新型医用无镍不锈钢(BIOSSN4)的细胞毒性评价

新型医用无镍不锈钢(BIOSSN4)的细胞毒性评价（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：刘莹，韩雪松，战德松，贾红梅【摘要】目的：评价新型医用无镍不锈钢(BIOSSN4)的细胞毒性。

方法：将BIOSSN4的浸提液与体外培养的小鼠成纤维细胞L929接触后，进行MTT实验来评定材料的细胞毒性，并与传统的医用316L不锈钢的生物学性能相比较。

结果：BIOSSN4对细胞增殖的抑制作用小于316L不锈钢组，统计学分析结果显示：两种金属材料与阴性对照组的吸光度值之间的差异无统计学意义(P0.05)，与阳性对照组之间的吸光度值之间的差异有统计学意义(P0.05)。

结论：BIOSSN4无镍不锈钢具有微弱的细胞毒性，符合临床应用要求，为其应用提供了一定的生物学依据。

【关键词】无镍奥氏体不锈钢;细胞毒性;MTT试验AbstractObjective：To test the cytotoxicity of a new nickel free stainless steel(BIOSSN4)and to evaluate its biocompatibility by comparing its cytotoxicity with the traditional316L medicalstainless steel，Au alloy in vitro.Mthod：after mixing the maceration extraction of the materials and the cultures of L929 cells，we evaluated cytotoxicity by using tetrazolium based colorimetric assay.Results：the cytotoxicity of BIOSSN4was weaker than that of 316Lstainless steel.There was no significant difference among the 2 kinds of metal material and the negative control(P0.05)Conclution：the biological safety of BIOSS4 is considerly good.Key wordsnew nickel free stainless steel(BIOSSN4);cytotoxicity;MTT assy医用金属材料在诸多生物材料中，由于具有较高的强度和韧性，适用于修复和置换人体硬组织[1]。

已经应用于临床的医用金属材料主要有不锈钢、钴基合金和钛合金几大类，此外还有形状记忆合金，以及纯金属金、银、钽、铌、镐为代表的贵金属等[2] 。

用作生物医用材料的不锈钢，具有良好的腐蚀性能和综合力学性能，且加工工艺简便，是生物医用材料中应用最多、最广的材料。

人们很早就使用铁丝、镍钢、镀金的铁钉及钒钢等材料进行临床治疗的尝试，目前医用不锈钢在医学领域得到了广泛应用，如AISI304，AISI316不锈钢等。

主要应用于骨骼系统的置换和修复方面，此外在齿科、心脏外科、心血管植入支架等方面也得到应用，且一直作为医疗仪器和手术器械材料而广泛使用[3]。

医用不锈钢的生物相容性及相关问题，主要涉及到不锈钢植入生物体后，由于腐蚀或磨损造成金属离子溶出引起的组织反应等，特别是不锈钢中的镍离子析出诱发的严重病变[4，5]。

镍(Ni)离子是众所周知的有害元素，除了对人体产生过敏反应外，还存在致畸、致癌的危害性[6-9] 。

镍还是大多数医用金属材料中的合金化元素，医用奥氏体不锈钢(含镍约13%左右)，医用钴基合金(含镍2%～30%不等)，镍钛形状记忆合金(含镍约50%)。

对于镍的危害，许多国家对日用品和医用金属材料的镍含量限制越来越严格，标准文件所允许的最高镍含量也越来越少。

所以低镍和无镍Cr Mn N型医用不锈钢的研究又引起人们的兴趣，一些研究者提出把高氮含量的Cr Mn N奥氏体不锈钢应用于生物医学[10-12]。

BIOSSN4无镍不锈钢是中科院金属研究所发展的一种奥氏体医用不锈钢材料[13]，这种不锈钢完全抛弃了镍元素，采用了氮元素来强化奥氏体基体，合适的热处理使不锈钢保证了单一稳定的奥氏体结构，即便在发生严重塑性变形后仍保持稳定的奥氏体结构。

本研究是对其细胞毒性作出评价，为临床应用提供理论依据。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试样分组及其来源实验组包括A、B。

A组：无镍不锈钢(BIOSSN4)(中国科学院金属研究所);B组：316L不锈钢(中国科学院金属研究所);阳性对照组为C组：铅(中国科学院金属研究所);阴性对照组为D组：RPMI 1640培养液。

1.1.2 试样制备将A，B组材料分别制成半径5 mm、厚l mm的圆形蜡片，根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后超声清洗15min;去离子水冲洗数遍后置于玻璃小瓶中，将金属片于121 ℃高压灭菌后待用。

C组也制备成同样大小试样，清洗烘干后置于紫外线下照射，试样各个面均照射24 h备用。

1.2 实验用细胞选用传代的对数生长期L929细胞(小鼠成纤维细胞)，由本院实验技术中心提供。

1.3 培养液及主要试剂 RPMI1640培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，pH 7.2);MTT(Sine American，Biotec)，全称为二甲基噻唑二苯基四唑溴盐，使用前新鲜配制，过滤除菌，浓度为5mg/ml;二甲基亚砜(DMSO，E.Merck.Darmstudt)。

