ELISA--sill
ELISA的基本原理
ELISA的基本原理[1]ELISA是指以酶作为标记物、以抗原和抗体之间免疫结合反应为基础的固相吸附测定方法。
因此，一个ELISA测定试剂，其有机组成部份包括：（1）包被的抗原或者抗体的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或者试管；（2）酶标记的抗体或者抗原和（3）酶的反应底物等。
抗原或者抗体的固相化，并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗体或者抗原亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。
整个测定中，抗原与抗体的结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断，以酶与其底物作用后的显色或者产生荧光或者发光反应为标准，显色或者产生荧光或者发光的强度，与临床标本中待测物的浓度成正比或者反比关系。
目前国内的ELISA试剂盒均以酶的显色反应来完成测定。
二、固相上抗原抗体相互作用的免疫化学[2,3]通常所提到的抗原与抗体的相互作用，普通指的是在液相状态下，而在固相状态下，抗原与抗体的结合反应有其相应的特点，主要表现在以下四个方面。
（一）固相上抗原与抗体结合反应所需要的时间较液相状态下长通常，固相免疫测定如ELISA中，抗原与抗体结合达到平衡所需要的时间，较液相免疫测定要长，并随液体所占体积与界面抗体或者抗原受体所占体积比的增加而增加。
当在微孔板孔内进行免疫测定时，界面反应动力学显示其对扩散作用有很强的依赖性，扩散性越强，则反应所需时间越短，结合越充分。
这一点可通过旋转振荡来达到，微孔的旋转振荡可促使液体进入到可与抗体或者抗原包被的界面接触的较小的区域内。
也可在微孔中放一个惰性的塞子以使反应液体成为一个小体积，或者使用一个具有大表面的多孔的基质如硝酸纤维素，或者使用微颗粒来做到这一点。
微颗粒小于1μm时，在测定时即成胶体悬液，而当颗粒或者珠较大时，则会在没有振荡时，由于重力的作用而分开。
所有上述方法均是通过减少液体所占体积与界面抗体或者抗原受体所占体积比，从而减少固相免疫测定的扩散依赖性。
（二）固相上抗原与抗体接触表面的反应体积远小于液相测定此处的反应体积并非是微孔中的液体体积，而是固相免疫测定中与固相包被的抗体或者抗原有接触的部份，这部份体积到底有多少，很难测定，但比反应管中总液体体积要少得多。
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型ELISA（酶联免疫吸附测定法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的基于抗原-抗体反应的实验方法。
它通过测量特定抗原或抗体的含量来检测身体内部特定物质的存在与否。
ELISA的原理基于体外特异性抗原-抗体的相互作用。
直接ELISA是最简单的类型。
首先，在表面上涂覆特定抗原，使其与固相的试剂反应。
然后，加入待测样品，如果样品中存在特定抗体，它们将结合到被固定的特定抗原上。
接下来，加入与特定抗体结合的酶标记抗体。
最后，通过添加底物，观察酶催化的氧化型底物在酶的作用下转换为可检测的产物颜色的变化。
间接ELISA是常见的ELISA类型。
在间接ELISA中，首先在表面上涂覆特定抗原，使其与固相试剂反应。
然后，加入待测样品，如果样品中存在特定抗体，它们将结合到被固定的特定抗原上。
接下来，加入与特定抗体结合的次级抗体，该次级抗体已与酶标记物结合。
最后，通过添加底物，观察酶催化的氧化型底物在酶的作用下转换为可检测的产物颜色的变化。
竞争ELISA（也称为间接竞争ELISA）是一种用于测定种属特异性抗体或多克隆抗体的方法。
在竞争ELISA中，首先在表面上涂覆特定抗原，使其与固相试剂反应。
然后，加入已知浓度的酶标记抗体和待测样品，并使它们在未饱和条件下与被固定的抗原竞争结合。
最后，通过添加底物，观察酶催化的氧化型底物在酶的作用下转换为可检测的产物颜色的变化。
总的来说，ELISA的原理是通过将被测物与特异性抗体结合，并利用酶标记的抗体与结合复合物发生化学反应来检测和定量测量特定物质的存在。
这种高灵敏度和特异性的实验方法在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用。
ELISA方法的基本原理和操作步骤
钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法
操作步骤如下： （1） 将特异性抗体与固相载体联结 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质
（2） 加受检标本 保温反应 标本中的抗原与固相抗体结合 形成固相抗原抗体复合物 洗涤除去其他未结合物质
（3） 加酶标抗体 保温反应 固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关
