蛋白质组学在男性生殖医学中的应用

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附睾特异蛋白与精子功能的研究进展

哺乳动物睾丸中产生的精子在离开睾丸时尚不具备运动和使卵子受精的能力。其在附睾运行过程中经一系列的修饰，附睾精子成熟，具备完即才
的相互作用而不断成熟，表现为获得运动和受精能
力，而精子质膜的变化是精子获得这些新功能的直
光分析显示，大量的ＲａｅＮｓ９蛋白还集中表达于精
泌，并参与附睾管腔液态微环境修饰过程密切相关。
参与精子成熟的附睾特异蛋白
精子在附睾运行过程中，过与附睾液微环境通
作者单位：００１北京，１０８国家人口计生委科学技术研究所［韩丽嫒（北京协和医学院研究生院在读）于和鸣】，
【ｙｗｒｓＳｅａｚａＥｉｉｍｉ；ｐｒａｒｔｎＥｉｉｍａｓｃｅｒｒｅｓＫｅｏｄ】ｐｒｔｏ；ｐｄｄｓＳｅｍｍｔａｉ；ｐｄｄｌｅｒｔｙｐｏｉｍｏｙｕｏｙｏｔｎ
（ｎＲｅｒｄＨｅｌ／ａＰａ２１３５ — ７）ＪｌｔｐｏａｔＦｍｌｎ，０１，０：４５ｈ
ｔｖｌｇｔｒｕｈｔｅｅｉｉｙｓｔｂｓｏｒｔｉｓａｅｒｍｏｅｗａ，ｓｍｅａｅｂｎｉｇｏ，ａｄｓｍｅｒｅｉｈｏｇｈｐｄｄｍｉｕｅ，ｓｍｅｐｏｅｎｒｅｖｄａｙｏｒｉｄｎｎｎｏａｎ
系列不同的生物功能，ＲＡ的降解、抗病原物如Ｎ抵质入侵和参与炎症反应等。大量的研究表明，睾附内的ＲａｅＮｓ９与ＲａｅＮｓＡ超家族中其他成员的特性并不相同，要表现在：在去势大鼠的实验中发主 ① 现，睾的Ｒｓ９表现为雄激素依赖性，雄激素附Ｎａｅ受

代谢组学分析技术及其在生殖领域中的应用

但目前代谢组学研究还存在一些不足之处ｌｇ］： ①其相关分析技术中没有任何一种能够同时检测所有代谢物； ②数据分析手段无法分析和解释获得的
析、毒性基因组学、药理代谢组学［５］、整合药物代谢、
代谢组学是一门快速发展且相对较新的学科，是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后兴起的
一
象主要是生物体液（如血液、尿液等），样本比较容易获得，对机体损伤较小； ② 基因和蛋白表达的微小变化可以通过代谢物得到放大，使得检测更容易；③ 代谢物的种类要远少于基因和蛋白的数目；④ 代谢组学技术无需建立全基因组测序及大量表达序列标签（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇ，ＥＳＴ）的数据库；⑤ 与
目前对多数小分子生物体系代谢途径的一种技术。而ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ对基因功能与调控的认识相比，代谢调控是指测定生物体受病理生理刺激或基因修饰后引起内源性代谢物的作用及其所在代谢途径、
（１．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰卅Ｉ７３００７０；２．宁夏大学农学院，宁夏银川７５００２１；３．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州７３００７０）

Sirtuins_蛋白在双酚A_诱导的雄性生殖系统损伤模型小鼠睾丸组织和GC-2_细胞中的表达及其意

第 49 卷第 5 期2023年 9 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.5Sep.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230501Sirtuins蛋白在双酚A诱导的雄性生殖系统损伤模型小鼠睾丸组织和GC-2细胞中的表达及其意义符璐, 叶严珏, 李江英, 汤子怡, 尹俐（重庆理工大学药学与生物工程学院生物制药系，重庆400054）［摘要］目的目的：探讨Sirtuins（Sirt）蛋白家族在双酚A（BPA）诱导的雄性生殖系统损伤细胞和动物模型中的作用，阐明其对BPA诱导的雄性生殖系统损伤的影响。

方法方法：40只昆明种小鼠随机分为对照组、低剂量BPA组（给予3 mg·kg－1·d－1 BPA）、中剂量BPA组（给予30 mg·kg－1·d－1 BPA）和高剂量BPA组（给予300 mg·kg－1·d－1 BPA），每组10只。

低、中和高剂量BPA组小鼠采用玉米油（0.01 mL·g－1）配成相应浓度BPA灌胃，对照组小鼠给予0.01 mL·g－1玉米油。

5周后，检测各组小鼠体质量、睾丸指数和附睾指数，计算机辅助精液分析（CASA）系统检测各组小鼠精子质量，HE染色观察各组小鼠睾丸组织形态表现，Western blotting法检测各组小鼠睾丸组织中Sirt1~Sirt7蛋白表达水平。

小鼠GC-2细胞分为0、20、40和80 µmol·L－1 BPA组（给予0、20、40和80 µmol·L－1 BPA处理），EdU荧光染色法检测各组GC-2细胞增殖率，流式细胞术检测不同细胞周期各组GC-2细胞百分率和细胞凋亡率，Western blotting法检测各组GC-2细胞中Sirt1~Sirt7蛋白表达水平。

瘦素、结合蛋白相互作用对男性生殖调控研究进展

・综述・瘦素、结合蛋白相互作用对男性生殖调控研究进展＋卢永宁综述陈斌审校上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所（上海２００００１）瘦素（Ｌｅｐｔｉｎ）是肥胖基因（ｏｂｅｓｅｇｅｎｅ，ｏｂｇｅｎｅ）的蛋白产物，主要由脂肪组织分泌产生。

既往研究认为其主要功能是通过作用于下丘脑来降低食欲并增加能量消耗，进而调节体重，故称之为瘦素。

目前发现Ｌｅｐｔｉｎ是连接营养和其他牛理功能的代谢信号，不仅在能量代谢中发挥重要作用，还参与了机体免疫调节、血管生成、炎症反应、青春期启动及生殖调节等一系列重要生理活动：而Ｌｅｐｔｉｎ受体或结合蛋白对Ｌｅｐｔｉｎ生物学功能的发挥有重要调节作用。

尽管人们逐渐认识到Ｌｅｐｔｉｎ参与生殖调控，但目前研究成果主要集中在女性生殖系统调节方面，Ｌｅｐｔｉｎ对男性生殖系统的调节机制仍存在诸多问题有待探索。

本文就Ｌｅｐｔｉｎ及其受体或结合蛋白对男性生殖功能的影响作一综述。

一、Ｌｅｐｔｉｎ及其受体的生理功能（一）Ｌｅｐｔｉｎ及其受体的结构和分布Ｌｅｐｔｉｎ是由１６７个氨基酸组成的单链、分泌性蛋白质类激素，相对分子量为１６ｋＤａ。

编码Ｌｅｐｔｉｎ的肥胖摹凶最早克隆自ｏｂ／ｏｂ小鼠，该小鼠因肥胖基因发生隐性突变而导致极度肥胖和不育。

目前认为Ｌｅｐｔｉｎ的产生除了主要源于脂肪细胞以外，在下丘脑、垂体、胚胎合体滋养层、骨骼肌以及睾丸和精子等众多器官、组织及细胞也有表达。

Ｌｅｐｔｉｎ进入血循环后，以游离形式或与Ｌｅｐｔｉｎ结合蛋白（１ｅｐｔｉｎｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＬＢＰ）形成结合态存在。

