濒危植物桃儿七中鬼臼毒素的提取分离及分析
桃儿七药理作用及其栽培技术
桃儿七药理作用及其栽培技术【摘要】桃儿七具有较高的开发价值，但其野生资源极为有限，而近年来更因为过度采挖而导致其生存环境持续恶化，桃儿七这一植物陷入濒危的境地。
科技管理部门及科研机构有必要就桃儿七的药理作用及其栽培技术进行深入研究，加强桃儿七的保护性开发及利用工作，这对于加强我国西部和山区生态环境保护、促进当地经济发展都有着重要的意义。
【关键词】桃儿七；药理作用；栽培技术桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum （Royle）Ying）是小檗科（Berberidaceae）鬼臼亚科（Podophylloideae）桃儿七属多年生草本植物，主要分布于海拔较高的喜马拉雅山及附近地区。
桃儿七性温、味苦，具有怯风湿、利气血、止咳、调和诸药等功效。
近年来，医药科学研究发现桃儿七的根和根茎中含有大量的鬼臼毒素及其衍生物，鬼臼毒素（podophyllotoxin）具有很高的抗癌活性，正是合成抗癌药物的前体物质之一，临床上可用于皮肤癌、子宫癌、乳腺癌、食道癌等癌症的治疗，桃儿七的药用价值和经济价值也进一步提升。
但桃儿七的繁殖能力较弱，对生长环境的要求较为苛刻，生长极为缓慢，在全世界分布极少且零散，野生资源极为有限。
同时，在桃儿七被大规模挖掘的地方，随着植被的破坏而导致其生存环境的改变，使野生桃儿七更为稀少，已经陷入濒危的境地。
国家将桃儿七列为国家三级保护植物，并大力扶持桃儿七的栽培技术研究，现已取得一定进展。
1.桃儿七的药理作用桃儿七这类植物的化学成分十分复杂，其所蕴含的鬼臼毒素含量在同类植物中较高。
鬼臼毒素及其衍生物在抗肿瘤抑制细胞增殖方面具有较好的疗效，桃儿七在医疗卫生领域中的作用也越来越重要，受到了国内科研机构和药物生产商的广泛青睐。
1.1抗肿瘤近半个世纪以来，医药学已经证明鬼臼毒素及鬼臼毒素类衍生物在抗肿瘤、抑制细胞增殖方面具有明显疗效。
当鬼臼毒素及鬼臼毒素类衍生物作用于病变细胞微管聚合时，可有效抑制细胞的有丝分裂活动，使其停止在中期，控制病情发展；作用于拓扑异构酶II时，则可形成结构稳定的DNA拓扑异构酶II药物分子复合物，造成癌细胞DNA单链或双链的断裂，导致DNA异常重组；抑制癌变细胞对各类核苷，如胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤等的摄取，从而有效抑制病变细胞DNA、RNA以及蛋白质的合成，控制细胞增长。
濒危药用植物桃儿七中鬼臼毒素和总木脂素含量测定_黄坤
Vol. 37，Issue 10 May，2012
濒危药用植物桃儿七中鬼臼毒素和总木脂素含量测定
黄坤1，2 ，蒋伟1 ，赵纪峰1 ，王昌华1 ，刘翔1 ，张植伟1 ，秦松云1 ，钟国跃1*
（ 1. 重庆市中药研究院，重庆 400065； 2. 北京中医药大学 中药学院，北京 100102）
102. 96 2. 6
102. 15 1. 7
101. 79 2. 9
2. 1. 9 耐用性 过 4 号筛） 约 ·1361·
第 37 卷第 10 期 2012 年 5 月
Vol. 37，Issue 10 May，2012
0. 2 g，精密称定，置 25 mL 量瓶中，加入 40% 甲醇溶 液至刻度，超声处理 45 min，放冷，用 40% 甲醇溶液 补至刻度，摇匀，滤过，取续滤液进行 HPLC 测定，比 较流速分别在 0. 6，0. 8，1. 0 mL·min － 1 时色谱峰的 变化，测得 鬼 臼 毒 素 含 量 以 及 相 对 标 准 偏 差、分 离 度、理论塔板数。结果表明，各项 RSD ＜ 3% ，分离效 果理想。 2. 1. 9. 2 柱温的考察 利用 2. 1. 9. 1 中样品进行 HPLC 测定，比较柱温在 20，25，30 ℃时，色谱峰的变化， 测得鬼臼毒素含量以及相对标准偏差、分离度、理论塔 板数。结果表明，各项 RSD ＜ 3% ，分离效果理想。 2. 1. 10 样品含量测定
