临床微生物标本处理及操作流程

许多不着色的有折射的杆状细 菌
尿道感染
每年850万例尿路感染, 90%为女 性 1/2.5个妇女在一生中会得UTI 下行性感染：血流肾脏膀胱 （金黄色葡萄球菌，酵母菌，结 核分枝杆菌） 上行性感染：尿道膀胱肾盂 血流
用于尿液培养的标本
肾活检或肾抽吸物（外科） 耻骨上膀胱抽吸物
临床微生物室标本处理及检验流程
Infection Control Team
The Role of the Clinical Bacteriology Lab
临床微生物检验流程示意
分 析 前
门诊 病房 诊所
不合格
留取
临床标本
SOP
环节一 环节二 环节三
+
SOP
运送
合格
IQ
标本合格 判定
标本合格？ 接种
尿常规结果 尿培养结果 可能原因
WBC － PRO －
WBC >+ PRO >+ WBC >+ PRO >+ WBC >+ PRO >+ WBC <++*/－ PRO －
计数 < 105
计数 < 105
无泌尿系统感染
重复送检，检查取样和保存条件 是否符合要求，通知实验室为重 复检查。 预示患者泌尿系统感染。按药敏 结果选择性用药。 患者泌尿系统可能感染，但标本 可能被污染，应重复送检。 标本污染
早发B群链球菌病
1%的新生儿因母亲定植 （10-30%的孕妇）发展为 EOD 50%病死率 25%的美国女性在L&D期间 得到IV预防 长期病症包括：在30%以上的 新生儿中产生严重精神运动 发展障碍
Adriaanse et al. Neonatal early onset group B streptococcal infection: a nine-year retrospective study in a tertiary care hospital. J Perinat Med. 1996;24:531–538
纸片扩散法-测量抑菌圈（1）
使用透射光观察 ：
Staphylococcus spp. 葡萄球菌属 linezolid利奈唑烷 oxacillin苯唑西林 vancomycin万古霉素 任何生长均有意义 Enterococcus spp.肠球菌属 vancomycin万古霉素
Light光线
纸片扩散法-测量抑菌圈（2）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ鉴定&药敏
多种肠道细菌或混杂的皮肤菌丛；重新采集清 洁标本
1-2种机会致病菌（查阅凝固酶阴性葡萄球菌的以上相同注释
多种肠道细菌或混杂的皮肤菌丛； 重新采集清洁标本.
进行鉴定和药敏，若数量< 104CFU/ml， 仍然对可能的致病菌进行操作
若为腐生葡萄球菌， 则处理与其他致病菌相同； 其他的凝固酶阴性葡萄球菌则视为污 染
你看见多少种形态？
呼吸道标本中未被染色的，有折射的杆菌=抗酸杆菌
呈链排列的革兰阳性球菌？或革兰阳性分枝杆菌？
肺中的结节吸出物，不规则“球菌”，分叉，无短链，链的末端的呈尖状，都 证明是分枝状的革兰阳性杆菌，可能是放线菌或诺卡菌（通常来自脑或肺组织 的标本）
呼吸道标本的涂片评估模式
肺炎-可接受的 很少的鳞状上皮细胞 <10个每低倍视野 很多的中性粒细胞 不合格标本 许多鳞状上皮 >10个/低倍视野 很少有或没有中性粒细胞 免疫抑制的病人也会出现 中性粒细胞减少 评述 可以在玻片上看到许多鳞状上皮细胞，说明在 采集时受到了上呼吸道分泌物的污染或口水的 污染。 中性粒细胞和上皮细胞都很少的标本需要培养
下呼吸道标本
Lower Respiratory Tract Specimens
下呼吸道感染
Lower Respiratory Tract Infections

急性支气管炎
社区获得性肺炎 院内获得性肺炎 免疫妥协患者肺炎
下呼吸道标本
Lower Respiratory Tract Specimen
三种或以上的机会致病 菌包括酵母菌
ID & Suscept.鉴定&药敏
多种肠道细菌或混杂的皮肤菌丛；重新采集清洁标本
多种肠道细菌或混杂的皮肤菌丛；重新采集清洁标本
)1-2种机会致病菌 （查阅凝固酶阴性葡萄球菌的注释）