ELISA 方法的基本原理和操作步骤
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1971 年 Engvall 和 Perlmann 发 表 了 酶 联 免 疫 吸 附 剂 测 定 （enzyme linked immunosorbent assay ELISA）用于 IgG 定量测定的文章 使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中 微量物质的测定方法 这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 并保持其免疫活性 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体 这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性 又保留酶的活性 在测定时
是为阳性反应
（六）应用亲和素和生物素的 ELISA 亲和素是一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量 60kD 每个分子由 4 个亚基组成 可以和 4 个生物素分子亲密结合 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin） 生物素（biotin）又称维生素 H 分子量 244.31 存在于蛋黄中 用化学方法制成的衍生物 生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化 的产物 亲和素与生物素的结合 虽不属免疫反应 但特异性强 亲和力大 两者一经结合就极为稳定 由于 1 个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置
免疫检测的基础知识-ELISA
免疫检测的基础知识ELISA是一种免疫测定。
免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定标本的方法。
在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
1.1抗原抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。
抗原进入机体后，可刺激机体产生抗体和引起细胞免疫。
在免疫测定中，抗原是指能与抗体结合的物质。
能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、甲胎蛋白（AFP）等。
小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原（hapten）。
例如某些激素、药物等。
抗原的反应性取决于抗原决定簇（antigenic determinant），或称为表位（epitope）。
一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如中可带有等决定簇。
1.2抗体1.2.1抗体的结构抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。
Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD 和IgE。
与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。
Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。
Ig的轻链是相同的，有κ（kappa）和λ（Lambda）两种型别。
五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。
IgG和IgM的重链分别称为γ（gamma）链和μ（mu）链。
IgG的结构见图。
①木瓜酶裂解部位②胃蛋白酶裂解部位重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。
两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。
IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。
每个Fab都保存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。
另一区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。
ELISA操作流程
ELISA操作流程前处理1. 匀浆样本:取一定量（约100-150g）旳样本进行匀浆, 匀浆样本以无颗粒状为为佳。