Boston Crest ODS C18 色 谱 柱 （ 4. 6 mm × 250 mm，5 μm，SN 10090719461 ） ； phenomenex Gemini C18 保 护 柱 （ 4. 0 mm × 3. 0 mm ） ； 流 动 相 甲 醇-水 （ 50∶ 50） ； 检测波长 290 nm； 柱 温 25 ℃ ； 流 速 0. 8 mL· min － 1 ； 进 样 量 20 μL； 时 间 30 min，色 谱 图 见图 1。
珍稀药用植物桃儿七
２ ０ １ ０ ， ３ ０ （ １ １ ）
杨 晖 等：珍稀药用植物桃儿七细胞工程及内生菌研究进展
９ ５
先端渐尖， 边缘具尖锯齿， 下面被柔毛； 花两性， ６基数， 单生茎端， 先叶开放； 萼片早落； 花瓣粉红色， 倒卵状长 圆形， 外轮大， 内轮小； 雄蕊长 ６～ ９ ｍ ｍ ， 花药线形， 长３ ， 具四合花粉； 子房 １室， 生多数胚珠； 浆果卵圆 ～ ６ ｍ ｍ ９ ｍ ｍ ， 直径 ２～ ５ ｃ ｍ ； 种子多数， 每 形， 熟时红色， 长 ４～ 株平均 ６ ０粒， 多可至 １ ８ ０粒。自然状况下， 桃儿七主要 通过种子进行有性繁殖， 但是种子需要经过 ６～ ９个月 的休眠期才能完成生理后熟， 从种子萌发到长成商品 ６年。植株通常 ５月中上旬出苗， ５月 苗一般需要 ５～ 下旬 ～ ６月上旬开花， ８～ ９月果实成熟。 桃儿七的生长及植株中的鬼臼毒素含量与其生境 （ 海拔、 土壤、 温度、 湿度、 ｐ Ｈ 等） 、 季节及采收时间有 ａ ｄ ｅ ｅ ｍ 关。Ｎ
［ １ ３ ］
发现在 ４种不同生态型的
Ｐ ．ｈ ｅ ｘ ａ ｎ ｄ ｒ ｕ ｍ 中， 叶片数目与根茎中鬼臼毒素含量呈 反相关， 即 ４片叶植物中鬼臼毒素含量低于三片叶、 两 片叶和一片叶植物。说明植株的营养生长与作为次生 代谢产物的鬼臼毒素积累呈反相关。鬼臼毒素含量最 高时是在开花期， 通常越是成熟的植株鬼臼毒素含量 越高。
１ ６ ］ Ｕ ｄ ｅ ｎ 等［ 以Ｐ ．ｈ ｅ ｘ ａ ｎ ｄ ｒ ｕ ｍ 种子萌发获得的无菌苗根
等对生长在印度喜马拉雅中部 Ｋ ｕ ｍ ａ ｕ ｎ
地区不同海拔高度 （ ２７ ４ ０～ ３３ ５ ０ ｍ ）的 Ｐ ．ｈ ｅ ｘ ａ ｎ ｄ ｒ ｕ ｍ １ １个种群的研究表明， 植物生长量， 如植株高度、 茎的 直径、 叶面积等指标与其生长的海拔高度呈负相关， 而 根茎中的鬼臼毒素随海拔高度上升而增加。环境条件 越干燥， 植物生长速度越慢， 植物体内鬼臼毒素含量越 高， 而湿润条件下的植株由于生长速度相对较快， 鬼臼 ｕ ｒ ｏ ｈ ｉ ｔ 等 毒素含量较低。Ｐ
濒危药用植物桃儿七野生居群遗传多样性与遗传结构的SCoT分析
濒危药用植物桃儿七野生居群遗传多样性与遗传结构的SCoT分析目的：揭示珍稀濒危药用植物桃儿七的遗传多样性水平及居群遗传结构特点。
方法：采用新型分子标记SCoT对来源于我国的6个桃儿七野生居群共45个个体进行遗传多态性检测。
运用POPGENE软件计算相关遗传参数，UPGMA 方法聚类，结合MEGA5软件生成树状图。
结果：筛选出的27条引物，共检测到350个位点，其中284个为多态位点，平均每条引物扩增所得多态条带为10.52条。
物种水平上，桃儿七6个野生居群的遗传多样性较为丰富，PPB 79.27%，Ne 1.332 7，H 0.210 9，Hsp0.328 6。
在居群水平上，遗传多样性水平较低：PPB 10.48%（4.00%～23.71%），Ne 1.0487（1.020 7～1.103 7），H 0.029 7（0.012 9～0.063 1），Hpop 0.046 2（0.019 9～0.098 6）。