Ｌｅｐｔｉｎ还通过与受体结合作用于中枢和外周多个位点而发挥不同作用。

Ｌｅｐｔｉｎ受体属于Ｉ类细胞因子受体家族，其不仅存在于和能量代谢有关的下丘脑、骨骼肌及脂肪组织，还广泛存在于与生殖功能密切相关的组织和细胞。

人类Ｌｅｐｔｉｎ受体（Ｏｂ．Ｒ）基因位于ｌ号染色体短臂３区ｌ带（１Ｐ３１），基因全长超过７０ｋｂ，由２０个外显子和１９个内含子组成。

bFGF在男性生殖系统的表达及作用研究

17020212312[17] Shao D, Zhai P, Del Re DP, ct al. A functional interactionbetween Hippo-YAP signalling and Fox O1 mediates the oxidative stress response [J]. Nat Commun, 2014, 5: 3315.[18] Lin Z, von Gise A, Zhou P, et al. Cardiac-specific YAP activationimproves cardiac functionand sur vival in an experimental murine MI model [J]. Circ Res, 2014, 115(3): 354-363.[19] Halder G, Johnson RL. Hippo signaling: growth control andbeyond [J]. Development, 2011, 138(1): 9-22.[20] Dorn GW. Parkin-dependent mitophagy in the heart [J]. J MolCell Cardiol, 2016, 95: 42-49.[21] Morikawa Y, Zhang M, Heallen T, et al. Actin cytoskeletalremodeling with protrusion formation is essential for heart regeneration in Hippo-deficient mice [J]. Sci Signal, 2015, 8 (375): 41.[22] Leach JP, Heallen T, Zhang M, et al. Hippo pathway deficiencyreverses systolic heart failure after infarction [J]. Nature, 2017,550(7675): 260-264.[23] Del Re DP, Yang Y, Nakano N, et al. Yes-associated proteinisoform 1(Yap1) promotes cardiomy ocyte survival and growth to protect against myocardial ischemic injury [J]. J Biol Chem, 2013, 288(6): 3977-3988.[24] Meliambro K, Campbell KN. Hippo pathway deficiency andrecovery from heart failure after myoc ardial infarction: potential implications for kidney disease [J]. Kidney Int, 2018, 93(2): 290292.(收稿日期:2021-01-02)bFGF在男性生殖系统的表达及作用研究崔宁宁，刘一朝,姚美静，刘敏袁王宇婧，母慧袁艾庆燕[关键词1碱性成纤维细胞生长因子;生殖系统;睾丸;精子;前列腺中图分类号R697 文献标识码A文章编号 1004-0188(2021)02-0170-03 doi:10.3969/j.issn.1004-0188.2021.02.024成纤维细胞的生长依赖于成纤维细胞生长因子(fib ro b la s t g ro w th fa c to rs,F G F)。

单细胞蛋白质组学应用(一)

单细胞蛋白质组学应用(一)单细胞蛋白质组学是一种全新的分析方法，可以在单个细胞水平上获取细胞蛋白质组的信息。

这项技术的应用广泛，以下是其中一些例子：1. 新型药物研发单细胞蛋白质组学可以帮助研究者了解药物与单个细胞的相互作用。

这有助于优化药物设计，并发现新型的药物作用机制。

2. 癌症研究单细胞蛋白质组学可以帮助研究者了解癌细胞的异质性以及不同次型癌的蛋白质差异，有助于更好的了解癌细胞的生物学特性，并为个性化治疗提供依据。

3. 免疫学研究单细胞蛋白质组学可以帮助研究者了解不同单个免疫细胞类型之间的功能差异和相互作用。

这些信息对于深入理解身体对不同病原体的免疫反应以及自身免疫疾病的发生机制有帮助。

4. 生殖医学研究单细胞蛋白质组学可以帮助研究者了解生殖细胞之间的差异，这对于生殖医学研究以及人工生殖技术的发展非常重要。

5. 神经科学研究单细胞蛋白质组学可以帮助研究者了解神经元之间的差异和相互作用，这对于理解神经网络的结构和功能以及神经退行性疾病的发生机制有帮助。

以上只是单细胞蛋白质组学应用的一小部分，未来随着技术的不断发展，其应用范围还将不断拓展。

单细胞蛋白质组学的技术与挑战单细胞蛋白质组学的实现需要采用高通量单细胞分析技术和高灵敏度蛋白质分析技术。

目前，单细胞蛋白质组学主要采用质谱分析技术，包括多反应监测（MRM）和质谱成像技术。

但是，单细胞样本量极小，如何在最小的样本量上获得最精确的蛋白质组信息，是当前技术面临的主要挑战。

单细胞蛋白质组学的发展前景单细胞蛋白质组学作为一项新兴的技术，已经取得了一定的进展。

未来，随着新技术的不断应用和开发，例如微流控技术、快速分离富集技术和高灵敏度质谱技术等，单细胞蛋白质组学的分析效率和准确性有望进一步提高，从而拓展其在生命科学领域中的应用。

双向凝胶电泳和质谱技术在男性生殖医学研究中的应用

５００个蛋白点的电泳图谱。１８０９２年固相ＩＦ技术Ｅ
就标志着生命科学研究进入了一个崭新的时
代 — — 后基因组时代，中重要的一方面是关于蛋其白质组的研究。蛋白质组研究是从整个基因组编码
质ｐ梯度等电聚焦作为双向凝胶电泳的第一向，Ｈ分辨率提高了ｌＯ倍，在一块胶上可分离ｐ相差Ｈ００１的两种蛋白１凝胶的形状也由最初的棒状发．０Ｉ，展到现在的有支持膜的薄层凝胶条，易于操作、Ｈｐ
维普资讯
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２２・３
国外医学计划生育分册２００２年２卷第４期１
双向凝胶电泳和质谱技术在男性生殖医学研究中的应用
南京医科大学江苏省生殖医学重点实验室（１ｏ９朱叶飞综述２０２）
梯度稳定、克服了传统凝胶的阴极漂移现象，可检测
碱性蛋白，使得不同实验室和个人之间实验的可重复性大大提高，上样量大，且以至于在一张双向电泳图上几乎可以得到整个细胞蛋白产物的分离点。
段— — 双向凝胶电泳和质谱技术，阐明与男性生殖功能密切相关的蛋白质及其功能，必将有助于深入理解睾丸发育／精子发生的生理机制，示男性不育的发病机理，终对男性生殖健康产生深远的影响。揭最关键词双向凝胶电泳质谱男性生殖

组学技术在生命科学中的应用

组学技术在生命科学中的应用生命科学涉及许多复杂的生物学和医学问题，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学等。

近年来，随着生物技术和计算机科学的快速发展，组学技术成为生命科学中的新兴领域，为生物医学科学、临床医学和药物研究等提供了新的研究方向。

本文将介绍组学技术在生命科学中的应用情况。

一、基因组学基因组学是研究基因组的结构、功能和进化的科学，其研究中心是DNA序列。

基因组测序技术的发展，使得我们可以了解人类和其他生物的基因组的信息。

基因组学的应用正在不断扩展，其中包括以下领域。

1. 基因组学在遗传疾病中的应用基因组学在遗传疾病中的应用包括遗传咨询、新生儿筛查、患者诊断、药物研究和垂直遗传疾病防治等方面。

例如，人类基因组计划所揭示的人类基因组序列，为我们更深入地了解遗传病提供了重要的资源。

基因组学的应用还有助于识别基因变异对疾病的风险和预后的影响，为开发针对个体的疗法提供了依据。

2. 基因组学在农业中的应用基因组学的应用不仅仅局限于人类医学，也可以用于农业领域。

例如，基因组测序技术可以测定植物的基因型和表现型，并有助于培育更好的品种。

同时，它可以帮助我们了解动物基因组与其生理和行为之间的关系，并促进家畜品种改良以提供更高质量的食品。

二、转录组学转录组学研究特定组织、细胞类型或生物系统中的RNA转录情况，是了解生命过程中基因表达能力的关键。

转录组学技术通常依赖RNA测序技术，这种技术可以帮助我们了解细胞或组织中所有基因的表达情况，以及这些基因的调控机制。

1. 转录组学在肿瘤学中的应用肿瘤是一类基因变异的疾病，转录组学技术可以更好地了解细胞的基因表达情况，从而更好地论证肿瘤的原因和存活机制，使转录组方法能够更准确和准确地检测出许多肿瘤的存在。