样本匀浆好后来再运用称样勺搅拌样本, 以充足混合不一样个体旳样本, 到达均质旳效果。
2. 称量样本:运用0.01g当量旳电子天平称量对应旳样本重量, 误差尽量控制在±0.02g,以提高成果旳精确度。
样本直接称取到50ml离心管中。
称量旳样本应尽量称取匀浆效果比很好旳样品。
3. 加入提取液:在对应旳样本中加入对应旳提取溶剂, 溶剂旳体积在条件容许范围内尽量精确。
4. 提取或萃取:加入对应旳提取溶剂后来, 拧紧离心管盖, 运用涡旋仪充足振荡样品, 以样本与提取液充足混合为准。
详细时间可参照阐明书所提供旳措施时间规定。
5. 离心:把处理好旳样品对称放置在离心机中, 盖上离心机盖门, 直到听到离心机盖门关闭声音, 按“离心”键进行离心, 离心时间一般设为5min, 离心速度一般设为4500rpm/min。
假如样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6. 移取液体:运用加样枪移取对应旳旳溶剂液体至另一种容器中；假如需要吹干浓缩旳样品, 则移取到洁净干燥旳玻璃管中；假如是取下层进行分析旳样品则移取所有上层液体, 运用下层进行分析。
移取液体旳时候请注意防止移取到不有关旳液体层, 以免导致污染。
7. 浓缩吹干:先运用甲醇把氮吹仪旳针头进行润洗, 详细措施是先打开空气压缩机旳开头, 先通以少许气流, 把装有甲醇旳容量浸泡针头前端, 浸泡时间约1-2s即可。
润洗针头后, 把装有样品旳玻璃管放在下面水浴锅旳相对应旳固定夹子上, 再打开气流阀门, 以能感觉到气流声音为准, 再缓慢把针头伸到液面上方, 以吹动液面为限, 在浓缩吹干过程中应不停调整针头旳高度, 以节省吹干时间。
吹干旳样品以没有液体流动旳鉴定根据, 亦可在吹干后再吹大概2-3min左右。
严禁在没有吹干旳状况下就取下样品进行下一步操作。
简述elisa的基本原理
简述elisa的基本原理Elisa（酶联免疫吸附测定法）是一种常用的实验技术，用于检测生物样本中特定分子的存在和浓度。
它的基本原理是利用酶与抗原或抗体结合，然后通过酶的催化作用来检测样本中的目标分子。
Elisa技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发中得到了广泛的应用。
Elisa的基本原理可以分为间接法、直接法、竞争法和夹心法四种类型。
其中，间接法和直接法是最常用的两种。
在间接法中，首先将待检测的抗原或抗体样本加入到固相酶标记的抗体或抗原上，形成抗原-抗体-酶复合物。
然后，通过洗涤去除未结合的物质，加入底物和显色剂，测定酶的活性，从而间接检测出待测物质的存在和浓度。
而在直接法中，待检测的抗原或抗体样本直接与固相酶标记的抗体或抗原结合，形成抗原-抗体-酶复合物，然后通过相同的方法进行检测。
竞争法和夹心法则是在间接法和直接法的基础上进行的改进。
竞争法中，待检测的样本中的抗原与固相抗原结合，而夹心法中，待检测的抗原与固相抗体结合。
这些不同的Elisa类型在实际应用中，可以根据具体的实验要求来选择合适的方法。
Elisa技术的优点在于其灵敏度高、特异性好、操作简便、成本低廉等特点。
因此，它被广泛应用于临床诊断、生物医学研究和药物开发等领域。
例如，在临床诊断中，Elisa可以用于检测各种疾病标志物，如肿瘤标志物、传染病病原体等；在生物医学研究中，Elisa可以用于检测细胞因子、激素、抗体等；在药物开发中，Elisa可以用于药物的药代动力学研究、药效学评价等方面。
总之，Elisa作为一种常用的实验技术，其基本原理简单清晰，操作方便，应用范围广泛。
随着生物医学技术的不断发展，Elisa技术也在不断完善和改进，为生物医学研究和临床诊断提供了重要的技术支持。
ELISA实验方法
ELISA实验方法默克sigma-aldrich®带你走进抗体的实验室。
•夹心法检测过程•磷酸化检测过程•EIA检测过程•基于细胞的检测过程夹心法检测过程1. 在使用前让所有试剂和样品恢复至室温（18 - 25 °C）。
建议为所有的标准品和样品设置至少双重复。
2. 向相应的孔中添加100 μL的每种标准品和样品。
盖上孔并在室温孵育2.5小时或4 °C过夜，并轻轻摇晃。
3. 弃溶液并用1X 洗涤溶液洗涤4次。
通过使用多通道移液器或自动洗板仪向每孔中填充洗涤缓冲液（300 µL）以进行洗涤。
在每一步都将液体完全去除对于优秀的性能至关重要。
在完成最后一次洗涤后，通过吸取或倾倒而将残留的洗涤缓冲液进行去除。
将平板倒置，并用干净的纸巾将其吸干。
4. 向每孔中添加100 μL制备好的1x 检测抗体。
盖上孔并在室温孵育1小时，并轻轻摇晃。
5. 弃溶液。
重复第3步的洗涤步骤。
6. 向每孔中添加100 μL制备好的链霉亲和素溶液。
盖上孔并在室温孵育45分钟，并轻轻摇晃。
7. 弃溶液。
重复第3步的洗涤步骤。
8. 向每孔中添加100 μL TMB One-Step底物试剂（H项）。
盖上孔并在室温避光孵育30分钟，并轻轻摇晃。
9. 向每孔中添加50 μL 终止液（I项）。
立即测量450 nm处的吸光度。