Nei′s 基因多样性指数计算的居群间遗传分化系数Gst=0.841 1与Shannon′s居群分化系数（Hsp-Hpoppop）/Hsp=0.849 4基本一致，均说明大部分遗传变异存在于居群间。
基因流Nm= 0.094 4，表明桃儿七居群间基因交流处于低等水平。
Nei′s遗传一致度（I）范围为0.570 8～0.978 7。
聚类分析将供试居群分为2 类，相同地理来源或相似生境的材料具有聚为一类的倾向。
结论：供试野生桃儿七具有较丰富的遗传多样性，为有效保护和改良种质资源奠定了一定的基础。
标签：桃儿七；SCoT；遗传多样性；遗传结构桃儿七Sinopodophyllum emodi（Wall.）Ying为小檗科桃儿七属多年生草本植物，《神农本草经》中以“鬼臼”之名收载，药用历史悠久，其根及根状茎、果实均可药用，具有祛风除湿、活血化瘀、化痰止咳、解毒的功效，用于风湿痹痛、肢体麻木、胃脘疼痛、跌打损伤、劳伤咳嗽等证，并可解铁棒锤中毒。
桃儿七的研究进展
桃儿七的研究进展摘要：本文综述了桃儿七的生物学特性、化学成分、药理作用及解决途径，特别介绍了通过引种栽培、细胞培养、组织培养和内生菌发酵等生物技术手段生产鬼臼毒素的研究进展及存在的问题，旨在为解决桃儿七资源短缺问题提供相关理论依据，对促进桃儿七进一步研究开发，实现桃儿七资源的可持续利用具有重要意义。
关键词：桃儿七；鬼臼毒素；化学成分；组织培养桃儿七( Sinopodophyllumhexandrum)是小檗科鬼臼亚科桃儿七属一种多年生草本植物，分布于我国的云南、四川、陕西、甘肃、西藏、湖北，在国外的印度、尼泊尔等地也有分布。
其根、根茎、叶和果实均是民间草药，是具有悠久应用历史的药用植物，我国汉代的《神农本草经》中就有鬼臼的陈述，历来主要用于蛇咬伤、痈疖肿毒、跌打损伤、风湿筋骨痛及气管炎等。
由于桃儿七根和根茎中有含量较高的鬼臼毒素(Podophyllotoxin)，是合成VP16 (依托泊苷)和VM26（特尼泊苷）等多种抗癌药物的前体，同时也是治疗皮肤癌和性病尖锐湿疣的首选药物。
近年来，由于过度的采挖使原本稀少的野生桃儿七植物资源濒临灭绝，现已被列入《中国珍稀濒危植物名录》，并被《中国红皮书》收录。
1.生物学特性桃儿七生于海拔2700-4500米的高山地区，适于寒冷而湿润、夏季低温多雨、冬春干冷的气候，主要以自花授粉为主，偶尔也进行异花授粉。
高30~ 90cm；根状茎粗壮，结节状横走；不定根多数，长达30cm以上，直径2~ 3mm，红褐色或淡褐色；茎直立，基部具抱茎的鳞片，上部有1~ 3叶，叶片上有深浅大小各异的色斑；叶片心脏形，长13~ 20cm，宽16~ 30cm，3~ 5深裂几达基部，顶生裂片3浅裂，侧生裂片2中裂，小裂片先端渐尖，边缘具尖锯齿，下面被柔毛。
两性花单生，6基数，单生茎端，先叶开放；萼片早落；花瓣有白色、粉红色、红色、玫瑰红色、深红色、紫红色各种色彩，倒卵状长圆形，外轮大，内轮较小，张开；雄蕊长约6~ 9mm，花药线形，长药3~ 6mm，具四合花粉；子房1室，生多数胚珠。
浅析桃儿七内生真菌的分离及其活性产物的初步探究
目前国内外已有一些从不同产地和不同植物中分离的内生真菌中筛选出能产生鬼臼毒素和其他药用活性成分菌株的报道［5，6］，例如从桃儿七［8］、川八角莲（dysosma veitchii） ［9］和南方山荷叶（diphylleia sinensis）［10］等植物中都分别分离得到了产鬼臼毒素或其类似物的内生真菌。由此可见，内生真菌有着产生和它的宿主植物相同或相似成分的能力，是具有一定普遍性的现象，这些都显示出利用内生真菌培养生产相关植物药用成分（包括鬼臼毒素）的可能性。但是目前这类探究还处于起步阶段，且从内生真菌提取物中获得的活性成分含量还很低，尚不能满足进行工业化生产所需的水平。因此，有必要对此作更深入、全面的探究，以解决资源、环境保护和人类需求之间的矛盾。