若为腐生葡萄球菌，则处理与其他致病菌相同； 其他的凝固酶阴性葡萄球菌则视为污染
进行鉴定和药敏，若数量< 105CFU/ml， 仍然对可能的致病菌进行操作
严格无菌操作
soap
脑脊液
CEREBROSPINAL FLUID
无菌操作，腰椎穿刺采样
最少1 mL，最好>5 mL
打入3个小管中，以第二根小管送检培养 分枝杆菌培养标本需要2 mL以上，置于4℃保存 即时送检 绝对不能冷藏！
上呼吸道标本
Upper Respiratory Tract Specimens
拭子吸附细菌，难于释放到平板培养 尽可能抽吸或将拭子深入伤口，紧贴伤口前沿取样深部 伤口和特殊原因造成的伤口，如动物咬伤，应考虑厌氧培 养；
组织和抽吸物涂片检查
发现 出现鳞状上皮细胞 大量的中性粒细胞 大量的中性粒细胞染色多样染色阳性和阴性，小的细 菌 出现少量破碎的中性粒细胞和比较大的面包车样的染 色不定的杆菌 很少有中性粒细胞，但是有其他体细胞 评述 提示标本采集技术不过关；培养出来的可能是 皮肤正常菌群 如果查见细胞内的细菌，则更有意义。 混合有厌氧或兼性厌氧菌感染 可能是梭菌引起的组织坏死，紧急外科手术， 产气荚膜梭菌引起的气性坏疽 患者不能产生足够的免疫反应或微生物不能趋 化中性粒细胞（如球菌）。仍然高度怀疑细菌 病因。 细菌感染 如果分离自脓肿，提示咽峡炎链球菌（米勒链 球菌）感染。 特别是从淋巴结或组织中分离的，可能是生物 恐怖试剂（布鲁氏杆菌，耶尔森，弗朗西斯） 要在风厨中操作。平板用胶条密封在生物安全 柜中操作，不可以嗅标本。
计数 > 105 培养出一种致病菌 计数 > 105 培养出大于两种致病菌 计数 > 105 培养出大于两种致病菌
女性生殖道标本送检
女性下生殖道标本采集
宫颈或宫颈内部：淋病奈瑟菌，沙眼衣 原体，人乳头瘤病毒
肛门或直肠拭子：淋病奈瑟菌，B群链球 菌（+阴道拭子）
阴道高位拭子：酵母菌，阴道毛滴 虫，细菌性阴道感染
圈内菌落
致谢：
Ms Ellen Jo Baron
(Stanford Univ.Dept.Pathology)
Ms Janet Hindler
(UCLA Medical Center Los Angeles ,California)
提供“临床微生物实验室基本操作流程”图片资料。
谢谢!
实验室
直接检测
EQA标本
环节四
培养
环节五
培养基、冰箱 温箱、气体
分 析 中
检测 报告
仪器设备、试剂 环节六
分 析 后
对每个环节进行控制，构成质量保证体系
内 容
标本处理 微生物鉴定
药敏试验
标本处理
• 血培养 • 脑脊液培养 • 呼吸道标本 (痰标本、咽部标本） • 尿培养 • 生殖道标本培养 • 抽吸物和组织标本的培养（需氧、厌氧培养） • 粪便培养
自然咳痰
诱导痰 气管内吸取物 肺部组织
支气管肺泡灌洗液 保护性毛刷
支气管灌洗液
标本质量
脓痰
粘液样痰
唾液or诱导痰 (?)
带血痰
用革兰氏染色来评估 呼吸道标本是否合格
痰标本>10鳞状上皮细胞/每低倍视野=拒收
有PMN的痰标本，中性粒细胞多，且鳞状上皮细胞特别少 = 接受，进行培养
粘液丝
胞内细菌 ——提示感染
使用反射光观察： 所有其他药物/菌株组 合
Light光线
纸片扩散法-测量抑菌圈（3）
变形杆菌属…. 忽略迁徙性生长
纸片扩散法-测量抑菌圈（4）
测量完全抑菌的圈
Linezolid 利奈唑烷
纸片扩散法-测量抑菌圈（5）
大肠埃希菌混杂有肠球菌；用纯培养 重复试验
铜绿假单胞菌耐药亚群 ；测量无 菌区域
很多中性粒细胞混合有形态多 样的细菌（革兰氏阴性杆菌， 纺锤形，革兰氏阳性球菌） 许多或中等量的中性粒细胞， 以一种形态的细菌为主 酵母菌样，酵母菌是一种 很少引起肺炎的细菌，常 由口腔污染
吸入性肺炎标本革兰氏染色的典型形式，培养 只会培养出正常菌群，所以革兰氏染色是用于 诊断的方法。 成双革兰氏阳性球菌，短链=肺炎链球菌 革兰氏阳性菌成群排列=金黄色葡萄球菌 革兰氏阴性球杆菌（小）=流感嗜血杆菌 革兰氏阴性杆菌大且肥厚=肺炎克雷伯菌或其他 肠道菌 革兰氏阴性双球菌=卡他莫拉菌 可能是肺结核，抗酸杆菌不能被革兰氏染色所 染色。
