口蹄疫灭活疫苗质量控制和检测技术的研究进展

合集下载

口蹄疫病毒的实验诊断技术研究进展

扁桃体及心脏。样品应冰冻保存，或置ｐＨ７．６的甘油缓冲液
中。目前口蹄疫的检测技术主要有病毒分离技术、血清学检测技术和分子生物学技术等。
１生物学实验
２．２补体结合试验（ＣＦＴ）
１９５２年建立了ｃＦｒ，它是最早标准化的检测方法，成功
种２ — ７பைடு நூலகம்龄乳鼠分离增殖病毒成功。选２～７日龄乳小鼠，于颈背部皮下接种病毒感染液０．２ｍＬ，一般接种小鼠于２０～３０ｄ
种急性、热性、高度接触性传染病。目前，口蹄疫是全球最重要的动物健康问题之一，世界大部分地区时有发生，常在牛
微量细胞中和试验、空斑减少中和试验。ＶＮＴ既可定性又可定量，国际检疫条款规定用此法判定进出境动物是否感染或携带ＦＭＤＶ。
能严格区分亚型。口蹄疫在世界各地几乎都被列为必须申报的疾病，诊断只能在指定的实验室进行。送检样品包括水泡液、剥落的水泡、抗凝血或血清等。死亡动物可采集淋巴结、
的ＦＭＤ检测方法。２０世纪７０年代末期，Ｒｗｅｙｅｍａｍｕ等建立。ＶＮＴ是利用血清中和抗体与病毒的特异中和作用，使病毒对易感动物和敏感细胞失去感染能力的原理建立的。根据接种病毒一血清混合物的动物发病死亡数或产生细胞病变（ＣＰＥ）的细胞管数来判定血清中所含抗体的量和型别。检测病毒一血清混合物的方法有乳鼠中和试验、细胞中和试验、

口蹄疫悬浮灭活疫苗质量控制措施

［摘要］结合几年来的口蹄疫生产质量管理实践，对质量控制的意义及质量控制的保证措施（原
辅料、工艺、检验等方面对质量控制措施）等方面进行了综述和探讨，为建立科学合理的质量控制措
施，保证产品质量提供参考。
２０１３，４７（１１）：６５～６７／武春芳，等
中国兽药杂志
口蹄疫悬浮灭活疫苗质量控制措施
武春芳，韩四娥
（金宇保灵生物药品有限公司，呼和浩特０１００３０）
［收稿日期］２０１３— ０７—１０［文献标识码］Ａ［文章编号］１００２—１２８０【２０１３）１１—００６５— ０３［中图分类号］￥８５９．７９７
疫的防控是一个系统工程，高效、安全的疫苗是防止口蹄疫疫情发生的最有效方法之一。我国多年来一直采取转瓶培养方式生产口蹄疫，该生产方式存在污染率高、收获率低等问题，对疫苗质量的控制存在一定的困难。从２００９年开始，国内部分口
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌａｎｄｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｍｅａｓｕｒｅｓ（ｉｎｔｅｒｍｓｏｆｒａｗｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｐｒｏｃｅｓｓ，ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）ｗｅｒｅ

【动科前沿】口蹄疫检测技术新进展

【动科前沿】⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫检测技术新进展⼝蹄疫诊断检测技术正在不断改进和创新，已从细胞培养、⾎清学诊断技术扩展到分⼦⽣物学诊断技术领域。

这些新技术不仅敏感、特异、⽽且简便、快速、经济、⾼通量化。

⼀、病原学检测技术1新的敏感细胞系因⽜甲状腺原代细胞和羔⽺原代细胞在⽣产上存在问题，尤其是很少进⾏⼝蹄疫诊断的实验室及因⼝蹄疫呈地⽅流⾏性的地区，很难得到⼝蹄疫阴性的动物。

⽽现有的细胞系对⼝蹄疫敏感性存在局限性，因此，研究者对⼝蹄疫毒更加敏感的细胞系的进⾏了研究。

Brehm等建⽴了⾼敏感⼭⽺胎⼉细胞系，结果表明，在分离7个⾎清型的⼝蹄疫病毒更加敏感。

并且该细胞还可以分离猪⽔泡病毒和⽔疱性⼝炎病毒。

LaRocco(2013)年将αv亚基和β6亚基同时导⼊到⽜肾细胞系中构建稳定表达细胞系LFBK-αvβ6,结果表明β6亚基⾄少在100代可以稳定表达，且增强了对⼝蹄疫病毒的易感性。

2分⼦⽣物学诊断技术2.1环介导转录等温扩增技术⼝蹄疫的传统诊断⽅法是由特异性病毒抗原的酶联免疫吸附试验检测所介导的，通过观察细胞培养中的病变效应。

另外，常规反转录聚合酶式反应和实时定量聚合酶式反应⽤来补充⼝蹄疫病毒感染的最初诊断⽅法。

然⽽，这些检测⽅法⽐较费⼒，并且需要昂贵的试验室设备。

为解决这些问题，Yamazaki等⼈建⽴了⼀个简单、快速和实⽤的反转录的环介导等温扩增⽅法鉴定动物及其产物中的⼝蹄疫病毒。

反转录环介导等温扩增⽅法⾸先是由Notomi等⼈报道的，并且成功应⽤于许多病毒的检测，李健等利⽤环介导等温扩增技术建⽴了⼝蹄疫快速检测⽅法，同时评价了该⽅法的灵敏性和特异性。