转录组学技术的应用还可用于预测患病风险，其中一些研究支持使用转录组数据作为癌症筛查的指标。

2. 转录组学在生殖特异性中的应用转录组学技术在研究中可以更好地了解生殖细胞分化的转录过程，并推断某些基因在某些时间点上的表达状态发生了怎样的变化。

蛋白组组学

蛋白组组学蛋白组学是一门研究蛋白质在生物体中组成、结构和功能的学科，是生物信息学领域的重要组成部分。

通过对蛋白质组的研究，人们可以更深入地了解生物体内蛋白质的种类、数量、结构和功能，从而揭示生命活动的规律和机制。

蛋白质是生物体内最基本的功能分子，承担着细胞结构的构建、信息传递、代谢调节等重要功能。

蛋白组学的研究主要包括蛋白质的组成、表达水平、翻译后修饰、互作关系等方面。

通过对蛋白质组的系统分析，可以揭示蛋白质在细胞和生物体水平上的功能和调控机制，为疾病的诊断、治疗和药物研发提供重要的理论基础和实验依据。

在蛋白组学研究中，常用的技术包括质谱分析、蛋白质芯片、蛋白质相互作用分析等。

质谱分析是一种常用的蛋白质鉴定和定量方法，可以通过质谱仪测定蛋白质的质量、序列和修饰信息。

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白质检测技术，可以同时分析大量蛋白质的表达水平和功能。

蛋白质相互作用分析可以揭示蛋白质之间的相互作用关系，帮助理解蛋白质网络的结构和功能。

通过蛋白组学的研究，人们可以揭示蛋白质在细胞和生物体中的功能和调控机制，发现新的生物标志物和药物靶点，为疾病的诊断、治疗和药物研发提供重要的科学依据。

例如，蛋白组学在肿瘤研究中发挥着重要作用，可以帮助识别肿瘤特异性蛋白质，揭示肿瘤发生发展的机制，为个性化治疗提供依据。

总的来说，蛋白组学是一门重要的生物信息学学科，对揭示生物体内蛋白质的组成、结构和功能具有重要意义。

通过蛋白组学的研究，人们可以更深入地了解生命活动的规律和机制，为疾病的诊断、治疗和药物研发提供重要的理论基础和实验依据。

希望通过不断地努力和创新，蛋白组学在生命科学领域发挥更大的作用，为人类健康和生命质量的提高做出更大的贡献。

牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用

畜牧兽医学报 2023,54(6):2436-2447A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.022开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用焦正兴1,潘阳阳1,2,王萌1,2,王靖雷1,马文斌1,高翔1,张晖1,崔燕1,2,余四九1,2,王立斌1,2*(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070)摘要:旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B (m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B ,L C 3B )基因,制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础㊂本研究通过基因克隆方法获得牦牛L C 3B 基因序列,利用原核表达㊁亲和层析法纯化牦牛L C 3B 重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,S e p h a r o s e 4B 柱层析法纯化制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(E L I S A )测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(W B )㊁免疫组织化学法(I H C )和免疫荧光技术(I F )检测牦牛生殖器官中L C 3B 蛋白的表达㊂结果显示,本研究成功克隆了牦牛L C 3B 基因(登录号:O P 572227),构建的重组质粒p E T -32a -L C 3B 能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛L C 3B 重组蛋白大小为34k u (含T r x 和H i s 标签),符合预期结果㊂通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛L C 3B 蛋白血清,抗体效价分别为1ʒ640000和1ʒ320000,特异性良好,表明牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备成功㊂纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中L C 3B 的表达检测,L C 3B 在牦牛卵巢㊁输卵管和子宫中表达,并且能识别L C 3B -Ⅰ和发生脂化后的L C 3B -Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周㊂本研究通过成功克隆牦牛L C 3B 基因制备了牦牛L C 3B 多克隆抗体,使用抗体检测发现L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛L C 3B 蛋白的检测和细胞自噬水平的研究㊂关键词:牦牛;L C 3B ;原核表达;多克隆抗体;生殖中图分类号:S 823.85 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2436-12收稿日期:2022-10-26基金项目:国家自然科学基金(32160850);甘肃省自然科学基金(22J R 5R A 864);甘肃省重点人才项目(2022-0623-R C C -0307)作者简介:焦正兴(1998-),男,甘肃永靖人,硕士生,主要从事动物生殖生理学研究,E -m a i l :1264847838@q q .c o m *通信作者:王立斌,主要从事动物生殖生理学和胚胎工程研究,E -m a i l :w a n gl b @g s a u .e d u .c n P r e p a r a t i o n o f P o l y c l o n a l A n t i b o d y a g a i n s t Y a k L C 3B P r o t e i n a n d I t s A p pl i c a t i o n i n D e t e c t i o n o f E x p r e s s i o n i n R e p r o d u c t i v e O r ga n s J I A O Z h e n g x i n g 1,P A N Y a n g y a n g 1,2,WA N G M e n g 1,2,WA N G J i n gl e i 1,MA W e n b i n 1,G A O X i a n g 1,Z H A N G H u i 1,C U I Y a n 1,2,Y U S i ji u 1,2,WA N G L i b i n 1,2*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,G a n s u A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.T e c h n o l o g y a n d R e s e a r c h C e n t e r o f G a n s u P r o v i n c e f o r E m b r y o n i c E n g i n e e r i n g o fB o v i n e a n d S h e e p ,L a n z h o u 730070,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c l o n e t h e m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B (L C 3B )g e n e o f y a k a n d p r e p a r e t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C 3B ,s o a s t o l a y af o u n d a t i o n f o r e x p l o r i ng th e r o l e o f a u t o p h a g yi n t h e r e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g y of y a k .T h e s e q u e n c e o f y a k L C 3Bg e n e w a s o b t a i n e d b y g e n e c l o n i n g .Th e r e c o m bi n a n t p r o t e i n o f ya k L C 3B6期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用w a s p u r i f i e d b y p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y.T h e p u r i f i e d p r o t e i n w a s u s e d a s a n t i g e n t o i mm u n i z e10-m o n t h-o l d J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s.T h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t L C3B w a s p u r i f i e d a n d p r e p a r e d b y S e p h a r o s e4B c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y,a n d t h e a n t i b o d y t i t e r w a s d e t e r m i n e d b y e n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A).W e s t e r n b l o t(W B),i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y(I H C)a n d i mm u n o f l u o r e s c e n c e(I F)w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r g a n s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e y a k L C3B g e n e(a c c e s s i o n n u m b e r:O P572227)w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d.T h e c o n s t r u c t e d r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-32a-L C3B i n d u c e d t h e p r o d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n a n d e x p r e s s e d i n i n c l u s i o n b o d i e s a n d s u p e r n a t a n t.T h e s i z e o f p u r i f i e d y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s34k u(c o n t a i n i n g T r x a n d H i s t a g s).T h e r a b b i t a n t i-y a k L C3B p r o t e i n s e r u m o b t a i n e d b y i mm u n i z i n g J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s h a d a n t i b o d y t i t e r s o f1ʒ640000a n d1ʒ320000,r e s p e c t i v e l y,w i t h g o o d s p e c i f i c i t y,w h i c h s h o w e d t h a t t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C3B p r o t e i n w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d.T h e p u r i f i e d a n t i b o d