磷酸化检测过程1. 在使用前让所有试剂恢复至室温（18 - 25 °C）。
建议为所有的样品或阳性对照设置至少双重复。
2. 向相应的孔中添加100 μL的每种样品或阳性对照。
用板支架盖上孔并在室温孵育2.5小时或4 °C过夜，并摇晃。
3. 弃溶液并用1x 洗涤溶液洗涤4次。
通过使用多通道移液器或自动洗板仪向每孔中填充洗涤缓冲液（300 µL）以进行洗涤。
在每一步都将液体完全去除对于优秀的性能至关重要。
在完成最后一次洗涤后，通过吸取而将残留的洗涤缓冲液进行去除。
llissa步骤
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
(6) TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
(8) 抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
ELISA相关仪器试剂设备
(三) 试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液):
NaCO3 1.59克 NaHCO3 2.93克 加蒸馏水至1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至1000ml
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA的数据分析
ELISA的数据分析一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析蛋白质、抗体、激素等生物分子的存在和浓度。
本文旨在详细介绍ELISA数据分析的标准格式，包括数据处理、结果解读和统计分析等内容。
二、数据处理1. 数据收集：ELISA实验中，通常会测量标准曲线和样品的光密度值。
收集所有实验数据，包括标准曲线的各个浓度点的光密度值和样品的光密度值。
2. 数据校正：对于样品的光密度值，需要进行背景校正，即减去空白对照的光密度值。
计算每个样品的校正后光密度值。
3. 标准曲线拟合：使用标准曲线的各个浓度点的光密度值，进行曲线拟合，得到标准曲线的方程。
可以使用线性回归、多项式拟合等方法，选择最佳拟合曲线。
4. 样品浓度计算：根据样品的校正后光密度值，使用标准曲线的方程计算样品的浓度。
根据实验需要，可以进行对数转换、反函数转换等操作。
三、结果解读1. 样品浓度结果：根据上一步计算得到的样品浓度，可以得出每个样品的浓度值。
将浓度值按照实验要求进行单位转换，如ng/mL或IU/mL等。
2. 阳性与阴性判定：根据实验目的，确定阳性和阴性的阈值。
将样品浓度与阈值进行比较，判断样品是否为阳性或阴性。
可以根据实验要求设定不同的判定标准，如浓度大于阈值为阳性，小于阈值为阴性。
3. 数据可视化：将样品浓度结果绘制成图表，如柱状图、折线图等。
可以使用统计软件或数据处理软件进行图表绘制，以直观地展示实验结果。
四、统计分析1. 均值与标准差：计算样品浓度的均值和标准差，用于描述样品的集中趋势和离散程度。
可以使用Excel等软件进行计算。
2. 方差分析：如果实验中有多个组别或处理，可以使用方差分析（ANOVA）进行组间比较。
方差分析可以判断不同组别之间是否存在显著差异。
3. 相关性分析：如果实验中有多个变量，可以进行相关性分析，判断变量之间的相关程度。
可以使用Pearson相关系数或Spearman相关系数等方法进行计算。
ELISA的原理与应用
原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果
酶免疫测定类型
酶免疫技术
酶免疫组化 酶免疫测定 均相酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 液相酶免疫测定
这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫 1971 吸附剂测定( Assay), ),简 吸附剂测定(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay),简 称ELISA. ELISA.
团间的作用.这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子 团间的作用.这种物理吸附是非特异性的, 量,等电点,浓度等的影响.大分子蛋白质较小分子蛋白质 等电点,浓度等的影响. 通常含有更多的疏水基团 故更易吸附到固相载体表面. 疏水基团, 通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面.
对照 标本 结果
当抗原材料中的干扰物质不易除去, 当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化 抗原时,可用此法检测特异性抗体. 抗原时,可用此法检测特异性抗体.