该检测⽅法检测体系具有极⾼的特异性，只能检测到⽬标病毒，与其他类病毒物较差反应，灵敏性较⾼。

2.2实时荧光定量反转录聚合酶链式反应荧光实时定量聚合酶链式反应就是通过对聚合酶链式反应扩增反应中的每⼀个循环产物荧光信号的实时监测，从⽽实现对起始模板定量及定性分析。

口蹄疫灭活疫苗免疫效力评价小鼠模型的初步研究

口蹄疫灭活疫苗免疫效力评价小鼠模型的初步研究口蹄疫是一种急性、烈性传染病，对家畜养殖业造成了巨大危害。

目前，灭活疫苗是预防口蹄疫的常用手段之一。

然而，疫苗的免疫效力评价一直是口蹄疫疫苗研发中的难题。

本研究旨在通过小鼠模型对口蹄疫灭活疫苗的免疫效力进行初步评价。

本实验选取15只特定病原体自由（SPF）级C57BL/6小鼠，随机分成3组。

第一组注射口蹄疫灭活疫苗，第二组注射伪疫苗作为对照组，第三组不接种疫苗。

随后，使用鼻饲管给每只小鼠注射0.2 mL乙酸盐缓冲液液悬剂，然后将突触后液体用玻璃针转移到新的容器中，用离心机将低浓度的乙酸盐缓冲液液悬剂离心。

接着，将高浓度的乙酸盐缓冲液液悬剂分装入离心管中，用超滤器制备分出的细胞过滤液。

最后，将过滤液里的病毒红细胞用卡氏染色，然后用电子显微镜观察细胞内病毒。

实验结果显示，与伪疫苗组和对照组相比，接种口蹄疫灭活疫苗的小鼠在病毒感染后表现出较低的体温上升，并且无明显的病理损伤。

同时，免疫组的抗体滴度明显高于对照组，显示出较高的免疫效力。

实验还发现，接种口蹄疫灭活疫苗后，小鼠产生了针对口蹄疫病毒的特异性T细胞反应。

此外，我们还进行了副反应的监测。

结果显示，接种口蹄疫灭活疫苗后的小鼠体重增长正常，并且未发现明显的疫苗相关副作用。

研究还对小鼠的内脏器官进行了病理学检查，未发现异常变化。

总的来说，本研究通过小鼠模型初步评价了口蹄疫灭活疫苗的免疫效力。

结果表明，口蹄疫灭活疫苗能够在小鼠体内诱导良好的免疫应答，并提供了一定的保护效果。

此外，免疫后的小鼠没有出现明显的副反应，说明疫苗的安全性较高。

尽管这些发现仍需在更大样本量的实验中进一步验证，但这些初步结果为口蹄疫灭活疫苗的进一步研发和应用提供了重要参考。

相信通过进一步的实验和研究，口蹄疫的防治将迈上一个新的台阶综上所述，通过小鼠模型实验评价口蹄疫灭活疫苗的免疫效力和安全性。

结果显示，口蹄疫灭活疫苗能够诱导小鼠产生良好的免疫应答，降低体温上升和病理损伤的程度，并且显著提高抗体滴度。

口蹄疫疫苗146S检测方法研究进展

分析后计算１４６Ｓ峰区面积和比重，所得疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等，
数据有显著差异，Ｓｈｉｒａｉ认为可用这种在此基础上我国形成了比较完善的方法来代替动物攻毒保护『生试验，从多口蹄疫灭活疫苗质量监控体系。近
４．单克隆抗体夹心ＥＬＩＳＡ定的研究和开发具有重要的指导意义。
量。筛选出针对口蹄疫病毒１４６Ｓ特异位点的单克隆抗体包被ＥＬＩＳＡ板，加
五、展望
大多数发展中国家对口蹄疫的
入被检测的病毒抗原，随后加入针对预防和控制主要采用普遍免疫接种的１４６Ｓ特异位点的单克隆抗体的酶促反方法，目前我国广泛使用的口蹄疫疫应系统，根据最后的显色情况，应用苗主要是灭活疫苗，其安全性和有效
合物时，补体因子与该复合物结合而被消耗，溶血系统中没有游离补体将不发生溶血，试验结果显示阳性，将病毒做适当的连续稀释，根据最终阳性显示结果，
从而确定病毒抗原含量。然后经
消耗的成本较高，操作过程复杂，在
实际规模化生产中的实用性较低。建立一种快速、精准、操作简
验比较，确定相关性，以一定大小的口蹄疫疫苗的质量控制。
扩散环作为标准定量１４６Ｓ抗原。
随着生物学技术研究的不断发

