杆菌、 肠杆 菌科菌种、假 单胞菌属菌种、 脑膜败 血 性 金黄杆菌无色杆菌属、拟杆菌属种
（三） 生化反应
• 原理：每种细菌都有独特的酶系统，因此对底物 的分解能力不同，代谢产物不同
• 主要包括： 碳水化合物的代谢试验 氨基酸和蛋白质的代谢试验 碳源和氮源利用试验 酶类试验 抑菌或敏感试验
• 基本要求 1 生化反应管的选择：试管法（自制），微量生化
管，API（梅里埃），RapID（赛默飞）等
肠道标本（粪便）
白色念珠菌
类志贺邻单胞菌、小肠结肠耶尔森
菌、弯曲菌属
金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、嗜血杆
眼、耳、鼻、喉 β溶血性链球菌、白喉棒状杆菌、 菌属、莫拉菌属、白百咳鲍特菌、肠
标本
酵母样菌、丝状真菌
杆菌科菌种、假单胞菌属、产碱杆菌
属、多杀巴斯德菌
葡萄球菌属、链球菌属、肠球菌、 肠杆菌科菌种、假单胞菌属、腐败谢
葡萄球菌属菌种、肠球菌属菌种、 淋病奈瑟菌 属、铜绿假单胞菌、变形杆菌属、阴
核分枝杆菌、酵母样菌
道加德纳菌、杜克雷嗜血杆菌
（一） 血、骨髓标本
血液、骨髓标本中常见致病菌 金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链
球菌、沙门菌、布氏杆菌、肠杆菌科细菌、厌 氧菌等 接种平板：血平板、厌氧血平板 孵育条件：普通温箱 35℃
五 各类标本中的常见病原菌
标本 血液、骨髓
脑脊液
革兰阳性菌 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、链球菌（A 群、B 群 链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌）、肠球菌、厌 氧链球菌、产单核李斯特菌、炭疽杆菌、产气荚膜梭 菌、丙酸杆菌、念珠菌、分枝杆菌
金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌 A、B 群链球菌、消化链 球 菌、 炭疽芽 孢杆菌、 结核分枝 杆菌、产单核李斯特 菌、新型隐球菌、白色念珠菌
尿液
下呼吸道标本 （痰液）
金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球 淋病奈瑟菌、肺炎克雷伯菌、沙雷菌属、大肠 菌属、链球菌属、棒状杆菌属、分枝杆菌属、真菌 埃希菌、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、
假单胞菌属
金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、A 群链球菌、厌氧球菌、卡他莫拉菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、
产气袋中置普通温箱 35℃孵育 • 痰及鼻咽分泌物： 接种血平板和嗜血巧克力平板 置CO2温箱 35℃孵育
• 尿液：（计数）接种血平板 置普通温箱 35℃孵育
• 穿刺液（胆汁、胸腹水等）：接种血平板和无菌肉汤 置普通温箱 35℃孵育
• 脑脊液：接种血平板和嗜血巧克力平板及无菌肉汤 置 CO2温箱 35℃孵育
接种平板：血平板、嗜血巧克力 平板、麦康凯平板
孵育条件：5%-10%CO2孵箱， 35℃
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• 常见的上呼吸道栖居菌群中有甲型和丙型链 球菌、微球菌、奈瑟菌、表皮葡萄球菌、白 喉以外的棒状杆菌、拟杆菌、校杆菌、厌氧 球菌。
• 致病菌：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、卡 他布兰汉菌、流感嗜血杆菌、革兰阴性菌、 A群链球菌、酵母菌、曲霉菌、毛霉菌、结 核分枝杆菌等
临床微生物标本常见细菌培养和鉴 定
胡方芳 贵州省人民医院中心实验室
• 一 常见细菌培养要求 • 二 细菌鉴定的基本原则 • 三 细菌鉴定的基本依据 • 四 细菌鉴定的基本步骤 • 五 各类标本中的常见病原菌