y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s o f y a k s.I t s h o w e d t h a t L C3B w a s e x p r e s s e d i n t h e o v a r i e s,o v i d u c t s a n d u t e r u s o f t h e y a k,a n d r e c o g n i z e d L C3B-Ⅰa n d L C3B-Ⅱa f t e r l i p i d a t i o n,i t w a s l o c a t e d m a i n l y i n t h e c y t o p l a s m a n d p e r i n u c l e a r.I n c o n c l u s i o n,L C3B p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d s u c c e s s f u l l y b y c l o n i n g L C3B g e n e i n t h i s s t u d y,a n d t h e e x p r e s s i o n o f L C3B p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s.I t i s s t a t e d t h a t t h e a n t i b o d y p r e p a r e d h a s g o o d s p e c i f i c i t y a n d i t c a n b e a p p l i e d t o d e t e c t L C3B p r o t e i n i n y a k s a n d f u r t h e r s t u d y o n t h e l e v e l s o f a u t o p h a g y.K e y w o r d s:y a k;L C3B;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d y;r e p r o d u c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G L i b i n,E-m a i l:w a n g l b@g s a u.e d u.c n自噬(a u t o p h a g y)是一种细胞内成分自我清除和自我更新的过程㊂根据底物识别和作用方式不同分为分子伴侣介导的自噬(c h a p e r o n e-m e d i a t e d a u t o p h a g y,C MA)㊁微自噬(m i c r o a u t o p h a g y)和巨自噬(m a c r o a u t o p h a g y)㊂自噬发生时,细胞内衰老或损伤的成分被具有双层膜结构的自噬体包裹,进而与溶酶体结合并降解,完成细胞内的自我清除和自我更新[1]㊂微管相关蛋白1轻链3(m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n1l i g h t c h a i n3,L C3)蛋白是自噬发生过程中表达的重要蛋白之一,在胞浆内以L C3-Ⅰ的形式存在,自噬发生时L C3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成L C3-Ⅱ并定位于自噬体膜上㊂当自噬体与溶酶体结合时,自噬体内膜上的L C3-Ⅱ蛋白被降解,外膜上的L C3-Ⅱ蛋白被切割修饰后变为L C3-Ⅰ蛋白[2]㊂L C3蛋白分为A㊁B㊁C三种亚型[3],其中L C3B在自噬过程中发挥双重作用,既作为吞噬细胞形成的重要细胞因子,又作为快速m R N A降解的R N A结合蛋白[4]㊂L C3B蛋白作为自噬体膜上的标记蛋白,与自噬体的发育和成熟有关,常用来监测自噬水平[5]㊂在哺乳动物的繁殖过程中自噬参与配子的分化㊁生成及早期胚胎发育[6-9]㊂在雄性动物生殖系统中,支持细胞在生精细胞生成过程中起保护和营养作用[10]㊂据报道,自噬缺陷会影响支持细胞的骨架结构,破坏支持细胞与生精细胞联系,进而抑制精子的生成[11]㊂此外,自噬参与顶体反应,对精卵融合起着重要作用[12]㊂在雌性动物生殖系统中,自噬促进黄体细胞分泌孕酮,维持妊娠[13]㊂在子宫内膜粘连的小鼠中,子宫内膜自噬水平低,并且以子宫内膜纤维化为特征[14]㊂子宫内膜发生自噬,对胚胎植入至关重要,并且在妊娠早期发挥着重要作用[15]㊂有试验证据表明,自噬相关基因A t g16L是小鼠子宫内膜蜕膜化的必需基因[16]㊂研究发现,自噬缺陷型小鼠表现为原发性卵巢功能不全,导致生育力低下[17]㊂通过低氧诱导颗粒细胞发生自噬,可以促进颗粒细胞发生分化和黄体形成[18]㊂颗粒细胞敲除B e c l i n1构建的自噬缺陷型模型中,小鼠分泌孕酮的量显著减少,从而导致流产[13]㊂研究表明,自噬完全缺陷型胚胎停滞在4细胞到8细胞阶段,最终导致胚胎死亡,且自噬缺陷型胚胎蛋白合成率也降低了30%[19]㊂L C3B蛋白作为自噬发生的标识蛋白,在相关研究中被用来检测自噬的发生和评估自7342畜牧兽医学报54卷噬通量㊂牦牛(B o s g r u n n i e n s)是我国青藏高原重要的动物资源,也是牧民经济收入的主要来源之一㊂由于自然条件恶劣,饲养水平低下,牦牛的自然繁殖率较低,如何提高牦牛的繁殖率越来越受到重视㊂目前有关L C3B蛋白在牦牛生殖活动中作用机理的研究较少,且未见商业化的牦牛L C3B蛋白抗体㊂为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中的作用,本研究通过基因克隆㊁原核表达和动物免疫的方法制备牦牛特异性L C3B蛋白多克隆抗体,并应用于牦牛生殖器官中L C3B蛋白表达检测,以期为牦牛体内L C3B蛋白和繁殖过程中自噬的研究提供依据㊂1材料与方法1.1试验动物与样品采集1.1.1试验动物日本大耳白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所,10月龄,室内饲养,饮水充足,健康状况良好㊂1.1.2样品采集本试验中所用牦牛睾丸㊁卵巢㊁子宫㊁输卵管等样品来自于青海省某屠宰场㊂健康成年牦牛经颈动脉放血屠宰后,30m i n内采集组织样,修剪周围结缔组织后用生理盐水冲洗干净,分别储存于液氮和4%多聚甲醛溶液中运回实验室备用㊂牦牛输卵管上皮细胞样品由甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心提供㊂1.2主要仪器与试剂P C R仪购自德国艾本德公司,超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物公司,酶标仪购自美国T h e r m o公司,显微拍照仪购自日本O l y m p u s公司,T a q P C R M a s t e r M i x㊁E v o M-M L V反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司,T r i z o l试剂盒㊁R I P A裂解液㊁通用型D N A纯化回收试剂盒购自北京全式金公司,p M D T M19-T V e c t o r C l o n i n g K i t㊁J M109感受态细胞均购自日本T a K a R a公司, p E T-32a载体质粒购自美国T h e r m o公司,6ˑ蛋白上样缓冲液㊁氨苄青霉素(a m p i c i l l i n,A m p)㊁5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-b r o m o-4-c h l o r o-3-i n-d o l y l-b e t a-D-g a l a c t o p y r a n o s i d e,X-g a l),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷I P T G(i s o p r o p y l-β-D-t h i o g a l-a c t o p y r a n o s i d e,I P T G)均购自北京S o l a r b i o公司, W e s t e r n b l o t所用试剂均购自武汉博士德公司, G o a t A n t i-R a b b i t I g G/H R P a n t i b o d y㊁S P试剂盒及D A B试剂盒购自北京B i o s s公司,P r o t e i n m a r k e r 购自加拿大F e r m e n t a s公司,亲和层析柱料购自美国G E H e a l t h c a r e公司,佐剂购自上海S i g m a A l d r i c h公司,感受态细胞B L21(D E3)㊁P M S F购自北京碧云天公司㊂1.3牦牛L C3B基因克隆1.3.1引物设计参照G e n B a n k公布的牛(B o s t a u r u s)L C3B基因序列(NM_001001169.1),利用P r i m e r5进行引物设计,由上海生工进行引物合成,引物序列为L C3B-F:C A C G A G C C A A C T C G C, L C3B-R:A T C G G T G A T T A G A T G A A C T,产物长度为519b p,退火温度为54ħ,用于克隆牦牛L C3B基因㊂1.3.2总R N A的提取及反转录以体外培养的牦牛输卵管上皮细胞为材料,参照T r i z o l试剂盒说明书提取牦牛输卵管上皮细胞总R N A,并进行反转录合成c D N A,-20ħ保存㊂1.3.3L C3B基因的扩增与克隆以c D N A为模板对L C3B基因进行扩增㊂反应体系为20μL: 2ˑE x p T a q H S P C R M a s t e r M i x10μL,c D N A 2μL,上㊁下游引物各0.5μL,d d H2O7μL;反应条件:95ħ5m i n;95ħ45s,54ħ30s,72ħ2m i n; 4ħ保存㊂反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证㊂将胶回收产物与p M D-19T v e c t o r连接转化入D H5α感受态细胞(E s c h e r i c h i a c o l i)并涂布于L B(L u r i a-B e r t a n i)固体培养基(A m p,X-g a l, I P T G),过夜培养,挑取阳性单克隆菌落接种于L B 液体培养基(A m p)摇菌16h,吸取100μL菌液并送往北京擎科生物科技有限公司测序㊂1.3.4牦牛L C3B基因生物信息学分析用N C B I-B L A S T(h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/ B l a s t.c g i)对牦牛L C3B基因进行同源性比对;利用M E G A7.0绘制进化树;用N C B I在线软件进行开放阅读框分析(h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ o r f f i n d e r);用在线软件预测L C3B蛋白的二级结构(h t t p:b i o i n f.c s.u c l.a c.u k/p s i p r e d)㊁三级结构(h t-t p s:ʊs w i s s m o d e l.E x p a s y.o r g),分析L C3B蛋白的理化性质(h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m),用在线软件分析L C3B蛋白亲疏水性(h t t p s:ʊw e b.e x-p a s y.o r g/p r o t s c a l e),用在线软件T M H MM S e r v e r V2.0预测跨膜结构域(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/ T MHMM-2.0/)和磷酸化位点(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/se r v i c e s/N e t P h o s)㊂83426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用1.4L C3B重组质粒的构建与原核表达测序比对正确的L C3B基因由武汉戴安生物技术有限公司合成,与表达载体p E T-32a(该载体含有T r x和H i s标签蛋白,分子量约为20k u)连接㊂将构建好的阳性质粒转化到B L21(D E3)感受态细胞,接种氨苄抗性L B培养基,过夜;挑选转化平板的4个单克隆,分别接种3m L抗性液体培养基; 37ħ,220r㊃m i n-1培养至O D600n m为0.5~0.6,加入0.5mm o l㊃L-1I P T G20ħ诱导表达3.5h;离心收集菌体,超声破碎,S D S-P A G E检测表达情况㊂1.5L C3B重组蛋白的纯化选择原核表达良好的60μL菌株接种至200m L抗性液体培养基,37ħ,220r㊃m i n-1培养过夜㊂加入新鲜抗性培养基至800m L,培养2h至O D600n m为0.5~0.6㊂加入200μL的1m o l㊃L-1 I P T