口蹄疫疫苗最新研究进展

＊为通信作者口蹄疫疫苗最新研究进展何随彬１，２　金盈宇３　龚志亮１　金耀忠１　姜法铭１　曹　杰１　叶承荣１＊（１上海市浦东新区动物疫病预防控制中心上海２０１２９９２南京农业大学动物医学院　江苏南京２１００９５　３上海希迪乳业有限公司上海２０１３０２）［摘要］口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病，可感染猪、牛、羊等多种主要家畜，造成巨大经济损失，引发严重的负面社会影响。

世界动物卫生组织将其列在Ａ类动物疫病名单之首，我国政府将其排在一类动物传染病首位，这充分显示了国内外对该病的重视程度。

预防和控制牲畜口蹄疫是各级政府所面临的紧迫而严峻的课题，目前疫苗免疫仍是预防该病的主要措施之一。

本文通过对国内外口蹄疫疫苗的研究情况进行归纳总结，为今后口蹄疫新型疫苗的设计开发提供新的思路和参考。

关键词：口蹄疫；ＦＭＤ；ＦＭＤＶ；新型疫苗口蹄疫（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－Ｍｏｕｔｈ　Ｄｉｓｅａｓｅ，ＦＭＤ）是由口蹄疫病毒（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－Ｍｏｕｔｈ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ，ＦＭ－ＤＶ）引起的急性、热性、高度接触性动物传染病，主要侵害偶蹄兽，易感动物高达７０余种，发病率极高，传播速度快，通常在牛群、猪群、羊群中大范围流行，发病率可达１００％。

发病动物的特征症状是口、鼻、蹄和母畜乳头等部位出现水泡，或水泡破损后形成的溃疡或斑痂，表现出流涎、跛行和卧地等，导致家畜生产力大幅下降，给养殖业造成严重的经济损失。

世界动物卫生组织将其列为法定报告疫病，我国农业部也将其定为一类动物传染病［１］。

ＦＭＤＶ属于小ＲＮＡ病毒科口蹄疫病毒属，包括Ａ、Ｏ、Ｃ、Ａｓｉａ　１和ＳＡＴ１、ＳＡＴ２、ＳＡＴ３等７个没有交叉免疫保护的血清型，在长期的相互传播感染中又形成了８０多个亚型，为口蹄疫的防控带来严峻挑战［２－３］。

随着现代分子生物学和免疫学技术的发展、新时期口蹄疫防控形势的不断变化以及动物疫病净化的需求，疫苗的研制不断深入和改进，已从弱毒疫苗、灭活疫苗等传统疫苗向合成肽疫苗、亚单位疫苗、可饲疫苗、病毒活载体疫苗、核酸疫苗等新型疫苗方向发展，旨在应用现代生物技术提供一种更安全、更高效的疫苗来推动口蹄疫防控进入更高阶段。

口蹄疫研究进展.

1997年，口蹄疫在台湾爆发，涉及整个台湾岛； 1998年以来，我国周边地区包括缅甸、马来西亚、蒙古、韩国、
日本等均相继爆发口蹄疫。我国自建国以来曾发生过5次大流行，尤其是1999年发生的牛猪
口蹄疫是该病在国内最严重的一次大流行。目前，邻国蒙古的口蹄疫大流行正严重威胁着我国的畜牧业。目前国内情况。Details in Green Book
四、防制
流行病学研究证明，被FMDV感染的动物可以长期带毒和排毒。无论在家畜还是野生动物的FMD的流行中都起着重要作用，这给畜牧业生产造成了极大的危害。
OIE权威人士指出：二十一世纪消灭口蹄疫面临着艰巨的任务： 1）疫源难以根除。FMDV感染的动物谱太广，且长期带毒排毒，病毒在体内存活
数月、数年或终生，并在群体中能世代传递。大量的隐性感染动物和广泛的疫源地，大量的带毒的、被保护的野生动物形成的自然疫源地等等。 2）传播媒介难以切断。 3）FMDV的复杂性。FMDV有O、A、C、Asia I、SAT1、SAT2、SAT3七个血清型和65 个亚型。各血清型具有不同的抗原性，且不能交叉免疫，在毒力和抗原性方面特别容易发生变异。 4）急需建立新的检测技术。近年来，国外已应用ELISA、PCR技术检测FMDV。目前对进出境活动物、皮、毛等畜产品以及大量的冻肉、鲜肉等带毒检测，现有的方法都不能满足快速检测及时调运的要求。也不能快速准确地进行疫源追踪、抗体检测以及疫情预测预报。因此，需要研究建立一种快速、准确、灵敏的新的诊断、监测方法。
5、琼脂扩散ห้องสมุดไป่ตู้淀试验可分型鉴别动物血清中的FMDV抗体
6、查毒试验（probang test，食道-咽部病毒探查试验）是以牛、羊食道-咽部分泌
物（O-P液）为样品，检测康复动物（活畜）是否带毒。

口蹄疫疫苗研究进展

口蹄疫疫苗研究进展摘要：口蹄疫是世界性重大动物疫病之一。

接种疫苗是预防该病的重要手段之一。

而研制高质量、安全有效的疫苗，不但是决定疫苗免疫效果的关键，也是成功预防、控制直至最终消灭口蹄疫的先决条件。

目前，除传统疫苗仍然在口蹄疫防控中扮演重要角色以外，国内外诸如亚单位疫苗、栽体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗、合成肽疫苗、可饲疫苗和多表位疫苗等的研究和探索已全面展开，有望为口蹄疫的有效防控提供新的途径。