一 常见细菌培养
• 血液：血培养瓶 35 ℃血培养仪孵育 需氧瓶：接种血平板 置普通温箱 35℃孵育 厌氧瓶：接种血平板和厌氧血平板 厌氧平板放厌氧
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（三） 尿液标本
• 无菌采集中段尿 • 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本 • 排尿困难者考虑导尿采集标本。 • 接种平板：10μl /1μl血平板 • 孵育条件：普通温箱 35℃
尿液标本常见病原菌
尿液：大肠、金葡、腐葡、表葡、A群、肠球、淋 球、厌氧链球菌、肠杆菌科细菌、阴道加德纳、 念珠菌、结核分枝杆菌、沙眼衣原体、解脲脲原 体、生殖道支原体等。
• 烧伤创面脓汁以铜绿假单胞菌最多见；其次为 金黄色葡萄球菌、变形杆菌、溶血性链球菌、 大肠埃希菌、产碱杆菌、霉菌等；还常见多种 细菌混合感染。
• 常居菌中某种细菌的数量占有优势，且机体抵 抗力低下时也可造成感染。
（六） 生殖道标本
• 涂片检查：革兰染色：可查出一般细菌，尤其淋 病奈瑟菌(需进一步培养证实)、杜克雷嗜血杆菌、 阴道加德纳菌、假丝酵母菌等。
（一 ）挑选可疑菌落
• 生长特性： 1 固体培养基 （1）菌落形态：形状（圆形、波浪、卷发形等）、
表面特征（光滑、粗糙、粘液）、光泽等 （2）菌落大小：分为大菌落、中等菌落、小菌落
（针尖样菌落），一般G-菌落比G+ 大，葡萄球菌 菌落比链球菌大等
（4）色素： 水溶性：铜绿假单胞菌（绿色） 脂溶性：金黄色葡萄球菌（黄色） 不同颜色：黏质沙雷氏、黄杆菌等 （5）气味：生姜味（铜绿）、水果香味（产碱杆
（3）杆菌肽敏感试验（BC）：A群链球菌敏感（S）
（4）其他：嗜麦芽窄食单胞菌（IPM R）
+ 靛基质
+ 大肠杆菌 枸橼酸杆菌 产酸克雷伯
产气、阴沟 普罗菲登 枸橼酸杆菌
其他肠杆菌 其他克雷伯
流感嗜血杆菌 多形性 血平板 -
嗜血巧克力 + 普通 –
卫星现象 +
G- b
乳糖
-
氧化酶
+
-
- 金属光泽 +
• 氨基酸和蛋白质的代谢试验
1 吲哚试验（I）：肠杆菌科鉴定，如大肠埃希氏菌（阳 性）和肺炎克雷伯氏菌（阴性）
2 H2S试验：肠杆菌科种属鉴定，如：枸橼酸杆菌、变形 杆菌、大部分沙门氏菌（阳性）
3 尿素酶试验：如变形杆菌、克雷伯菌（阳性），埃希氏 菌、普罗威登氏菌（阴性）
• 碳源和氮源利用试验
1 枸橼酸盐利用试验：沙门菌属、克雷伯菌属（阳 性），埃希氏菌、志贺氏菌（阴性），铜绿假单 胞菌、洋葱伯克霍尔德菌（阳性）
（四） 无菌体液标本
• 对于无菌部位所采集的标本，只要培养出细菌（排除污染） 一律都视为致病菌。
• 无菌部位采集的标本：CSF、胸水、腹水、关节液各器官 穿刺液等。
接种平板：血平板/血平板+巧克力（CSF） 孵育条件：普通温箱 35℃/ 5%-10%CO2孵箱，35℃（CSF）
（五） 伤口分泌物
• 当每克组织中细菌数量＞(105～106)时，可造 成伤口感染。葡萄球菌，链球菌是引起毛囊炎、 疖痈、扁桃体炎、化脓性骨髓炎的常见细菌。
2 接种量的选择：
3 孵育条件选择：35℃、湿度等，一般生化鉴定不 需要CO2
4 反应时间：短、18-24h、48h
5 结果观察：直接观察、添加其他试剂
• 碳水化合物的代谢试验
1 糖（醇、苷）类发酵试验：最关键试验，如沙门发酵葡萄糖， 但不发酵乳糖；大肠埃希氏菌发酵葡萄糖和乳糖
2 革兰阴性菌葡萄糖代谢鉴定试验：（氧化/发酵O-F试验）区别 肠杆菌科（发酵型）和非发酵菌（氧化型或产碱型）
形态规则
李斯特菌 芽孢杆菌 乳酸杆菌
李斯特菌 β溶血 G+ b 过氧化氢酶+ 26℃ 动力+ 35℃ 动力-
芽孢杆菌 生长快 溶血
不规则 文字形
溶血
+
-
隐秘杆菌 棒状杆菌
炭疽杆菌 生长快 不溶血 触酶+ 动力串珠状
乳酸杆菌（少量 兼性厌 氧）
血平板 + 巧克力 +
菌落细小 强烈乳酸味
丹毒丝菌 触酶 氧化酶+ 动力 硫化氢+