G37ħ诱导表达3.5h㊂4ħ离心收集菌体(66r㊃s-1,15m i n),弃上清,加入30m L P B S T悬浮菌体,加入终浓度1mm o l㊃L-1P M S F,超声波200W破碎6m i n之后摇床4ħ孵育1h㊂4ħ高速离心(133r㊃s-1,15m i n),取上清,加入400μL于镍柱中,4ħ过夜㊂收集镍柱(33r㊃s-1,5m i n),用20mm o l㊃L-1咪唑洗脱液洗涤磁珠,洗去杂蛋白(1m L,3次)㊂加入300μL300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液与磁珠充分结合1h,离心收集上清㊂再次向磁珠加入300μL的洗脱液,洗脱1h,离心收集上清㊂两次洗脱液合为一管,对P B S缓冲液透析换液㊂进行S D S-P A G E鉴定蛋白质㊂1.6多克隆抗体的制备及效价检测用纯化后的400μg L C3B重组蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1融合乳化,背部多点注射免疫日本大耳白兔,分别在第一次注射后的28㊁42㊁47㊁54d进行4次加强免疫,每次150μg㊂第四次加强免疫10d 后采集兔子血液,置于4ħ冰箱,次日离心收集血清㊂10m L抗血清与S e p h a r o s e4B亲和纯化柱过夜孵育,p H为5.0H C l洗去杂抗体,p H为2.5, 0.15m o l㊃L-1甘氨酸缓冲液洗脱,10ˑP B S缓冲液中和,制备亲和纯化抗体㊂将牦牛重组L C3B蛋白包被液稀释至1μg㊃m L-1作为抗原加至96孔板(100μL㊃孔-1)于4ħ冰箱中过夜,次日弃去孔内液体,洗涤3次,每孔加200μL封闭液,室温静置1h㊂兔抗L C3B蛋白抗体按1ʒ10000稀释后作为一抗,未注射任何免疫原的兔子血清作为阴性对照,H R P 标记的羊抗兔I g G作为二抗,一抗㊁二抗皆于37ħ孵育1h,孵育抗体前后P B S T洗涤5次㊂每孔加50μL显色液,室温显色20m i n后用50μL终止液终止显色㊂以O D450n m阳性血清/O D450n m阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价㊂1.7W e s t e r n b l o t鉴定牦牛L C3B多克隆抗体1.7.1蛋白变性经液氮快速冷冻后的组织样品充分研磨,每100m g组织样加入1m L高效R I P A裂解液和10μL P S M F,冰浴反应3h,4ħ, 1500r㊃m i n-1离心15m i n,取上清液,与6ˑ蛋白上样缓冲液3ʒ1混合,100ħ变性10m i n后冷却至室温,-20ħ保存㊂1.7.2W e s t e r n b l o t检测牦牛L C3B蛋白抗体特异性制备12%的分离胶与5%的浓缩胶,进行S D S-P A G E,电泳后转膜至P V D F上,用5%脱脂奶粉封闭3h㊂弃去封闭液,分别以所得的兔血清和牦牛L C3B抗体为一抗(1ʒ1000),4ħ孵育12h, P B S T清洗5次,10m i n㊃次-1,H R P标记的羊抗兔抗体为二抗(1ʒ7000),室温摇床孵育1h,P B S T清洗4次,10m i n㊃次-1㊂之后在P V D F膜上滴加电化学发光液,使用化学发光仪进行检测㊂1.8L C3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达定位经4%多聚甲醛固定的睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫样品进行脱水后,制作石蜡切片,用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,滴加3%H2O2溶液37ħ作用10m i n,P B S洗涤3次,3m i n㊃次-1,后滴加封闭液,室温封闭15m i n,滴加牦牛L C3B抗体(1ʒ500),阴性对照滴加P B S,4ħ孵育12h㊂P B S洗涤3次(3m i n㊃次-1),滴加二抗,37ħ作用15m i n后P B S 洗涤3次,3m i n㊃次-1,滴加三抗,37ħ作用15m i n,P B S洗涤3次㊂滴加D A B工作液显色,蒸馏水终止,苏木精复染,脱水,透明,树脂封片,观察拍照㊂1.9免疫荧光鉴定0.25%胰酶消化原代输卵管上皮细胞,用P B S 清洗输卵管上皮细胞3次,制成细胞悬液,将4ˑ105个㊃m L-1接种至有盖玻片的六孔板中,温箱培养24h,进行细胞贴壁,取出爬片,用P B S洗涤3次, 3m i n㊃次-1㊂2%多聚甲醛进行固定,洗涤后加入含有0.1%T r i t i o n-X100室温透化20m i n后,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,用牛血清白蛋白(B S A)室温封闭2h,弃去封闭液,加入牦牛L C3B抗体(1ʒ500), 4ħ过夜孵育,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,加入F I T C标记的二抗(1ʒ1000)室温孵育1h,P B S洗涤9342畜牧兽医学报54卷后,用D A P I染色液染核4m i n,用抗荧光淬灭剂封片后,在荧光显微镜下观察并拍照㊂2结果2.1牦牛L C3B基因克隆P C R扩增结果显示,目的条带单一且特异性良好,大小为519b p,与预期产物大小一致(图1A)㊂将纯化后的牦牛L C3B片段连接至P M D-19T载体后挑取单克隆进行菌液P C R验证(图1B),目的条带大小与普通P C R结果一致㊂后使用菌液进行测序,结果进一步提示所得序列为牦牛L C3B序列㊂测序结果已提交至G e n B a n k,登录号为:O P572227㊂A.L C3B基因P C R扩增电泳:M.D N A相对分子质量标准,1~4.牦牛L C3B基因扩增产物㊂B.单克隆菌液P C R扩增电泳:1~6.菌液P C R扩增产物A.L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:M.D N A m a r k e r;1-4.Y a k L C3B g e n e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s.B.S i n g l e c o l o n y P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:1-6.B a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s图1牦牛L C3B基因P C R扩增电泳与菌液P C R扩增电泳F i g.1Y a k L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s a n d b a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s2.2牦牛L C3B基因生物学信息分析2.2.1牦牛L C3B基因开放阅读框分析和进化树构建结果表明牦牛L C3B的开放阅读框全长378b p,总共编码125个氨基酸㊂系统进化树结果显示(图2),牦牛L C3B基因与普通牛(B o s t a u-r u s)㊁野牦牛(B o s m u t u s)㊁印度牛(B o s i n d i c u s)亲缘性最高㊂图2牦牛L C3B基因的系统进化树F i g.2P h y l o g e n e t i c t r e e o f y a k L C3B g e n e2.2.2牦牛L C3B蛋白理化性质分析和高级结构预测牦牛L C3B蛋白分子式为C659H1057N179O189S6,原子总数为2090,理论等电点(P I)为8.71,不稳定指数60.93,是一种不稳定蛋白㊂L C3B蛋白预测分子量大小为14.7k u,共编码19种氨基酸㊂牦牛L C3B基因编码的氨基酸中带正电的氨基酸总数为(A r g+L y s)19个,带负电的氨基酸总数为(A s p+G l u)17个,该蛋白带正电㊂牦牛L C3B基因编码的蛋白中α-螺旋共有37个氨基酸,占总数的29.6%,延伸链结构有22个氨基酸,占17.6%;无规则卷曲结构有66个氨基酸,占52.8%㊂牦牛L C3B蛋白的二级及三级结构结果如图3A㊁3B所示㊂2.2.3牦牛L C3B基因编码蛋白亲疏水性㊁跨膜结04426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用构域和磷酸化位点分析牦牛L C3B蛋白为亲水性蛋白(图3C)㊂疏水性最强的为第79位的苯丙氨酸(P h e),其分值为1.556,亲水性最强的为第12位的苏氨酸(T h r),其分值为-2.867;L C3B蛋白不含跨膜区域,是非跨膜蛋白(图3D)㊂有4个丝氨酸(S e r)㊁3个苏氨酸(T h r)和1个酪氨酸(T y r)的磷酸化位点大于阈值,有成为蛋白质激酶磷酸化位点的可能(图3E)㊂A.牦牛L C3B蛋白二级结构预测;B.牦牛L C3B蛋白的三级结构;C.牦牛L C3B蛋白亲疏水性分析;D.牦牛L C3B蛋白跨膜结构域分析;E.牦牛L C3B蛋白磷酸化位点分析A.S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n o f y a k L C3B p r o t e i n;B.T h e t e r t i a r y s t r u c t u r e p r o t e i n o f y a k L C3B p r o t e i n;C.H y d r o p h o-b i c i t y a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n;D.A n a l y s i s o f t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s o f y a k L C3B p r o t e i n;E.P h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n a l y s i s o f L C3B p r o t e i n i n y a k图3牦牛L C3B蛋白生物学信息分析F i g.3B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n1442畜牧兽医学报54卷2.3重组质粒的构建及重组蛋白表达对重组质粒用B a m HⅠ和P s tⅠ进行双酶切验证,结果显示成功构建了p E T32a-L C3B重组质粒(图4A)㊂诱导蛋白表达结果如图4B所示,上清液和包涵体中都有牦牛L C3B重组蛋白的表达,大小为34k u,其中T r x标签蛋白大小约为20k u ㊂A.重组质粒双酶切验证:M.D N A相对分子质量标准;1.双酶切产物;2.p E T32a-L C3B重组质粒㊂B.重组质粒诱导表达: M.蛋白质量分子标准;1~4.全菌液诱导表达A.D o u b l e e n z y m e d i g e s t i o n v e r i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d:M.5000D N A M a r k e r;1.D o u b l e d i g e s t i o n p r o d u c t;2. p E T32a-L C3B r e c o m b i n a n t p l a s m i d.B.R e c o m b i n a n t p l a s m i d i n d u c e d e x p r e s s i o n:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1-4.W h o l e c e l l i n d u c e d e x p r e s s i o n图4重组质粒双酶切验证与诱导表达F i g.4V e r i f i c a t i o n a n d i n d u c e d e x p r e s s i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d b y d o u b l e d i g e s t i o n2.4牦牛L C3B蛋白的纯化使用亲和层析法纯化牦牛L C3B重组蛋白,咪唑洗脱液洗脱镍柱中的蛋白,S D S-P A G E检测结果显示(图5A),大约在34k u处出现较为单一的条带,表明纯化后的蛋白为牦牛L C3B重组蛋白,与预期结果一致㊂透析牦牛L C3B重组蛋白后经S D S-P A G E分析,获得3m g纯化蛋白(图5B)㊂A.上清诱导纯化蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液一;2.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液二;3.B e a d s样㊂B.透析后蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.B S A上样;2.透析后蛋白A.T h e s u p e r n a t a n t i n d u c e d p u r i f i e d p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t o n e;2.