原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果
2.2.5 竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点 ,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模 因此不能用双抗体夹心法进行测定, 式.其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固 相抗体结合.标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶 相抗体结合.标本中抗原量含量愈多, 标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素, 标抗原愈少,最后的显色也愈浅.小分子激素,药物等 ELISA测定多用此法. ELISA测定多用此法. 测定多用此法
1.1.3
最适比例
原理 类型 试剂 准备 对照 标本 结果
ELISA检验方法-试验步骤
【检验方法】1.试验前准备（1）缓冲液使用前用蒸馏水或去离子水5倍稀释每瓶样本浓缩缓冲液，最终稀释体积为100ml。
冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。
（2）洗液使用前用蒸馏水或去离子水50倍稀释每瓶洗板浓缩缓冲液，最终稀释体积为1000ml。
冷藏存储：配好的溶液在2-8℃放置，30天内有效，或标签标注的有效期。
（3）样本检测前，将所有病人的样本用样本缓冲液1:100稀释。
因此在聚苯乙烯板上应混有10μl的样品和990μl的样品缓冲液。
质控品不需要稀释。
2.试验步骤（1）按需要准备好足够微孔反应板条。
（2）用100μl移液器把质控品和稀释后的病人样本加入到微孔中。
（3）在室温（20-28℃）温育30分钟。
（4）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。
（5）吸取100μl每份酶结合物分加到微孔中。
（6）在室温下温育15分钟。
（7）吸取300μl洗液冲洗微孔物质，冲洗3次。
（8）吸取100μl TMB底物溶液加入到微孔当中。
（9）在室温下温育15分钟。
（10）在每个微孔中加入100μl终止液，在室温下温育5分钟。
（如果酶标仪为读数之前震荡方式可不经5分钟温育后直接进行读数）（11）在450nm波长读取光密度读数并计算结果，如果采用双波长测定，参考波长为600-690nm。
3.程序注意事项（1）试剂的组分应在有效期内使用。
（2）试剂盒各组分不能互换。
（3）所有的实验材料应在室温（20-28℃）下操作。
（4）为了得到稳定和连续性的结果，在测试之前要准备好所有的检测样本，一旦测试开始就不要中断。
（5）严格按标准检测顺序进行检测分析。
（6）使用刚稀释的新鲜样本。
（7）所有的试剂和样本都要加入到微孔底部。
（8）不同样品和不同试剂之间要更换枪头以避免污染。
（9）彻底清洗微孔、除去最后的洗涤缓冲液对得到一个良好结果是非常重要的。
（10）所有的温育过程必须精确计时。
（11）质控品要定期进行检测以保证试剂和检测结果的可信性。
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题
Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题Elisa常见类型及实验标准操作方法与常见问题酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶液中的分析物（抗体或抗原）的浓度。
与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶联免疫吸附试验或酶免疫测定（EIA）通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，实现特异性和非特异性相互作用的分离，并可通过最终有色产物的形成，定量分析原始样品中分析物的含量。
ELISA 实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以及组织裂解物等为样品。
该实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。
根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA 检测方法。
该实验可迅速分析大量平行样品，在基础研究和临床诊断实践中广泛使用。
一、直接ELISA原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加酶标抗体进行孵育。
固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合的酶标抗体。
此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