浅析桃儿七内生真菌的分离及其活性产物的初步探究
日期： 2010年07月26日
［摘要合物的菌株。方法 用常规微生物学方法从桃儿七植株中分离出其内生真菌，分别对各菌株的提取物进行薄层层析，通过在紫外检测仪下观察和用浓硫酸-乙醇显色定性。结果 从桃儿七根、茎中共分离出21株内生真菌，其中编号为T8的菌株的菌丝体和发酵液提取物经TLC分析，都出现了和标准品颜色和Rf值相同的斑点。结论 该菌株应该具有产生鬼臼毒素或其类似木脂素类化合物的能力。
2 实验结果和讨论
2.1 内生真菌的分离及初步薄层分析 从桃儿七根、茎中共分离得到21株真菌。经分别培养和初步的TLC分析，有3种真菌的菌丝体提取物和鬼臼毒素标准品的Rf值基本相同，而且编号为T8的菌株发酵液提取物也出现了和标准品相同Rf值的斑点，说明该菌种不仅可能产鬼臼毒素或类似的代谢产物，而且在胞内外均有产生。因此，进一步的工作以T8为材料进行扩大培养，合并菌丝体和发酵液的氯仿提取物再进行TLC分析。
太白七药桃儿七研究进展_袁菊丽
性、扩大其临床用途而利用制剂新技术制备的鬼臼毒素相关产品的研究新进展，对促进桃儿七进一步研究开发及规
范其临床应用等方面具有重要意义。
关键词：桃儿七；化学成分；药理活性；临床应用
中图分类号：R282.71
文献标识码：A
文章编号：1673-842X(2011) 05-0095-03
Research Progress in Sinopodophyllum Emodi Wall
第13卷 第5期 2011 年 5 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 13 No. 5 May，2011
太白七药桃儿七研究进展
袁菊丽
（宝鸡文理学院化学化工系，陕西 宝鸡 721013）
摘 要：综述了桃儿七在化学成分、药理活性、临床应用方面的研究进展，特别介绍了为了降低鬼臼毒素的毒
桃儿七中鬼臼毒素的分离纯化方法大致可分 成化学提取分离法和柱层析分离法两类。化学提取 分离法具有操作简便、产量大的优点，但所得产品 纯度较低。柱层析分离法虽然能得到质量分数大于 98% 的鬼臼毒素产品，但操作烦琐，且产量低，难以 满足日益增长的需求。利用鬼臼毒素能形成溶剂加 合物的特性，采用二步结晶法，使粗品的纯化步骤大 为减化，在不用柱层析分离法的条件下，成功地制备 出了质量分数大于 96% 的鬼臼毒素精品，总产率为 1.7%[2]。
YUAN Ju -li （Chemistry and Chemical Engineering Department，Baoji University
of Arts and Sciences，Baoji 721013，Shaanxi，China）
Abstract：The paper summary research progress of Sinopodophyllum Emodi Wall in the chemical composition，pharmacological activity，clinical，in particular，introduce the cable in order to reduce the toxicity of podophyllotoxin and expand its clinical use and use of new technologies，preparation of podophyllotoxin preparation of new related products progress in promoting Sinopodophyllum Emodi Wall research and development and regulate the further clinical application，and other aspects of its significance.