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t t w o;3.B e a d s.B.P o s t-d i a l y s i s p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o-l e c u l a r s t a n d a r d;1.B S A l o a d i n g;2.P r o t e i n a f t e r d i a l y s i s图5牦牛L C3B重组蛋白纯化F i g.5P u r i f i c a t i o n o f y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n24426期焦正兴等:牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用2.5 多克隆抗体的制备及鉴定根据O D 450n m 阳性血清/O D 450n m 阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价,本试验制备的抗体效价为1ʒ640000㊁1ʒ320000(表1,图6A )㊂制备的血清(含T r x 和H i s 标签)能与牦牛L C 3B 蛋白发生特异性反应(图6B ),并且能识别L C 3B -Ⅰ(36k u )和脂化的后的L C 3B -Ⅱ(34k u )蛋白,表明该蛋白多克隆抗体特异性良好,可用于后续试验㊂表1 不同稀释度O D 450n m 值T a b l e 1 O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s 吸光值A b s o r b a n c e10K 20K 40K 80K 160K 320K 640K 1280K 2560K 5120K 10240K 阴性N e g a t i v e 1#兔多抗1#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0450.9860.8600.6720.4980.3610.2230.1450.1030.0700.0690.0582#兔多抗2#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0180.8970.7140.5150.3360.2200.1390.1000.0830.0710.0650.053A.不同稀释度的O D 450n m 值;B .免疫后血清特异性验证:1.卵巢;2.输卵管;3.子宫A.O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s ;B .V e r i f i c a t i o n o f s e r u m s p e c i f i c i t y a f t e r i mm u n i z a t i o n :1.O v a r y ;2.O v i d u c t ;3.U t e r u s图6 多克隆抗体效价及特异性检测F i g .6 P o l y c l o n a l a n t i b o d y t i t e r a n d s p e c i f i c i t y de t e c t i o n 2.6 兔抗牦牛L C 3B 多克隆抗体应用2.6.1 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B 在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中的表达牦牛L C 3B 纯化抗体能与牦牛蛋白发生特异性反应,并且能够识别L C 3B 蛋白,包括L C 3B -I (16k u )和脂化后的L C 3B -I I (14k u ),与预测的牦牛L C 3B 蛋白大小一致(图7)㊂1.睾丸;2.卵巢;3.输卵管;4.子宫1.T e s t i s ;2.O v a r y;3.O v i d u c t ;4.U t e r u s 图7 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达F i g .7 E x p r e s s i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga n s d e t e c t e db y We s t e r n b l o t 2.6.2 免疫组织化学和免疫荧光染色检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 L C 3B 蛋白在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫均有阳性表达㊂在睾丸中,主要表达于精子细胞(S P )㊁间质细胞(I C )㊁支持细胞(S C );在卵巢中,主要表达于黄体细胞(C L )㊁颗粒层(S G )和卵泡膜(T F );在输卵管中,主要表达于黏膜上皮(E M );在子宫中,主要表达于子宫腺(U G )和子宫内膜(E N )(图8)㊂免疫荧光显示,L C 3B 蛋白主要表达于牦牛输卵管上皮细胞的细胞核周和细胞质中(图9)㊂3 讨论本试验通过基因克隆,获得了大小为519b p 的牦牛L C 3B 基因,该序列已提交至G e n B a n k ,登录号为:O P 572227㊂对牦牛L C 3B 基因序列在线比对3442畜牧兽医学报54卷a ㊁b ㊁c .睾丸;d ㊁e ㊁f .卵巢;g ㊁h ㊁i .输卵管;j ㊁k ㊁l .子宫㊂a ㊁b ㊁d ㊁e ㊁g ㊁h ㊁j ㊁k 为阳性表达;c ㊁i ㊁l 为阴性对照㊂S P .精子细胞;S C .支持细胞;I C .间质细胞;S T.生精小管;S G.颗粒层;T F .卵泡膜;C L .黄体细胞;E M.黏膜上皮;U G.子宫腺;E N.子宫内膜a ,b ,c .T e s t i s ;d ,e ,f .O v a r y ;j ,h ,i .F a l l o p i a n t u b e ;j ,k ,l .U t e r u s .a ,b ,d ,e ,g ,h ,j ,k a r e p o s i t i v e e x p r e s s i o n ;c ,i ,l a r e n e g a t i v e c o n t r o l .S P .S pe r m c e l l s ;S C .S e r t o l i c e l l s ;I C .I n t e r s t i t i a l c e l l s ;S T.S e m i n if e r o u s t u b u l e s ;S G.G r a n u l a r l a y e r ;T F .T h e c a f o l l i c l e ;C L .L u t e a l c e l l ;E M.E p i t h e l i u m m u c o s a e ;U G.U t e r i n eg l a n d s ;E N.E n d o m e t r i u m 图8 L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中的分布F i g .8 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga ns 图9 L C 3B 蛋白在牦牛输卵管上皮细胞中的分布F i g .9 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n o v i d u c t e pi t h e l i a l c e l l s o f y a k 44426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用后发现,与普通牛㊁印度牛㊁野牦牛的L C3B基因序列高度一致,体现了L C3B基因的高度保守性,这与B a e k e n等[20]的研究结果一致㊂在前人的研究中提出,L C3B蛋白可发生脂化,表现为L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ两种形式[21]㊂本研究通过理化性质分析后发现,牦牛L C3B共编码125个氨基酸,牦牛L C3B蛋白是非跨膜性的不稳定蛋白,提示牦牛L C3B蛋白也可发生脂化㊂该蛋白有4个丝氨酸㊁3个苏氨酸和1个酪氨酸成为磷酸化位点的可能㊂N i e t o-T o r r e s等[22]认为,L C3B蛋白发生磷酸化对自噬体与细胞核周围的溶酶体结合有重要意义㊂本试验成功构建了p E T-32a-L C3B重组质粒,经原核诱导表达后进行动物免疫,获得了免疫原性良好的抗牦牛L C3B血清,经纯化后制得了牦牛L C3B多克隆抗体㊂P E T-32a载体广泛应用于自噬相关蛋白表达,是较为稳定的原核表达载体[23-24]㊂但因p E T-32a标签蛋白分子量小,不利于小分子蛋白的诱导表达,因此,添加了T r x和H i s标签,以优化诱导表达条件㊂硫氧还蛋白(T r x)增强蛋白的可溶性表达,减少蛋白的浪费㊂牦牛L C3B重组蛋白的成功制备和高水平的表达是成功制备牦牛L C3B 多克隆抗体的关键㊂对该蛋白进行纯化后,制得牦牛L C3B多克隆抗体效价达到1ʒ320000和1ʒ640000,而余振兴等[25]制备的紫贻贝L C3B抗体效价仅为1ʒ25600,表明本研究所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体具有较高的灵敏性㊂通过W e s t e r n b l o t检测,本试验制备的牦牛L C3B多克隆抗体能正常识别L C3B蛋白,并且能够识别L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ,证明本试验成功制备了特异性较好的牦牛L C3B蛋白抗体㊂将本试验制备的纯化抗体应用于L C3B蛋白的表达定位检测㊂W e s t e r n b l o t结果显示,L C3B在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,并且能够检测到L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ蛋白㊂目前, L C3B-Ⅱ/L C3B-Ⅰ的比值常用来评估自噬[26]㊂因此,本研究结果提示所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体可用于牦牛自噬流的评估㊂免疫组织化学结果显示,L C3B蛋白在牦牛睾丸的精子细胞和支持细胞中表达㊂睾丸支持细胞在生殖细胞的存活和精子的生成中起着重要作用,与性腺的发育也有着紧密的联系[27]㊂Y i n等[28]已证实,自噬可抑制精母细胞凋亡,进而促进精子生成,说明牦牛L C3B蛋白也可能参与精子的生成过程㊂L C3B蛋白在山羊卵巢黄体类固醇生成细胞中表达[29],U l l a h等[30]检测L C3B蛋白表达,发现增强自噬可改变黄体类固醇细胞的亚细胞结构,有助于黄体功能的维持㊂本研究发现,L C3B蛋白在牦牛黄体细胞中表达,提示该蛋白可能参与牦牛孕酮的产生,与牦牛维持妊娠和调节发情和排卵有关㊂研究发现,促卵泡素(F S H)在促进卵泡发育的同时,伴有自噬的发生,在有腔卵泡中检测到L C3蛋白[31]㊂牦牛L C3B蛋白在颗粒细胞和卵泡膜中表达,说明L C3B蛋白参与牦牛卵泡的生长和发育㊂这与Z h e n g等[32]的报道一致㊂输卵管和子宫作为受精㊁早期胚胎的发育和妊娠的场所,在动物繁殖过程中起着重要作用㊂S u等[15]通过检测子宫内膜上L C3蛋白的表达,发现子宫内膜发生的自噬影响胚胎的着床㊂本研究发现,在牦牛输卵管上皮黏膜和子宫内膜中检测到了L C3B蛋白的表达,表明L C3B蛋白在卵子的输送过程㊁胚胎着床和妊娠中发挥着作用㊂总之,本研究所制备的牦牛L C3B多克隆抗体能识别牦牛L C3B蛋白,抗体特异性良好,可用于以牦牛为模型的分子试验;免疫组化和免疫荧光结果显示,L C3B在牦牛生殖器官中的表达部位与其他动物一致,提示L C3B蛋白在牦牛繁殖活动中发挥着重要作用,同时也进一步加深了对自噬在牦牛生殖生理中作用的理解㊂4结论本研究成功克隆了牦牛L C3B基因(G e n B a n k 登录号:O P572227),构建了重组质粒p E T-32a-L C3B,成功制备了特异性良好的牦牛L C3B多克隆抗体,该抗体可特异性识别牦牛L C3B蛋白㊂牦牛L C3B蛋白在睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,且主要表达于细胞核周和细胞质中㊂研究结果提示,所制备的牦牛L C3B抗体可用于以牦牛为模型的分子试验,且发现L C3B蛋白参与牦牛生殖生理过程,为进一步研究牦牛L C3B蛋白和细胞自噬提供了基础资料㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E R E T I C V.A u t o p h a g y i n i n f l a mm a t i o n,i n f e c t i o n,a n d i mm u n o m e t ab o l i s m[J].I m m u n i t y,2021,54(3):437-453.