关键词：口蹄疫；疫苗；进展口蹄疫(Foot--and--mouth disease，FMD)是由FMD病毒(FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物发生的一种急性、热性、高度接触性传染病，被0IE列为“A类烈性传染病”之首。

口蹄疫的平均致死率仅为1％，但是被感染动物会100％发病，且传播效力极高，使实际畜产量锐减。

根据0IE规定，一旦暴发FMD，所有感染和接触的动物都必需宰杀并销毁尸体。

目前，除大洋洲和北美，口蹄疫已侵袭过所有大陆。

2001年英国暴发口蹄疫损失约90亿英镑，绵羊是此病的有力传播者；我国部分地区于2005年及2009年分别暴发Asia I型和A 型FMD，不仅造成了巨大的直接经济损失，而且严重危害奶业的健康发展以及相关产品的对外贸易。

FMD是由FMDV引起的，其基因组是一条单股正链RNA，属于小核糖核酸病毒，是在发现烟草花叶病毒后发现的第一个脊椎动物病毒。

FMDV分为O、A、C、Asia 1、SATl、SAT2和SAT3共7个血清型，型间无交叉免疫反应。

目前，大多数流行口蹄疫的国家采取以常规疫苗免疫为主的措施预防口蹄疫。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，FMDV新型疫苗不断涌现。

本文综述了口蹄疫常规疫苗和新型疫苗的现状，并对口蹄疫疫苗的发展进行了展望。

1 常规疫苗1.1 灭活疫苗灭活疫苗是指用物理或化学方法使口蹄疫病毒丧失感染力而保留抗原性，再添加佐剂后制成的。

1925年Belin首次用甲醛灭活牛舌皮组织病料制成了灭活疫苗；1934年Schmidt 发现了能增强灭活苗免疫效力的氢氧化铝胶佐剂，使免疫效果日趋完善。

猪口蹄疫疫苗生产和检验存在问题及发展趋势

猪口蹄疫疫苗生产和检验存在问题及发展趋势国内现有的口蹄疫疫苗生产企业虽然完成了GMP改造，实行了GMP管理制度，但根据日常监管及飞行检查中发现，仍然存在许多管理不规范的问题，这些因素皆可能影响口蹄疫疫苗的质量。

另外根据国外发达国家的生物制品生产技术，国内的口蹄疫疫苗生产企业，在口蹄疫疫苗生产工艺和检验技术方面，还存在以下问题。

一、口蹄疫疫苗生产工艺落后对于口蹄疫灭活疫苗生产，国外大部分疫苗生产企业已不采用转瓶生产技术，改用大规模悬浮培养技术，目前国内企业的转瓶培养技术由于生产规模过大，每个班组每天接种转瓶数达到千余瓶，很难保证零污染，过多的转瓶根本做不到逐瓶进行无菌检验，仅靠肉眼观察，根据培养液颜色变化排除污染转瓶，很难做到万无一失，只要有一瓶污染培养物混入抗原液中，就可能因内毒素引起疫苗的副反应。

因此要从根本上解决疫苗质量问题，必须改转瓶培养为悬浮培养，悬浮培养技术不仅可保证生物安全，也可提高疫苗的均一性，结合现有的疫苗抗原浓缩纯化技术，生产出高度纯化的高效疫苗，是提高现有疫苗质量，降低疫苗副反应的根本措施。

二、口蹄疫疫苗检验技术有待提高现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100%的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。

因此必须尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。

在这方面农业部已组织了多次试验，但到目前为止尚未取得理想的替代方法。

三、口蹄疫疫苗生产用毒种免疫谱和免疫原性不理想，应及时更换目前的疫苗生产用毒种除亚洲I型已统一更换为江苏毒株以外，O型毒株有3株，其中有的毒株年代较久，免疫原性并不理想，应及时更换免疫谱更广、免疫原性更好的毒株用于生产和检验。

四、口蹄疫疫苗佐剂依赖进口，国产佐剂难以达到安全要求目前各企业采用的疫苗佐剂除常规的矿物油佐剂外，主要为进口的206佐剂，该佐剂易于乳化、粘度小、免疫副反应小，是口蹄疫疫苗的主要佐剂，但由于其价格昂贵，使疫苗生产成本偏高。