桃儿七泡酒中毒1例
桃儿七泡酒中毒1例摘要] 桃儿七在民间和民族药中多有应用，一直作为民间治疗虫蛇咬伤、痛疖肿毒、催吐、风湿筋骨炎及气管炎等症状的药用成分。
在民族药中也多用于风湿关节疼痛、跌打损伤、心痛、风寒咳嗽、月经不调、活血止痛、解毒。
部分地区常用桃儿七加白酒浸泡饮用。
饮用少许桃儿七泡酒致意识障碍、呼吸困难、四肢瘫痪的病例少有报道，现将我院收治的1例桃儿七泡酒中毒报告如下。
[关键字] 桃儿七；鬼臼毒素；急性中毒A case of poisoning of Sinopodophyllum emodi (Wall.)Xu jing(college of clinical medicine, Dali University, Dali 671000, China)[Abstract] Sinopodophyllum emodi (Wall.) has many applications in Chinese folkand ethnic minorities traditional medicine, has been used as a medicinal ingredient for the treatment of insect bites, pain, skin infection or acute toxic reaction, induce vomiting, rheumatoid arthritis and bronchitis. It is also used in ethnic medicine for rheumatoid joint pain, traumatic injury, precordial pain , wind-cold cough, irregular menstruation, promoting blood circulation and relieving pain, and detoxication. In some areas, Sinopodophyllum emodi (Wall.) white spirits are often used for soakingand drinking. There are few reports of cases of consciousness disturbance，dyspnea and quadriplegia caused by drinking the sparkling wine. The acute poisoning of a caseof Sinopodophyllum emodi (Wall.) sparkling wines is reported in our hospital.[Key words] Sinopodophyllum emodi (Wall.);podophyllotoxin; acute intoxication1、临床资料患者男，47岁。
濒危中药材桃儿七的研究进展
濒危中药材桃儿七的研究进展郭生虎;朱永兴;关雅静【摘要】Sinopodophyllum hexandrum(Royle) Ying was a kind of Chinese endangered medicinal herb, distributed in the western Himalayas. The roots contained podophyllotoxin with strong anti-tumor activity which was precursor compound of an-ticancer drugs, and has broad market prospects. This article outlines the studies on biological characteristics and pharmaco-logical action, and summarizes the endangered reasons and the current status of the resource.The research progress of re-sources protection from the points of artificial cultivation, tissue culture, cell engineering and hairy culture were discussed. Based on the recent achievements, the future research proposes to solve the shortage ofSinopodophyllum hexandrumare proposed, in order to protect and use the resources ofSinopodophyllum hexandrumreasonably.%桃儿七为我国濒危中药材,分布于我国喜马拉雅山西部,其根部所含鬼臼毒素具有较强的抗肿瘤活性,是多种抗癌药物的前体化合物, 具有广阔的市场前景. 笔者从桃儿七生物学性和药理作用研究方面总结了桃儿七濒危原因和资源现状,从桃儿七人工栽培、组织培养与细胞工程培养和毛状根培养方面阐述了对桃儿七资源保护的研究进展,依据已有的研究成果,提出了未来解决桃儿七资源短缺的研究方向,以期为桃儿七资源的保护和合理利用提供参考.