评价尿培养的标准
病人 无症状者 有症状者，不固定的 有症状，性活跃女性 男性 标本特征 清洁留取 清洁留取 清洁留取 清洁留取 有意义菌落形成单位/ml（非皮肤污染） 100,000 10,000 1-2种机会致病菌。若多于2种则认为尿 液被污染 100个纯菌落肠杆菌科菌 1000个，机会致病菌
任何人
尿液运输方法
如不能及时送检，需冷藏。
4小时延迟送检，须废弃标本。
自然排尿 是 过夜培养 否
继续培养； 随后观察；发送初步的培养阴性报告
> 105 CFU/ml
< 105 CFU/ml
24小时后仍不生长则发出 最终的生长阴性报告
纯培养的机会致病菌 （查阅凝固酶阴性葡萄球菌的注释）
1 organism 一种以上细菌生长
细胞内细菌
柱状纤毛上皮细胞
肺泡巨噬细胞
滑石颗粒
见于迁延长时间的呼吸道疾病
淀粉样小体
弹性纤维
库什曼螺旋体
呈链排列的革兰阳性球菌和革兰阴性球杆菌。缺乏鳞状上 皮细胞提示混合厌氧菌感染
几种细菌的混合形态，缺乏鳞状上皮细胞=混合厌氧菌感染。 如果是呼吸道标本可能是吸入性肺炎。报告临床医生“提示 吸入性肺炎”
导管尿
是
过夜培养
否
继续培养； 随后观察；发送初步的培养阴性报告
> 104 CFU/ml
< 104 CFU/ml
24小时后仍不生长则发出 最终的生长阴性报告
纯培养的机会致病菌 （查阅凝固酶阴性葡萄球菌的注释）
一种以上细菌生长
检出三种或以上的机会致病菌包括酵母菌 （病人的首份尿标本显示如此的培养结果 ，若重复的尿标本仍然培养出相同的细菌 ，则需要对菌株进行操作）
（孕妇，婴儿，全膀胱）
微导管尿（内部导管和外部导管）-老年人
中段尿，清洁留取——急诊成年人
留置导尿管中采集的标本（经常被三种以上细菌污染）
尿液标本
采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外
生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗
长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。
做厌氧培养时应耻骨上膀胱穿刺采集尿。
微生物鉴定（2）
• 奈瑟菌属、莫拉菌属 • 不动杆菌属 • 布氏杆菌属、巴斯德菌属 • 芽胞杆菌属 • 产单核李斯特菌 • 酵母菌属
药敏试验
• 纸片扩散法药敏试验 • 特殊药敏试验
MRSA 克林霉素耐药的葡萄球菌 VISA或VRSA 青霉素耐药的葡萄球菌 超广谱β-内酰胺酶
淋病奈瑟氏菌感染
挤压尿道或直接获取尿道
口分泌物；
直接涂片
如果培养，须直接接种温暖
的筛选性平板，保温并即刻 送微生物室培养。
任何不能及时送检的生殖道标本，都应采 用运送培养基采样保存。
禁止冷藏
标本采样和送检
临床常常送检脓液和渗出液的拭子给实验室做检查。风 险 标本不足量
拭子干燥
任何人 任何人 任何人 任何人 不同人
内置导尿管
通过直接导管获得 外科手术从肾脏获得 经皮穿刺膀胱吸取 任意标本 有争议
100,000任意数量机会致病菌
100任意数量机会致病菌 任意数量（肉汤增菌，厌氧菌） 任意数量（肉汤增菌，厌氧菌） 任何数量金黄色葡萄球菌 任何数量的酵母菌
出现如下情况时，怎样判断？
1.
在孕期35～37周时的普查培养
a. b. c. d. 阴道和直肠拭子 肉汤过夜增菌 接种于血平板上 再孵育过夜和鉴定可疑菌落
2. 3.
任何有GBS菌尿的患者需要在分娩期做好预 防 分娩时快速检测敏感性不够
男性生殖道标本送检
男性的生殖道致病菌与女性绝大部分一致； 尿道炎通常由淋病奈瑟氏菌或非淋病奈瑟氏菌引起； 可能并发于生殖器溃疡；
细胞内微生物 成块的小的灰白的染色不规则的阳性成链的球菌 很细小的革兰氏阴性杆菌
微生物鉴定
微生物鉴定（1）
• • • • • • • • • •
血平皿上的菌落形态 革兰阳性细菌 所有的链球菌 β-溶血链球菌 α-溶血链球菌与肺炎链球菌 葡萄球菌属 肠道革兰阴性杆菌 沙门菌属，志贺菌属 假单胞菌属 嗜血杆菌属