加底物反应。
直接法主要用于测定抗原。
优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，避免了交叉反应；实验步骤少，操作不易出错。
缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，成本相对较高。
二、间接法ELISA原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。
洗涤除去未结合的抗原及杂质。
加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。
经洗涤后，加酶标二抗。
固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。
洗涤后，加底物显色。
优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于多种不同的一抗；不直标一抗，可保留更多的免疫反应性；成本更低，使用标记抗体更少。
缺点：交叉反应几率升高。
三、双抗夹心法ELISA原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。
将特异性抗体（捕获抗体）与固相载体连接，形成固相抗体。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将详细介绍ELISA操作规程，包括试剂准备、样品处理、板涂覆、孵育、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，配制适当的缓冲液，例如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（三倍磷酸盐缓冲液-Tween 20缓冲液）等。
2. 酶标板涂层抗体的制备：将特定抗体稀释至适当浓度，加入涂层液中，进行孵育。
三、样品处理1. 样品采集：采集待测样品，如血清、尿液等。
2. 样品预处理：根据实验要求，对样品进行适当的处理，如稀释、离心等。
四、板涂覆1. 涂层液加入：将酶标板中的孔加入涂层液，注意避免气泡的产生。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使抗体与孔壁结合。
五、孵育1. 样品加入：将经过处理的样品加入酶标板的孔中。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使待测物与抗体结合。
六、洗涤1. 洗涤液准备：配制适当的洗涤液，如TBST。
2. 洗涤：将洗涤液加入酶标板孔中，轻轻摇晃或者使用洗涤器进行洗涤，去除未结合的物质。
七、检测1. 二抗加入：将特定的二抗加入酶标板的孔中，与待测物结合。
2. 孵育：将酶标板在适当温度下孵育一段时间，使二抗与待测物结合。
3. 洗涤：使用洗涤液洗涤酶标板，去除未结合的二抗。
4. 底物加入：将底物加入酶标板孔中，使酶与底物反应产生可测量的信号。
5. 反应住手：加入适当的反应住手液，住手底物反应。
八、数据分析1. 读板：使用酶标仪读取各孔的吸光度值。
2. 数据处理：根据实验设计和标准曲线，计算出待测物的浓度或者相对含量。
3. 统计分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差、相关性等。
九、结果解读根据数据分析的结果，结合实验目的和背景知识，解读实验结果，得出相应的结论。
十、结论根据ELISA操作规程的步骤和结果解读，得出实验的结论，并讨论实验的可靠性和局限性。
ELISA的原理和类型
ELISA的原理和类型
1. ELISA的原理
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗抗体复合物与液体中的其他物质分开。
再加入酶标记的抗原或抗抗体，也通过反应而结合在固相载体上。
此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2. ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗抗体。
在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。
根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
2.1 双抗抗体夹心法测抗原
2.2 双抗原夹心法测抗体
2.3 间接法测抗抗体
2.4 竞争法测抗体
2.5 竞争法测抗原
2.6 捕获包被法测抗体
2.7 ABS-ELISA法。
ELISA的数据分析 (3)
ELISA的数据分析ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用的实验技术，用于检测和定量分析生物样品中的特定蛋白质或者抗原。
本文将详细介绍ELISA的数据分析过程，包括数据处理、结果解读和统计分析。