【期刊名称】《宁夏农林科技》【年(卷),期】2015(056)011【总页数】3页(P77-79)【关键词】桃儿七;生物学特性;药理作用;组织培养;资源保护【作者】郭生虎;朱永兴;关雅静【作者单位】宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川 750002;宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川 750002;宁夏农林科学院农业生物技术研究中心,宁夏银川 750002【正文语种】中文【中图分类】R931.2AbstractSinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying was a kind of Chinese endangered medicinal herb，distributed in the western Himalayas.The roots contained podophyllotoxin with strong anti-tumor activity which was precursor compound of anticancer drugs，and has broad market prospects.This article outlines the studies on biological characteristics and pharmacological action，and summarizes the endangered reasons and the current status of the resource.The research progress of resources protection from the points of artificial cultivation，tissue culture，cell engineering and hairy culture were discussed. Based on the recent achievements，the future research proposes to solve the shortage ofSinopodophyllum hexandrumare proposed，in order to protect and use the resources ofSinopodophyllum hexandrumreasonably.Key wordsSinopodophyllum hexandrum；Biological characteristics；Pharmacological action；Tissue culture；Resource protection桃儿七（Sinopodophyllum hexandrum（Royle）Ying）又名桃耳七、小叶莲、鸡素苔，为小檗科桃儿七属多年生草本植物，是我国珍稀濒危中药材［1］，主要生长在海拔2 700～4 200 m的亚高山和高山地区，其分布范围较广，在世界范围内主要分布在：喜马拉雅西部和西南部的阿富汗、巴基斯坦、克什米尔、印度北部、尼泊尔、不丹、锡金等国家和地区［2］。
桃儿七内生真菌产鬼臼毒素发酵条件研究
桃儿七内生真菌产鬼臼毒素发酵条件研究
曹莉;黄建新;李建芳
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2007(033)009
【摘要】对鬼臼毒素(Podophyllotoxin)产生菌Ty的发酵培养基及发酵条件进行优化研究.结果表明,优化的半合成培养基组成为:可溶性淀粉2%,蔗糖2%,蛋白胨0.1%,酵母膏0.1%,K2 HPO4 0.1%,NaCl 0.1%,pH6.5,装液量80 mL/250 mL三角瓶,接种量2.5%,发酵培养6 d,细胞干重为8.5g/L,鬼臼毒素产量达2.418μg/L.【总页数】5页(P28-32)
【作者】曹莉;黄建新;李建芳
【作者单位】西北大学生命科学学院,陕西西安,710069;西北大学生命科学学院,陕西西安,710069;西北大学生命科学学院,陕西西安,710069
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
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洪亚辉
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Science转录 代谢力作!鬼臼毒素合成通路的代谢及转录分析
Science转录+代谢力作!鬼臼毒素合成通路的代谢及转录分析【One week, One paper】Science:转录+代谢力作!鬼臼毒素合成通路的代谢及转录分析2017-03-16 小浪迈维代谢MetWare点击"蓝色"关注SELECTION 文献精选中文名:桃儿七中鬼臼毒素合成通路的代谢及转录分析英文名:Six enzymes from mayapple that complete the biosynthetic pathway to the etoposide aglycone期刊:Science,IF=34.661发表时间:2015桃儿七(Sinopodophyllum hexandrum (Royle) Ying) 是小檗科桃儿七属多年生草本植物,植株高20-50厘米早在1992 年桃儿七就被《中国植物红皮书》收录."桃儿七"属于"太白七药"之一,具有神奇的抗癌作用,其根和根茎中含有大量的具有抗癌活性的木脂素类物质,其中鬼臼毒素(podophyllotoxin) 抗癌活性最高,是合成GP7,VP216(etoposide) 和VM 226 (teniposide) 等抗癌药物的起始物.由于根状茎与果实入药,而被任意采挖,天然繁殖能力较弱,随着植被的破坏而导致其生长环境的改变,植株日益稀少,分布区日渐缩减.目前许多临床药物是通过天然的植物代谢物合成的,但是只有一小部分植物代谢物的合成通路是已知的,这就成为这些天然代谢物的批量化生产的限制条件.鬼臼毒素是一种木酚素,是抗肿瘤药物依托泊苷的前体,本身并没有拓扑异构酶抑制剂功能,但经过一系列化学修饰后形成的依托泊甙具有拓扑异构酶抑制剂活性,能够发挥抗肿瘤作用,合成通路只有部分是已知的,目前只能依靠天然的植物产生的代谢物合成依托泊苷.