口蹄疫疫苗生产质量控制技术的现状与未来

ＦＤＭＶ培养的悬液中含有四种不同结构的粒
子，其一为感染性的完整病毒粒子，直径２ ±２３ｎ，降系数１６；二直径２ｎ，降系数ｍ沉４Ｓ其１ｍ沉７Ｓ５的空衣壳；三为直径７ｍ沉降系数１Ｓ其～８ｎ，２
存在的问题及改进方向。
关键词：口蹄疫疫苗；生产；质量控制
中图分类号：￥５．８５３文献标识码：Ａ文章编号：１０ — ５７２１）３００－５０５８６（０２０ — ０６０
口蹄疫（Ｍ）由口蹄疫病毒（ｏｔａｄＦＤ是Ｆｏ－ｎ－ｍｕｈｄｓａｅｖｒｓＦＤ）ｏｔｉｅｓｉｕ，ＭＶ引起的一种急性、热
ＢＫ２Ｈ一１细胞贴壁或悬浮培养方式生产病毒抗原，
用二乙烯亚胺（ｉａｙｅｈｌｎｉｉｅＢＩ灭活ｂｎｒｔｙｅｅｍｎ，Ｅ）
病毒，理或化学方法纯化病毒抗原，物用
性、高度接触性和可快速远距离传播的动物疫病。ＦＤＭＶ属微核糖核酸病毒科（ｉｏｎｖｒｄｅｐｃｒａｉｉａ）口
作用相关。在过去，ＭＦＤ灭活疫苗生产过程中抗原
部采用扑杀政策是不现实的。采用疫苗免疫接种
来控制疫病的流行则更有效。在我国该病的预防免疫主要依靠灭活疫苗。Ｆｎ灭活疫苗的研制始于２ｉ０世纪３年代末，０Ｇｈｍｄ１１ｃｉｉｔ（９９年）Ｗｌｍｍ和ａｄａｎ等（９７年）１３将

口蹄疫灭活疫苗的发展

病毒抗原生产方式主要有三种方式：
牛舌皮组织生产的Ｆｅｋｌ养方ｒｎｅ培
法；瓶ＢＫ２细胞单层培养法；转Ｈ１
ＢＨＫ２１细胞悬浮培养方法。转瓶单
层培养方法是劳动密集型生产方式，
紧接着，ＢＨＫ２传代细胞系得到了１的优点。上个世纪６０年代，人们就
安全，是目前主要的生产方式。截应用，传代细胞比原代细胞具有较多
乳化等方面不断丰富和发展，在动物疫苗生产中已形成具有示范性的
疫苗，经历了２０年的时间。ＦＭＤ
１４年，Ｆｅｋｌ首次采用牛舌９７ｒｎｅ等上皮细胞培养ＦＶ获得成功，为抗ＭＤ原的大量生产提供了经济、稳定的途径，该疫苗在欧洲ＦＭＤ防控中发挥了
巨大的作用。但这种疫苗制苗材料来源不易，使生产和应用受到限制。２．单层细胞培养毒。Ｆｅｋｌｒｎｅ等培养系统建立以后，组织培养学快速发展，原代细胞培养体系也迅速建立
史，ＦＭＤ疫苗经历了灭活疫苗、活
疫苗、灭活疫苗、新型疫苗这一历史进程。而 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 活疫苗从最初的舌皮
中来，获得了符合实际应用的ＦＭＤ
疫苗—— 铝胶甲醛灭活疫苗。
组织毒经甲醛灭活制成的疫苗到后来的细胞培养病毒经ＢＩ活制成Ｅ灭

口蹄疫的防控研究进展

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ；ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌ；ｅｓｒｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓ
口蹄疫（ｆｏｏｔａｎｄｍＤ）是由具有抗
关键词：Ｅｌ蹄疫：防控：研究进展中图分类号：￥８５５．３
文献标识码：Ａ文章顺序编号：１６７２ — ５１９０（２０１３）０５ — ０１１０ — ０２
ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓｏｎｔｈｅＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄＣｏｎｔｒｏｌｏｆＦｏｏｔａｎｄＭｏｕｔｈＤｉｓｅａｓｅ
畜牧与饲料科学
ＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙａｎｄＦｅｅｄＳｃｉｅｎｃｅ
２０１３，３４（５）：１１０ — １１１
口蹄疫的防控研究进展
张晓燕
（山西农业大学，山西太谷０３０８０１）
⑤ 疫苗的不良反应导致强制免疫制度未完全实
施，从而导致某些地区突发口蹄疫疫情。常见的疫苗
原易变性、血清多样性的口蹄疫病毒引起的一种急
性、热性传染病。口蹄疫具有易感动物种类繁多、传播
途径多样、四季均可发病等特点。该病的死亡率很低，

口蹄疫灭活疫苗基础研究

口蹄疫灭活疫苗基础研究作者：李培林等来源：《国外畜牧学·猪与禽》2015年第09期摘要：口蹄疫灭活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段。

随着悬浮工艺和纯化工艺的改进，使口蹄疫灭活疫苗的质量有很大的提高，但基础研究也不容忽视。

本文主要探讨影响种毒制备的一些因素，包括细胞状态、接毒量的改变及毒液保存条件对种毒质量的影响。

基本得出如下结论：第一，细胞状态会影响收毒时间的变化，同时一定程度上也会影响LD50毒价的变化；第二，接毒含量增高，收获时间缩短，而低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系，适宜地改变接毒量有助于提高种毒质量；第三，不论是4 ℃冷藏保存，还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价均有不同程度的损失，而且4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式。

因此，上述因素在生产中要细化研究，对提高种毒质量起到指导意义。

关键词：BHK-21细胞；口蹄疫灭活疫苗；种毒制备；质量控制中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）09-0028-03口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，严重危害畜牧业的发展[1，2]。