[2] K UMA A,K OMA T S U M,M I Z U S H I MA N.A u t o p h a g y-m o n i t o r i n g a n d a u t o p h a g y-d e f i c i e n t m i c e[J].A u t o p h a g y,2017,13(10):1619-1628.5442畜牧兽医学报54卷[3] MA R U Y AMA T,N O D A N N.A u t o p h a g y-r e g u l a t i n gp r o t e a s e A t g4:s t r u c t u r e,f u n c t i o n,r e g u l a t i o n a n di n h i b i t i o n[J].J A n t i b i o t,2018,71(1):72-78.[4] HWA N G H J,HA H,L E E B S,e t a l.L C3B i s a nR N A-b i n d i n g p r o t e i n t o t r i g g e r r a p i d m R N Ad e g r a d a t i o n d u r i n g a u t o p h a g y[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):1436.[5] Y O S H I I S R,M I Z U S H I MA N.M o n i t o r i n g a n dm e a s u r i n g a u t o p h a g y[J].I n t J M o l S c i,2017,18(9):1865.[6] G A O H,K HAWA R M B,L I W.E s s e n t i a l r o l e o fa u t o p h a g y i n r e s o u r c e a l l o c a t i o n d u r i n g s e x u a lr e p r o d u c t i o n[J].A u t o p h a g y,2020,16(1):18-27.[7] G A O F Y,L I G P,L I U C,e t a l.A u t o p h a g y r e g u l a t e st e s t o s t e r o n e s y n t h e s i s b y f a c i l i t a t i n g c h o l e s t e r o lu p t a k e i n L e y d i g c e l l s[J].J C e l l B i o l,2018,217(6):2103-2119.[8] S U N Y C,WA N G Y Y,S U N X F,e t a l.T h e r o l e o fa u t o p h a g y d u r i n g m u r i n e p r i m o r d i a l f o l l i c l e a s s e mb l y[J].A g i n g(A l b a n y N Y),2018,10(2):197-211.[9] MA L Z,T A N G X R,G U O S,e t a l.m i R N A-21-3pt a r g e t i n g o f F G F2s u p p r e s s e s a u t o p h a g y o f b o v i n eo v a r i a n g r a n u l o s a c e l l s t h r o u g h A K T/m T O Rp a t h w a y[J].T h e r i o g e n o l o g y,2020,157:226-237.[10] O D O N N E L L L,S M I T H L B,R E B O U R C E T D.S e r t o l i c e l l s a s k e y d r i v e r s o f t e s t i s f u n c t i o n[J].S e m i n C e l l D e v B i o l,2022,121:2-9.[11] L I U C,WA N G H N,S HA N G Y L,e t a l.A u t o p h a g yi s r e q u i r e d f o r e c t o p l a s m i c s p e c i a l i z a t i o n a s s e m b l y i ns e r t o l i c e l l s[J].A u t o p h a g y,2016,12(5):814-832.[12] W A N G H N,W A N H F,L I X X,e t a l.A t g7i s r e q u i r e df o r a c r o s o m e b i og e n e s i s d u r i n g s p e r m a t o g e n e s i s i n m i c e[J].C e l l R e s,2014,24(7):852-869.[13] G AWR I L U K T R,K O C M,HO N G X M,e t a l.B e c l i n-1d e f i c i e n c y i n t h e m u r i n e o v a r y r e s u l t s i n t h er e d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n t o p r o m o t ep r e t e r m l a b o r[J].P r o c N a t l A c a d S c i U S A,2014,111(40):E4194-E4203.[14] Z HO U Z H,WA N G H Y,Z HA N G X W,e t a l.D e f e c t i v e a u t o p h a g y c o n t r i b u t e s t o e n d o m e t r i a le p i t h e l i a l-m e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n i n i n t r a u t e r i n ea d h e s i o n s[J].A u t o p h a g y,2022,18(10):2427-2442.[15] S U Y,Z HA N G J J,H E J L,e t a l.E n d o m e t r i a la u t o p h a g y i s e s s e n t i a l f o r e mb r y o i m p l a n t a t i o n d u r i n ge a r l y p r e g n a n c y[J].J M o l M e d,2020,98(4):555-567.[16] O E S T R E I C H A K,C HA D C HA N S B,P O P L I P,e ta l.T h e a u t o p h a g y g e n e A t g16L1i s n e c e s s a r y f o re n d o m e t r i a l d e c i d u a l i z a t i o n[J].E n d o c r i n o l o g y,2020,161(1):b q z039.[17] L I U W W,C H E N M,L I U C,e t a l.E p g5d e f i c i e n c yl e a d s t o p r i m a r y o v a r i a n i n s u f f i c i e n c y d u e t o WT1a c c u m u l a t i o n i n m o u s e g r a n u l o s a c e l l s[J].A u t o p h a g y,2023,19(2):644-659.[18] T A N G Z H,Z HA N G Z H,L I N Q Q,e t a l.H I F-1α/B N I P3-m e d i a t e d a u t o p h a g y c o n t r i b u t e s t o t h el u t e i n i z a t i o n o f g r a n u l o s a c e l l s d u r i n g t h e f o r m a t i o n o fc o r p u s l u t e u m[J].F r o n t C e l l D e v B i o l,2021,8:619924.[19] T S U K A M O T O S,K UM A A,M U R A K A M I M,e t a l.A u t o p h a g y i s e s s e n t i a l f o r p r e i m p l a n t a t i o n d e v e l o p m e n to f m o u s e e m b r y o s[J].S c i e n c e,2008,321(5885):117-120.[20] B A E K E N M W,W E C K M A N N K,D I E F E N T HÄL E RP,e t a l.N o v e l i n s i g h t s i n t o t h e c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n dr e g u l a t i o n o f t h e a u t o p h a g o s o m a l p r o t e i n s L C3A,L C3Ba n d L C3C[J].C e l l s,2020,9(10):2315.[21] WA N G W,C H E N Z X,B I L L I A R T R,e t a l.T h ec a r b o x y l-t e r m i n a l a m i n o a c id s re n d e r p r o-h u m a nL C3B m i g r a t i o n s i m i l a r t o l i p i d a t e d L C3B i n S D S-P A G E[J].P L o S O n e,2013,8(9):e74222. [22] N I E T O-T O R R E S J L,E N C A L A D A S E,HA N S E NM.L C3B p h o s p h o r y l a t i o n:a u t o p h a g o s o m e s t i c k e tf o r a r i d e t o w a r d t h e c e l l n u c l e u s[J].A u t o p h ag y,2021,17(10):3266-3268.[23]于慧敏,吴鹏杰,李南南,等.中华蜜蜂G A B A R A P基因克隆㊁生物信息学分析及原核表达载体的构建[J].中国畜牧兽医,2022,49(1):60-69.Y U H M,WU P J,L I N N,e t a l.C l o n i n g,b i o i n f o r m a t ic s a n a l y s i s a nd p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n o fG A B A R A P g e n e i n A p i s c e r a n a c e r a n a[J].C h i n aA n i m a l H u s b a n d r y&V e t e r i n a r y M e d i c i n e,2022,49(1):60-69.(i n C h i n e s e)[24]张加姿,李开心,于宝佳,等.小麦自噬相关因子A T G5的原核表达和抗血清制备[J].生物技术通报,2017,33(7):69-74.Z HA N G J Z,L I K X,Y U B J,e t a l.P r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n of w h e a t a u t o p h ag y-r e l a t e d f a c t o r A T G5a n d p r e p a r a t i o n o f i t s a n t i s e r u m i n r ab b i t s[J].B i o t e c h n o l o g y B u l l e t i n,2017,33(7):69-74.(i nC h i n e s e)[25]余振兴,朱倩,姚翠鸾.紫贻贝L C3B蛋白的原核表达及抗血清制备[J].水产学报,2017,41(4):498-505.Y U Z X,Z HU Q,Y A O C L.R e c o m b i n a n t e x p r e s s i o n6442。