因此,完整的鬼臼毒素的合成通路将有助于帮助依托泊苷的工厂化生产.研究材料:物理损伤的离体桃儿七的健壮叶片技术平台:LC-MS,RNA-seq,转基因方案设计:1)利用LC-MS检测方法,检测物理损伤后不同时间的桃儿七种鬼臼毒素的含量,发现叶片受伤后在12,24h后鬼臼毒素含量达到最大;2)根据LC-MS检测结果,对桃儿七叶片进行转录组测序,取样时间0,3,9,12h,每个样品三个重复,根据转录组信息及公共数据筛选与鬼臼毒素合成相关的基因;3)利用转基因的方法,将候选基因转到烟草叶片中,并利用LC-MS方法检测烟草叶片中代谢物含量的变化,找到鬼臼毒素合成通路的调控基因.研究结果:在鬼臼毒素的生物合成通路中,前期的基因是已知的.如图1所示,DIR,PLR,SDH,CYP719A23这4个鬼臼毒素合成相关的前期基因是已知的.后期基因及中间代谢物通路不清楚,但是合成通路中的已知亚太因(yatein)和去氧鬼臼毒素(deoxypodophyllotoxin)以及鬼臼毒素是已知的.作者利用公共数据库中的桃儿七鬼臼毒素相关转录组信息进行分析发现,DIR,PLR,SDH,CYP719A23这4个基因都是高表达的.选择公共数据库中与已知基因具有相似表达的候选基因,筛选到4个O-甲基转移酶(OMT1-4)基因,12个细胞色素P450(CYP)基因和2个氧代戊二酸/ Fe(II)-依赖性双加氧酶(2-ODD)基因. 下一步作者利用代谢组及转基因的方法进行基因的验证.用含有罗汉松树脂酚((-)-matairesinol)培养基培养烟草离体叶片,将上文中预测到的基因分别与CYP719A23转到烟草叶片中.利用LC-MS方法检测转入以上基因1d后叶片,发现只有转入OMT3基因的叶片中pluviatolide被大量消耗,说明OMT3控制合成pluviatolide的下一个产物,经解谱分析,产物为(-)-5’-desmethoxy-yatein.将剩余的候选基因分别与CYP719A23和OMT3转入到含有罗汉松树脂酚((-)-matairesinol)培养基培养烟草离体叶片,经LC-MS检测并未发现(-)-5’-desmethoxy-yatein的消耗.作者前期的实验发现,损伤桃儿七叶片后鬼臼毒素的含量急剧升高,利用LC-MS检测发现鬼臼毒素及其前体物质在12,24h含量达到最高.利用RT-PCR验证发现与鬼臼毒素合成相关的前期5个基因表达量在9h达到最高(图2).图2 物理损伤后已知鬼臼毒素合成基因RT-PCR结果根据已知的结果,作者对受伤的桃儿七叶片进行转录组测序,处理时间为受伤后0,3,9,12h,每个处理三个重复,共12个样品.对转录组数据进行分析,根据推测鬼臼毒素合成需要用到的酶有四种,分别为O-甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT),细胞色素P450(cytochromes P450,CYP),2-氧化戊二酸/Fe(II)依赖的双加氧酶(2-oxoglutarate/Fe(II)-dependent dioxygenase,2-ODD),以及多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO),通过寻找与这四种酶家族同源的基因找到,336个,对这336个基因进行层次聚类分析得到91个表达模式相同的基因,对91个基因进行表达量分析,找到22个高表达基因,这22个基因中包含有7个具有已知酶功能的基因,其中一个基因为OMT3(图3).图3 22个高表达基因的聚类图标黑的为已知鬼臼毒素合成基因,红色为筛选的7条候选基因下一步作者的工作是对这6条候选基因进行验证如图4所示.6个候选基因分别与CYP719A23和OMT3转移到用含有(-)-matairesinol培养基培养4d后烟草叶片中去,1d后利用LC-MS方法检测鬼臼毒素合成相关代谢物含量.通过对含有6种候选基因叶片的LC-MS比较分析,发现在含有CYP71CU1基因的Phex524样品中观察到(-)-5’-desmethoxy-yatein(5’去甲氧基亚太因)含量的变化,并通过质谱鉴定发现了一个高含量的物质,为(-)-5’-desmethyl-yatein(5’去甲基亚太因).为了完成(-)-yatein(合成鬼臼毒素的中间产物)的合成通路,将剩余的5个基因与CYP719A23,OMT3,和CYP71CU1,分别转移到含有(-)-matairesinol培养基培养烟草叶片中去.对这些叶片进行LC-MS分析,结果发现含有OMT1基因的叶片未检测到(-)-5’-desmethoxy-yatein(5’去甲氧基亚太因),但是检测到了(-)-yatein(亚太因)的高表达,说明OMT1基因诱导(-)-5’-desmethyl-yatein(5’去甲基亚太因)产生(-)-yatein(亚太因).在yatein(亚太因)到deoxy-podophyllotoxin(脱氧鬼臼毒素)的合成路径中,涉及到了芳基四氢萘骨架中的中心六元环闭合和氧化修饰.在上一步的试验中,检测到了含有2-ODD的样品中的(-)-5’-desmethoxy-yatein(5’去甲氧基亚太因)大量消耗,对应产生了5’-desmethoxy-deoxy-podophyllotoxin(5’去甲基脱氧鬼臼毒素).我们假设反应机制涉及通过羟基化,随后脱水和碳-碳键形成活化7’碳,通过醌甲基化物中间体形成.因此假设2-ODD可以将yatein(亚太因)合成到(-)-deoxy-podophyllotoxin(脱氧鬼臼毒素).于是作者将2-ODD,CYP719A23,OMT3,CYP71CU1和OMT1一起转移到烟草叶片中,经过LC-MS检测发现叶片中yatein(亚太因)被大量消耗而(-)-deoxy-podophyllotoxin(脱氧鬼臼毒素)含量增加,因此可以确定2-ODD基因可以促进生成(–)-deoxy-podophyllotoxin.