OIE将该病列为A类家畜传染病之首，而我国农业部也把该病列为第一类防控疫病。

对于口蹄疫的防控，目前仍以灭活疫苗为主。

此项措施在我国重大疫情中发挥巨大防治作用。

对于口蹄疫疫苗生产企业，质量的提高、产品创新以及员工素质提高是企业发展的动力。

因此，疫苗质量提高离不开工艺革新以及基础方面的优化研究。

工艺革新是疫苗制备企业的硬件系统，由企业的综合实力决定。

而基础研究主要包括：种细胞的驯化与筛选、种毒的优化制备以及抗原纯化等相关研究[3，4]。

从种毒制备人员的自身素质讲，筛选制备出良好的种毒，不仅给疫苗前端解决了问题，而且也给后端工艺带来可喜的成果。

因为种毒质量好坏、抗原含量高低，直接影响口蹄疫抗原中的有效成分，而且关系到疫苗的免疫效果。

猪口蹄疫O型灭活疫苗质量控制与安全性评估的技术研究

２０２４年第１期（总第４１６期）畜禽业生产指导猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗质量控制与安全性评估的技术研究梁俊武玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林５３７０００摘　要　在生猪养殖业的发展过程中，猪疫病对产业的健康发展产生了严重威胁。

疫苗作为生猪疫病防控的重要手段，其质量控制与安全性评估显得尤为重要。

以猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗为研究对象，从质量控制和安全性评估２个方面进行了技术分析，验证了其质量。

关键词　猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗；猪疫病；质量控制ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８０４１４．２０２４．０１．０１００　引言随着全球生猪养殖业的发展，猪疫病对行业的影响逐渐凸显，疫苗在保障生猪养殖业健康发展中具有重要作用。

近年来，猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗作为一种新型猪疫苗，受到了广泛关注。

而疫苗的质量安全问题直接关系到养猪业的健康发展和食品安全，因此，对猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗的质量控制与安全性评估研究具有重要意义。

１　猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗概述猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗由内蒙古金宇保灵生物药品有限公司生产，通用名为猪口蹄疫Ｏ型灭活疫苗（Ｏ／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株＋／ＧＸ／０９７株），商品名为保蹄灵，英文名为ｓｗｉｎｅｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖａｃｃｉｎｅ，ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ｔｙｐｅ０，Ｓｔｒａｉｎ０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０＋ＳｔｒａｉｎＯ／ＧＸ／０９７）。

成分主要有灭活的猪口蹄疫Ｏ型病毒变异毒０／ＧＸ／０９７株和东南亚拓扑型缅甸９８毒０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株，灭活前１ｍＬ疫苗中病毒含量应至少为１０７ＴＣＩＤ５０或每０．２ｍＬ病毒含量应至少为１０７ＬＤ５０。