1.4 主要仪器及设备 96孔和24孔培养液，25cm细胞培养液(NuNcTM，Denmark)，CO2培养箱(D63450，Heraeus，Germany)，倒置相差显微镜(CK10，Olympus，Japan)，自动酶标测试仪(Elx800，American，bio Tek instruments，Inc)，SW CJ2FD 型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

1.5 实验方法1.5.1 试样浸提液制备将A～C组试样分别放在超净工作台中，按浸液与试样表面积之比为0.55 ml/cm的比例加入RPMI1640培养液，置于37 ℃、95%湿度、5%CO2培养箱中72 h，即得到材料浸提液。

1.5.2 细胞的传代培养与细胞悬液的制备取复苏后的L929细胞，放入37 ℃、95%相对湿度、5%CO2培养箱中静置培养，选取快速生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制备成细胞密度约为1.0×105个/ml的细胞悬液，备用。

1.5.3 材料浸提液与细胞接种培养取96孔培养板。

每板均选出4组孔，每组重复6个孔，每孔中均加入细胞悬液100 μl。

在1～3组孔中分别加入A～C组的材料浸提液100 μl，使材料浸提液浓度最终为50%，在第4组孔内加入RPMI1640培养液100 μl后，继续放入培养箱中培养。

1.5.4 MTT甲臜的形成与检测分别于培养后1、2、3d 各取1块培养液，在每板的培养孔中加入5 mg/ml的MTT液，每孔20 μl，置于培养箱中继续培养4 h后取出。

吸出孔内培养液，在每孔中再加入DMSO 150 μl，微震荡20 min后，用自动酶标仪检测吸光度值，实验波长选为490 mm。

1.6 实验数据分析计算各实验组的细胞相对增殖率(RGR)并参照5级毒性评级标准作毒性级评定RGR=实验组的OD平均值/阴性对照组的OD平均值×100%，见表1。

表1 五级毒性评级标准结果评价标准：实验结果为0-1级反应的为合格;实验结果为2级反应的，应结合细胞形态分析，综合评价;实验结果为3-5级反应的为不合格。

1.7 统计学分析用Excel 2003软件将同一时期内各组的吸光度值(OD值)作方差分析和均数间两两比较的统计学分析。

以P0.05为差异有显著性。

2 结果2.1 各实验组的吸光度值材料C组(阳性对照组)在每次检测中的吸光度值均明显高于其他材料组(P0.05或P0.01)，而D组(阴性对照组)的吸光度值与除C组外的其他材料组均无明显差异(P0.05)，见表2。

表2 各实验组的吸光度值(x±s)419C0.265875±0.0352900.291625±0.5197000.292 857±0.040716D0.447000±0.0232620.561125±0.039 2700.669 857±0.018 425 注：C组与D组比较P0.052.2 各实验组的RGR及材料的细胞毒性级评定 A、B两组材料的毒性为1级，C组在培养48 h后毒性级由2级增长到3级，见表3。

表3 各实验组的细胞相对增殖率3 讨论不锈钢是一类应用最早的金属植入材料，虽然已经有半个多世纪的历史，但是其用作生物材料却经历了漫长的过程。

随着矫形外科手术的出现，人们就开始了医用金属材料的研究开发。

目前，医用不锈钢主要用作矫形外科植入材料，如骨科的人工关节骨棒(柄)、骨折固定用骨钉、骨板;牙科的义齿种植体及矫形丝等;管腔内植入物如心脏外科介入治疗用心血管支架等[12]，此外还可用于制作医疗仪器和手术器械。

不同形式的为牙科保健所提供的含镍不锈钢，其使用一直是成功的。

许多这些不锈钢合金运用于现存的临床修复体的制作，已经有很多年了，这些修复体包括冠、固定桥、可摘局部义齿、磁性附着体的外包裹材料等。

另外，在正畸领域也被广泛的运用，如金属托槽、弓丝、带环、弹簧、结扎丝等。

还有许多器械和装置，如牙体牙髓的器械等。

医用金属材料通常具有良好的耐蚀性能和生物相容性，镍是大多数医用金属材料中的合金化元素。

但是人体环境是一个复杂的生理介质，医用金属材料在人体内不可避免存在着腐蚀或磨蚀现象，磨损、腐蚀造成的金属离子溶出对人体组织有毒害作用，可能影响到人体组织的新陈代谢。

鉴于含镍医用金属材料可能对人体健康造成的危害，专家建议最好的办法就是严格禁止或限制各种直接接触人体的金属材料(如医疗植入物、牙科材料、首饰等)中的镍含量。

目前欧共体内使用的一欧元和二欧元硬币中镍元素的释放能使有镍过敏倾向患者的皮肤引起强烈的过敏反应[15] 。

本实验采用的MTT比色法是一种能快速评定细胞增殖和细胞毒性的比色分析法。

其测得的吸光度值取决于活细胞的数量及其新陈代谢的强度，故可以灵敏地反映出被测试材料对细胞造成的毒性损害程度[16]。

同时，该方法使用自动酶标仪检测吸光度值，能定量准确地评价出材料的细胞毒性。

因此，本实验结果证实了实验中的BIOSSN4不锈钢的细胞毒性弱于316L不锈钢，这种极微弱的细胞毒性临床应用中是可以接受的。