为了验证(-)-deoxy-podophyllotoxin(脱氧鬼臼毒素)到podophyllotoxin(鬼臼毒素)生物合成通路,将公共数据库里6个CYP候选基因分别于其他几个已经确定的基因转移到烟草叶片中,经过LC-MS分析发现,6种类型的叶片均未发现podophyllotoxin(鬼臼毒素)合成,但是意外的是作者发现转移CYP71BE54基因的叶片(-)-deoxy-podophyllotoxin(脱氧鬼臼毒素)被大量消耗,而检测到大量的(-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin(4’去甲基脱氧鬼臼毒素).在筛选其他的基因是发现CYP82D61能够使得(-)-4’-desmethyl-deoxy-podophyllotoxin(去甲基脱氧鬼臼毒素)大量消耗,得到(–)-desmethyl-epipodophyllotoxin(去甲基表鬼臼毒素).虽然没有产生podophyllotoxin(鬼臼毒素)但是产生了podophyllotoxin(鬼臼毒素)的差异构象体(表鬼臼毒素).而表鬼臼毒素与抗癌药物依托泊甙结构更相近,仅需一步化学修饰就可以合成依托泊甙.图4 转入相应基因后matairesinol培养基内烟草叶片中鬼臼毒素中间代谢物的含量为了验证整个结果的准确性,作者将10个基因一起转入到含有(+)-pimoresinol的培养基内培养,并利用LC-MS检测鬼臼毒素合成通路代谢物含量,结果中发现了(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin(4’去甲氧基表鬼臼毒素),而其他对照试验,只转入10个基因,或转入GFP+(+)-pimoresinol的均为检测到(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin(4’去甲氧基表鬼臼毒素)的生成如图5.图5 B 不同条件处理下的烟草叶片LC-MC提取离子流图(箭头代表(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin糖苷配基)C 不同处理条件下检测到的(–)-4′-desmethylepipodophyllotoxin含量最终,作者完成了鬼臼毒素完整的合成通路,并且实现了体外烟草中鬼臼毒素的合成. 创新:利用转录组与代谢组结合的方式,对基因组较大的中药植物进行机理研究,为无基因组的非模式植物提供了一个崭新的研究思路.完成了鬼臼毒素的完整的合成通路,本身就是一个很大的创新,并将鬼臼毒素的合成通路在烟草中表达出来,实现了鬼臼毒素脱离桃儿七的体外生产,为鬼臼毒素的工厂批量化生产提供了技术支持.文章延伸:1.代谢组是基因组与表型组的中间桥梁.代谢物的种类和数量在不同品种与组织中存在很大差异,利用这些差异进行遗传基础的解析将有助于我们深入了解代谢生物学过程.代谢组作为表型指导基因组及转录组的分析,分析结果更直观,明晰.2.对于中药等表型性状无法检测到的性状,利用转录组与代谢组结合的方法,指导差异基因的分析,寻找代谢通路.3.广泛靶向代谢组(Widely-targeted metabolome)——创新的高通量代谢组检测技术.生物体需要产生结构多样、功能特异的代谢物以抵御外界多变的环境,其中植物中代谢物多大100多万种.因此,一种高通量的代谢物检测技术成为研究代谢组的必备利器.迈维代谢创新了广靶技术,可以高通量、高灵敏、广覆盖检测不同材料中的代谢物.。
不同地区桃儿七的几种有效成分对比分析
不同地区桃儿七的几种有效成分对比分析张高翔;金涛;王利【摘要】[目的]通过不同地区野生桃儿七3种有效成分的对比分析,筛选出适合开发利用的野生桃儿七品种.[方法]通过HPLC法、分光光度法分别对鬼臼毒素、粗多糖、总黄酮进行定性定量测定.[结果]甘肃采集的野生桃儿七总黄酮含量最高,为2.50％,西藏加查县采集的野生桃儿七的鬼臼毒素含量最高,为36.02 g/kg,四川采集的野生桃儿七的粗多糖含量最高,为15.83 g/100g.[结论]西藏加查县采集的野生桃儿七的鬼臼毒素含量最高,具有较高的药用价值,可以进行开发利用.【期刊名称】《西藏农业科技》【年(卷),期】2018(000)002【总页数】2页(P35-36)【关键词】桃儿七;鬼臼毒素;开发利用【作者】张高翔;金涛;王利【作者单位】西藏职业技术学院农业科学技术学院,西藏拉萨 850000;西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所,西藏拉萨 850000;西藏职业技术学院农业科学技术学院,西藏拉萨 850000【正文语种】中文【中图分类】S567.19桃儿七(Sinopodophullum hexandrum)，小蘖科桃儿七属，多年生草本，稀有种。
通常生于海拔高的平坦山谷及透光度好的林下、林缘或草灌丛中，海拔下限 2700 m，上限4300 m[1]。
桃儿七的根茎与果实均有较高的药用价值。
其根和根茎中含有大量的具有抗癌活性的木脂素类物质,其中鬼臼(podophyllotoxin)抗癌活性最高,是世界卫生组织推荐的治疗性病尖锐湿疣首选药物和合成各种抗癌药物的前体。
由于根状茎与果实入药，而被任意采挖。
桃儿七天然繁殖能力较弱，随着植被的破坏而导致其生境的改变，植株日益稀少，分布区日渐缩减，已被列入《中国珍稀濒危植物名录》,并被《中国植物红皮书》收录[2-3]。
目前鲜有对西藏地区桃儿七有效成分的深入研究。
在西藏加查县发现了大量的野生桃儿七种群，本文对所收集到的6个地区(西藏加查、云南、四川、甘肃、陕西、西藏林芝)的野生桃儿七根茎中的3种成分(鬼臼毒素、总黄酮、粗多糖)进行了定性定量分析，旨在找出有效活性比较高的地区野生种，为桃儿七人工栽培，更好的保护和开发桃儿七资源具有重要的现实意义。