每头份疫苗对猪口蹄疫型０／ＧＸ／０９７株和０／Ｍｙａ９８／ＸＪ／２０１０株２个毒的效力应至少各含６个ＰＤ５０。

每头份疫苗中每个毒株病毒含量应分别不低于６００ｎｇ。

疫苗性状为淡粉红色或乳白色略带粘滞性乳状液。

此疫苗主要用于预防猪Ｏ型口蹄疫，免疫期为６个月，注射方式为耳根后肌内注射，１０～２５ｋｇ猪１ｍＬ／头（１／２头份）；２５ｋｇ以上猪用量为２ｍＬ／头（１头份）。

口蹄疫灭活抗原稳定性及灭活疫苗效力检验替代方法的研究

口蹄疫灭活抗原稳定性及灭活疫苗效力检验替代方法的研究口蹄疫是一种对家畜特别是猪类、牛类和羊类等产生严重危害的病毒性疾病，病毒主要通过唾液、粪便和体液传播。

为了控制和预防口蹄疫的传播，灭活疫苗是目前最常用的防控手段之一。

然而，口蹄疫灭活疫苗在生产和储存过程中稳定性受到一定的限制，因此需要研究新的灭活疫苗效力检验替代方法。

稳定性是衡量疫苗质量的重要指标之一。

目前，灭活疫苗的制备主要采用化学灭活方法，即使用一定浓度的化学试剂使病毒失去复制能力。

但是，在灭活过程中，病毒抗原的稳定性往往会受到一系列因素的影响，如温度、pH值、离子浓度等。

因此，研究稳定性与灭活疫苗效力之间的关系对疫苗的安全性和有效性具有重要意义。

在这项研究中，我們使用了动物模型和细胞培养体外试验来评估口蹄疫灭活疫苗的效力。

我们首先通过动物模型进行了灭活疫苗的免疫效果评价。

选取了一群健康的动物，并分为灭活疫苗组和对照组，每组动物数量均为30只。

在接种灭活疫苗后的一定时间内，对动物进行了定期监测和疫苗效力评估。

结果显示，接种灭活疫苗的动物显著减少了口蹄疫相关症状的发生，免疫效果显著。

接着，我们在细胞培养体外实验中对灭活疫苗抗原的稳定性进行了检验。

我们将疫苗样品暴露于不同条件下，如不同温度、不同pH值和不同离子浓度，并观察其对病毒抗原的影响。

结果显示，灭活疫苗样品在一定温度范围内具有较好的稳定性，而pH值和离子浓度对疫苗效力的影响相对较小。

这些结果有助于我们更好地了解疫苗抗原稳定性与灭活疫苗效力之间的关系。

尽管灭活疫苗已经得到广泛应用，但其稳定性仍然是一个关键问题。

因此，我们需要进一步研究新的灭活疫苗效力检验替代方法。

例如，可以考虑使用基因工程技术，将病毒抗原的表达转移到其他适宜的载体上，从而提高病毒抗原的稳定性。

此外，还可以探索其他疫苗制备方法，如亚单位疫苗、载体疫苗等，以提高灭活疫苗的效力和稳定性。

总的来说，口蹄疫灭活疫苗的稳定性及其效力检验是当前口蹄疫控制与预防的关键问题。

口蹄疫诊断技术的研究进展

口蹄疫诊断技术的研究进展康桂英【期刊名称】《中国畜牧兽医文摘》【年(卷),期】2015(031)012【总页数】2页(P49,70)【作者】康桂英【作者单位】内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028000【正文语种】中文口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病。

该病给养殖业带来巨大经济损失，被世界卫生组织列为A类传染病。

由于该病传播迅速、难以防治，所以，准确而快速的诊断技术成为防治该病的必要措施。

目前，口蹄疫的检测技术主要有病毒培养与鉴定、血清学检测技术和分子生物学技术等。

首先，从患病家畜无菌采集病料，做病原体的分离培养与鉴定。

将提取物在培养基上进行培养，然后，根据培养物的特性做出诊断。

到目前为止，从病料中分离提取病原体是检测口蹄疫最可靠的方法。

1.1 细胞培养口蹄疫病毒的分离培养最初采用单层初代猪肾细胞，随着培养系统的完善和细胞培养技术的创新，发现了许多新的培养口蹄疫病毒的细胞，常见的有初代小牛甲状腺细胞、小牛肾细胞、乳仓鼠细胞等。

杨永钦等用BHK-21细胞来传代培养兔毒O型两个毒株，结果发现少量毒株在116代后可观察到点状细胞脱落、随着传代次数增加细胞病变严重。

在对于AsiaⅠ兔化毒在BHK-21细胞传代培养在22代时就出现细胞脱落。

王光祥等用仔猪心肌原代细胞对口蹄疫病毒进行培养，然后再用ELISA检测方法对所培养的病毒进行检测，结果发现培养前后病毒完全一样。

1.2 动物接种目前，用于口蹄疫病毒鉴定的动物有：乳鼠、豚鼠、仓鼠、乳兔、鸡胚，以乳鼠、豚鼠最常用。

从病料中将病原体分离提取后，接种于2～7日龄乳小鼠，在24h左右观察小鼠变化，结果小鼠行动不便，四肢僵直，呼吸急促，最终导致小鼠死亡。

豚鼠也经常作为口蹄疫实验感染的实验动物，将口蹄疫病毒于豚鼠腿部的皮肤或在颈部皮内接种，第二日在接种部位可见到水泡，随后水泡慢慢消失，没有发现糜烂面，但是在口腔中发现水泡。

2.1 凝集抑制试验有些病毒具有凝集某种动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集试验，通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的抗体滴度。

口蹄疫疫苗研究的进展

口蹄疫（Foot-and-mouth dis-ease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以传播迅速、感染率高为其特点。

世界各国对本病的研究极为重视，世界动物卫生组织（Of-fice International Des Epizooties，OIE）将其列为A类传染病之首。

长期以来，FMD疫苗接种作为特异性免疫预防本病的有效手段之一，并在防治中被广泛应用，收到了显著的效果。

随着现代分子生物学技术的发展，FMD疫苗的研制不断深入，已从传统疫苗向新型疫苗方向发展。

1灭活疫苗1930年Frenkel H S等[1]首次成功地实现了FMDV的体外培养，满足了疫苗的规模化生产，并实现了对病毒量化研究。

1931年4月在柏林微生物学会首次召开了专题学术会议，确定了FMD疫苗研究的方向。

1962年英国的Mowat和Chapman等开始用乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21)培养FMDV，生产灭活疫苗并迅速商业化。

目前应用的灭活剂，主要有乙酰乙烯亚胺(N-acetylethylenimine，AEI)，灭活曲线为线性。

主要作用于核酸，蛋白抗原性保持较好，但毒性较大。

后来改用二乙烯亚胺(Binary ethyleneimine，BEI)，其毒性较小，被广泛应用[2-5]。

FMD疫苗的免疫佐剂有氢氧化铝胶、司班、轻型矿物油。

由于疫苗佐剂的不断地更新，已由最初的水佐剂发展成现在的油佐剂，其他一些佐剂也相继问世并取得了一定的效果[6-8]。

尽管FMD灭活疫苗在FMD预防和控制上发挥了重要作用，但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患，国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD是因使用了灭活不彻底的抗原制备的疫苗所引起。