1. 数据处理：在ELISA实验中，通常会得到吸光度（OD）值，用于表示样品中目标蛋白质的含量。
首先，将吸光度值转换为标准曲线上的相应浓度。
标准曲线是通过已知浓度的标准样品制备的，通常是一系列浓度递增的样品。
根据标准曲线，可以将吸光度值转换为对应的浓度值。
2. 结果解读：ELISA的结果通常以浓度值表示，可以根据实验目的和研究问题进行不同的解读。
以下是几种常见的结果解读方式：- 单样品浓度：将各样品的吸光度值转换为浓度值后，可以直接比较不同样品之间的浓度差异。
- 样品组间比较：将不同组别的样品浓度进行比较，例如对照组和实验组之间的差异。
- 时间序列分析：如果实验涉及到多个时间点的采样，可以将各时间点的浓度值进行比较，分析目标蛋白质在不同时间点的变化趋势。
3. 统计分析：在ELISA数据分析中，往往需要进行统计分析来验证结果的可靠性和显著性。
以下是几种常见的统计分析方法：- t检验：用于比较两组样品之间的差异是否显著。
- 方差分析（ANOVA）：用于比较多组样品之间的差异是否显著。
- 相关分析：用于分析两个变量之间的相关性，例如目标蛋白质与其他指标的相关性。
- 回归分析：用于建立浓度与其他变量之间的数学模型，预测目标蛋白质的浓度。
4. 结论：根据ELISA的数据分析结果，可以得出相应的结论并进行讨论。
结论应该基于数据分析的结果，并回答研究问题或者验证假设。
例如，根据数据分析结果可以得出目标蛋白质在实验组中显著增加，与对照组相比存在统计学差异，从而支持实验假设。
总结：ELISA的数据分析是一个重要的实验过程，通过数据处理、结果解读和统计分析，可以得出准确的结论。
在进行ELISA数据分析时，需要注意选择合适的统计方法和解读方式，以确保结果的可靠性和科学性。
ELISA原理和分类(附图解)
一、ELISＡ旳原理ELIＳA旳基础是抗原或抗体旳固相化及抗原或抗体旳酶标记。
结合在固相载体表面旳抗原或抗体仍保持其免疫学活性, 酶标记旳抗原或抗体既保存其免疫学活性, 又保存酶旳活性。
在测定期,受检标本(测定其中旳抗体或抗原）与固相载体表面旳抗原或抗体起反映。
用洗涤旳措施使固相载体上形成旳抗原抗体复合物与液体中旳其他物质分开。
再加入酶标记旳抗原或抗体, 也通过反映而结合在固相载体上。
此时固相上旳酶量与标本中受检物质旳量呈一定旳比例。
加入酶反映旳底物后,底物被酶催化成为有色产物, 产物旳量与标本中受检物质旳量直接有关,故可根据呈色旳深浅进行定性或定量分析。
由于酶旳催化效率很高,间接地放大了免疫反映旳成果,使测定措施达到很高旳敏感度。
二、EＬISA旳类型ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。
在这种测定措施中有三个必要旳试剂:(1)固相旳抗原或抗体,即＂免疫吸附剂＂（immunoｓorbｅnｔ)；（2)酶标记旳抗原或抗体, 称为“酶联物”、“结合物”（conｊugate）；（3)酶反映旳底物。
根据试剂旳来源和标本旳状况以及检测旳具体条件,可设计出多种不同类型旳检测措施。
用于临床检查旳ELＩS Ａ重要有如下几种类型:（一）双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用旳措施,操作环节如下:(1）将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。
洗涤除去未结合旳抗体及杂质。
（2) 加受检标本,保温反映。
标本中旳抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。
洗涤除去其他未结合物质。
(3) 加酶标抗体,保温反映。
固相免疫复合物上旳抗原与酶标抗体结合。
彻底洗涤未结合旳酶标抗体。
此时固相载体上带有旳酶量与标本中受检抗原旳量有关。
(4) 加底物显色。
固相上旳酶催化底物成为有色产物。
通过比色,测知标本中抗原旳量。
在临床检查中, 此法合用于检查多种蛋白质等大分子抗原, 例如HBｓＡｇ、HBeAg、ＡFＰ、ｈＣG等。
只要获得针对受检抗原旳异性抗体, 就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。
ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量
ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量【基本原理】本法是用纯化或重组的IL-2R(α链，P55，CD25，Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。
则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb 结合。
通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白结合受抑制程度来求得待测样品中sIL-2R含量。
【材料和试剂】（1）纯化或重组的IL-2R蛋白（α链，P55，CD25，Tac抗原）（40.000u/ml）（2） FITC标记的抗IL-2R McAb（0.2μg/ml）：FITC为异硫氰酸荧光素，这里仅作为半抗原使用，而不作为荧光素标记。