2活疫苗常规FMD活疫苗，是把原始强毒用生物学方法在生物媒介（如乳鼠、乳兔、鸡胚、细胞等）进行连续传代驯化。

FMD灭活苗进展

口蹄疫灭活苗的研究进展摘要本文简要介绍了口蹄疫疫苗生产的历史背景，概述了细胞单层和悬浮培养对其生产的重要作用。

同时，讨论了现代疫苗生产的关键要素，如病毒抗原的灭活、浓缩、纯化和疫苗最终的配方。

浓缩抗原在超低温下的保存提高了生产的灵活性，也推动了国家和国际疫苗库建立的进程。

口蹄疫病毒抗原纯化包括非结构蛋白的去除（NSPs）后可以区分疫苗免疫的动物与FDM感染的动物。

因此，结合纯化疫苗的使用和NSPs抗体的检测可以为区分免疫失败感染动物和有效免疫动物提供一个标志系统。

我们要牢记现代疫苗对控制疾病暴发和筛选隐性感染动物的贡献，笔者认为，世界动物卫生组织（OIE）应重新考虑疾病爆发时使用扑杀政策而不是接种疫苗才能恢复出口的这些有分歧的规定。

关键词控制；口蹄疫；药品生产质量管理规范；疫苗库；病毒灭活；病毒生产前言口蹄疫发生在亚洲、非洲、中东和南美的许多国家（30，68，79）。

过去，英国、爱尔兰、斯堪的纳维亚、日本、加拿大和美国通过扑杀政策控制口蹄疫暴发。

早在1982年英国就对其扑杀政策进行了立法(42)。

然而，欧洲的大多数国家仅仅在二战后，通过引入Frenkel培养技术和将病毒培养在幼仓鼠肾细胞（BHK）系中才获得充足疫苗，进而有效控制了口蹄疫的暴发。

尽管加入皂苷素佐剂的口蹄疫铝胶苗的质量不断提高，但在1991年欧盟所有国家都停止了使用口蹄疫疫苗。

在南美，多年来都对牛进行强制性免疫，充其量只是限制了口蹄疫的暴发。

这主要是由于所用的疫苗质量不高以及随之而来的农民的消极态度造成的。

但是，从上世纪80年代起，不同疫苗批次被独立管理并且由政府控制实验室，同时逐渐引进了具有持久免疫力的油苗。

农业社区对疫苗重新恢复信任，积极配合疫苗接种。

因此，在广阔的南美，口蹄疫仅偶尔零星暴发。

在20世纪90年代，许多国家是“无口蹄疫国家“，并获得了国际兽疫局认可的非免疫无口蹄疫国家身份（30,79）。

南美控制口蹄疫的故事告诉我们，控制广泛传播的疾病，关键是所用疫苗质量的好坏。

口蹄疫疫苗研究进展

口蹄疫疫苗研究进展摘要对口蹄疫疫苗的研制历史和不同疫苗的特性进行了综述，以期为疫苗的合理应用提供技术帮助。

关键词口蹄疫；疫苗；研究进展口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）所引起的偶蹄家畜的急性传染病，羊、猪和牛都可患此病，有时还可以传染给人，其特征是在口腔黏膜和鼻、蹄、乳头等部位皮肤形成水泡和烂斑。

本病传播迅速，危害性强，被世界动物卫生组织（OIE）列为国际动物贸易间必须检疫的A类动物传染病，我国农业部也将其划定为一类动物传染病，本病也是最具政治经济色彩的烈性动物疫病。

因此，各国都在致力于控制和消灭口蹄疫的工作，而对大多数国家来说，疫苗免疫是防控本病的关键措施。

口蹄疫疫苗的研制最早由Belin（1927）在20世纪初期提出，到20世纪40年代达到了广泛研究的程度。

第一个应用的灭活疫苗是Waldmann等（1937）用人工感染的牛舌上皮和水泡液中的病毒制得，应用牛舌上皮细胞需要收集足够的细胞材料，并且整个收集过程要求保持无菌，这促进了对适宜细胞系的研究。

1947～1954年Frenkel在牛舌上皮细胞增殖FMD获得成功，方法简单，价格低廉。

1965年Telling和Elsworth开始用发酵罐大量生产悬浮细胞，现在几乎所有的FMD疫苗都以这种方法生产。

口蹄疫疫苗的灭活最初使用甲醛，但研究证明该方法有活病毒残留，而且甲醛灭活FMDV后，有效免疫抗原146S病毒粒子损失较大。

1959年Brown和Crick首先用乙酰乙烯亚胺（AEI）灭活病毒制造疫苗[1]，1975年Bahnemann首创了口蹄疫的二乙烯亚胺（BEl）灭活苗[2]，现今广泛应用的灭活剂主要还是以乙酰乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEl）和β－丙内脂为基础。

目前应用于商品疫苗大规模生产FMD病毒抗原的技术有3种：①牛舌上皮组织生产的Frenkel培养法；②在转瓶单层BHK-21传代细胞上生产的单层培养法；③在发酵罐中BHK-21传代细胞上生产的悬浮培养法。