（3）碱性磷酸酶标记的兔抗FITC抗体（酶标抗体）（4）对硝基苯磷酶盐底物液；用pH9.8的二乙醇胺缓冲液溶解，配成浓度为1mg/m l。
（5） 1%牛血清白蛋白-（1%A-）：为封闭液点稀释液（6）不同倍比稀释度的sIL-2R标准品：以1% A-稀释。
（7）洗涤液（0.05%Tween20-）（8）待测sIL-2R样品（9） 96孔酶标板（聚苯乙烯板），酶标仪，波长465nm滤光片（10）刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），4℃冰箱【操作步骤】（1）以一定浓度的纯化或重组的IL-2R（P55）蛋白包被96孔酶标板，100ul/孔，4℃过夜（16-72h）；（2）弃包被液，用1%A-封闭非特异性结合位点，200ul/孔，置室温2h；（3）用洗涤液加满各孔置3min，然后倾去，反复洗涤3次；（4）分别加入不同稀释度的sIL-2R标准品及待测样品，50μl/孔；（5）各孔均加入FITC标记的IL-2R McAb，50μl/孔，充分混匀后置室温2h；（6）同上洗涤3次；（7）各孔均加入碱性磷酶酶标记的兔抗FITC抗体，100μl/孔，置室温1h；（8）同上洗涤3次；（9）各孔均加入底物液，100μl/孔，置室温15-30min；（10）用酶标仪以波长405nm测各孔OD值。
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ELISA方法
用包被液包被纯化后的重组蛋白，包被量依次为1.25ng，2.5ng，5ng，10ng，每孔100μl，
兔多抗血清和免疫前阴性血清依次稀释1000倍，10000倍和100000倍与包被重组蛋白结合。
具体操作如下：
以包被缓冲液稀释重组蛋白，加入96孔板，100μl/孔，37 ℃2 h或4℃过夜；PBST洗板3次，每次1-2min；3％BSA (或者5%的脱脂奶粉)300μl/孔，封闭96孔板，37 ℃3 h或4℃过夜PBST洗板3次，每次1-2min；加入5%的脱脂奶粉稀释兔多抗血清和免疫前阴性血清，100μl/孔，37℃2h；
PBS-T洗板5次，每次1-2min；加入HRP酶标羊抗兔二抗，100μl/孔，37℃ 1h；PBS-T洗板4-5次，每次1-2min；
加入TMB显色底物50-100μl，(即先加A液一滴，再加B液一滴，A+B约100μl)室温5-20min(或30分钟)，待显色满意后加入等体积1N的H2SO4或HCL终止反应（约50μl）；
用酶联仪检测A450nm吸光度值。
兔多抗血清的吸光度值与阴性血清吸光度值的比值大于2即判为阳性。
棋盘滴定法确定最佳抗原包被量
表1-1 棋盘滴定法实验设计表
Table 1-1 Range of ELISA assay
抗原量（多肽）prM兔多抗(或单抗) 兔阴性血清（单抗阴性血清）Blank 1/2
00 1/1000 1/5000
1/1000
1/50000 1/20
0 1/1000 1/5000
1/100
00
1/500
00
无Ab
100ng 100ng 1μg
1μg
5μg
5μg
10μg
10μg
1．按表1-1的设计用包被液稀释多肽，按每孔100 μl分别加入相应的ELISA板（聚苯乙烯微孔反应板）孔内，Blank加入100 μl包被液，4 ℃包被过夜。
用PBST 洗涤3次，每次5 min。
2．用5% FBS封闭以减少非特异性吸附，每孔加入封闭液300 μl，37 ℃封闭1~2 h。
用PBST洗涤3次，每次5 min。
3．根据表1-1分别按比例稀释兔多抗血清和兔阴性血清（或单抗），Blank内加入100 μl PBST，37 ℃孵育1~2 h。
用PBST洗涤3次，每次5 min。
4．加入100μl以1:5000比例新鲜稀释的带HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，每孔100 μl，37 ℃孵育1 h。
用PBST洗涤3次，每次5 min。
5．每孔加入底物100 μl，包括blank，室温孵育5~30 min。
6．每孔加入50 μl终止液（2 M H2SO4）。
用酶标仪检测450 nm处的OD值。
7．阳性判断标准：加入兔多抗孔的吸光度值与阴性血清孔吸光度值的比值大于2即判断为阳性。
然后再从中找出阳性血清OD450nm值和阴性血清OD450nm 值之比（即P/N）最高的反应孔的抗原浓度和多肽稀释度为最佳抗原包被浓度和多肽稀释度
1μg的浓度即为10μg/ml
冻干多肽的保存
所有标明“保持冻干”的产物, 都必须保存在冰冻条件下，最好-20℃，若保存在-10℃以下, 大多数肽可维持几年的活性。
当使用冰冻产品时, 开盖之前, 瓶或试管应在装有新鲜干燥剂的干燥箱内升至室温。
对于保存于-20℃的产品, 这个过程需要一小时或更长, 随包装大小而异。
否则, 当瓶打开时, 水气进入导致多肽凝缩而降低其稳定性。
一旦打开, 应迅速称量完毕, 并立即密闭以免潮解, 尤其亲水肽更应注意。