环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制

项目名称：环境和遗传因素导致男性不育与出生缺陷的分子机制首席科学家：孙斐中国科学技术大学起止年限：2009.1至2013.8依托部门：中国科学院一、研究内容拟解决的关键科学问题精子异常是男性不育和父源性出生缺陷发生的主要原因。

阐明环境EDCs、遗传因子改变致精子异常的分子机制和机体对EDCs易感性差异的分子基础，揭示男性不育和出生缺陷的复杂病因及其发病机制是本项研究的关键科学问题。

其中包括：1. 代表性EDCs通过何种分子机制影响下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程的不同环节，从而引起精子异常的各类表型？2.遗传因子如染色体重组交换和联会改变引起精子发生停滞或染色体异常的分子机制和调控机理是什么？3.环境-基因交互作用导致男性不育的作用模式和机制是什么？4.精子异常导致常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生的机制是什么？主要研究内容1．环境因素导致精子异常的分子机制1.1代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系通过体内和体外研究代表性EDCs的代谢特征，阐明EDCs内暴露与精子异常的关联，寻找接触性生物标志物。

从我国目前环境污染的现状出发，并结合项目组多年的研究基础，遵循“有所为、有所不为”的原则，拟选择邻苯二甲酸酯类、烷基酚类/双酚系化合物、农药杀虫剂类、多环芳烃类、多溴联苯醚类、全氟代烃类和重金属类共七类为目标EDCs。

首先通过体外代谢特征和内分泌干扰活性分析并结合动物染毒模型，初步筛选出关键的EDCs因子；然后围绕这些关键EDCs，收集男性不育（精子异常）和职业暴露人群和正常男性对照病例，采集流行病学信息和精液、血液、尿液生物样本，分析EDCs内暴露水平和男性生殖内分泌功能，评价EDCs及其代谢与男性不育（精子异常）的相关性。

运用动物染毒模型结合基因芯片技术筛选与EDCs有关的代谢酶基因，利用酶反应学、细胞生物学和质谱分析技术，鉴定代表性EDCs的关键代谢酶、代谢特征，初步确定候选代谢产物。

Cullin蛋白在生殖系统中的研究进展

Cullin蛋白在生殖系统中的研究进展田烨;赵涵;陈子江【摘要】Cullin蛋白是Cullin-Ring E3类泛素连接酶(CRLs家族)的组成部分,可通过参与多种蛋白的泛素化修饰来调节蛋白活性,在多种生物学过程中发挥重要作用,目前在生殖系统中的研究日渐增多,本文总结了Culling家族各成员在配子发生与成熟、胚胎发育、生殖内分泌疾病及妇科肿瘤等生殖系统相关疾病中的作用.%Culling protein is a member of Cullin-Ring-based E3-ligases ( CRLs family) , which belong to E3 ubiquitin ligases. Cullin plays diverse and essential roles in many biological processes through mediating the ubiquitination of target proteins. This article summarizes the potential functions of Culling proteins in gamete genesis and maturation, embryo development, and reproductive related disorders.【期刊名称】《中国医学科学院学报》【年(卷),期】2013(035)001【总页数】5页(P125-129)【关键词】Cullin;生殖系统;疾病【作者】田烨;赵涵;陈子江【作者单位】山东大学附属省立医院生殖医学中心国家辅助生殖与优生工程技术研究中心生殖内分泌教育部重点实验室山东省生殖医学重点实验室,济南250021【正文语种】中文【中图分类】R71泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，E3泛素连接酶决定了泛素化过程的特异性。

高等真核生物体内存在1000多种E3泛素连接酶，其中Cullin-Ring类E3连接酶 (cullin-ring-based E3-ligases，CRLs)占主体地位［1］。

生殖医学研究及其应用

生殖医学研究及其应用近年来，随着生物技术和医学科学的不断进步，生殖医学研究及其应用已经成为一个备受关注的话题。

生殖医学研究主要包括辅助生育技术、基因工程技术以及生殖健康研究等。

这些技术的研究和应用，不仅为不育症患者提供了希望，还为生殖医学领域带来了新的发展机遇。

本文从多个角度对生殖医学研究及其应用进行探讨。

一、生殖健康的重要性随着社会经济的快速发展和生活方式的改变，人们的身体健康面临着多重风险。

生殖健康作为个体及家庭幸福的重要组成部分，也受到了日益增多的关注。

专家指出，不良的生活方式、环境污染、饮食习惯等因素，均会对人体生殖系统产生负面影响。

而生殖医学研究正是为了解决这些问题而存在。

二、辅助生育技术的发展辅助生育技术（ART）主要包括试管婴儿、卵胞质内单精子注射技术（ICSI）等。

其中，试管婴儿是目前比较常见的辅助生育技术之一，它通过体外受精和胚胎移植等步骤，使不育患者获得了生育的可能。

ICSI则是更进一步的技术，适用于精子质量低下等病因所导致的男性不育。

有研究表明，试管婴儿技术的成功率越来越高，可达到40%-50%。

而ICSI的成功率则更高，接近70%。

三、基因工程技术的应用基因工程技术主要包括基因编辑、细胞克隆、胚胎选择等。

通过基因编辑和细胞克隆技术，可以在受精前对胚胎进行基因筛查和修复，消除遗传病和某些遗传缺陷，为后代健康提供更好的保障。

而胚胎选择则可以根据胚胎的性别、染色体数目等特点，选择最有可能成活的胚胎进行试管婴儿过程。

虽然基因工程技术的应用仍存在争议，但在医学领域中已经取得了显著的成果。

它为患者提供了新的治疗方案，改善了许多不治之症状，并为医学科学带来了新的发展机遇。

四、生殖医学研究的未来随着科技的发展和人们对健康越来越重视，生殖医学研究的未来也充满希望。

除了现有的技术之外，还有一些新的生殖医学技术正处于研究和发展之中。

例如，胚胎植入的全基因组分析、蛋白质生物芯片技术等，这些技术的研究和应用，将为生殖医学领域注入新的活力和动力。

MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究进展

MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究进展王美姣【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2016(045)029【总页数】4页(P4144-4147)【关键词】MARCH;E3泛素连接酶;免疫调节;精子【作者】王美姣【作者单位】重庆医科大学附属第二医院妇产科重点实验室 400010【正文语种】中文【中图分类】R715.9膜相关RING-CH(membrane-associated RING-CH,MARCH)家族是近年发现的一类属于E3泛素连接酶的环指结构域家族，迄今已发现的MARCH家族成员有11种，分别是MARCH1～11。

MARCH家族的成员分布广泛，参与多种细胞功能，如免疫调节，蛋白质量控制和膜转运，内质网相关降解，内体蛋白质运输，线粒体动力学平衡和精子发生调控等[1-9]。

MARCH家族蛋白相关领域的研究正日益受到重视，因此，本文从MARCH家族蛋白的分类、生物学结构、表达及在免疫、生殖等生物学功能方面就MARCH家族最新研究进展作一综述，旨在为下一步的功能研究和临床研究提供依据。

MARCH家族蛋白结构相对保守，大多数MARCH家族蛋白具有类似结构：一个N端的环指结构域，又称RING结构域和零个、两个或多个C端的跨膜结构域(图1)。

RING结构域是此家族具有E3泛素连接酶作用的重要因素。

E3泛素连接酶的活性依赖于环指结构域，并通过其与E2泛素结合酶相连。

这个环指结构域具有特殊的C3HC4结构，由1个3条链组成的β折叠片层、1个α螺旋和两个大环构成。

每一环指结构域连有两个锌离子，RING结构域通过与这两个锌离子螯合稳定其结构。

MARCH家族的11个成员中有9个成员(MARCH1、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH8、MARCH9和MARCH11)含有疏水跨膜结构域，并定位于质膜和细胞器膜。

典型的MARCH蛋白特征是2个跨膜域，但MARCH5有4个跨膜域，MARCH6甚至有14个跨膜域，而MARCH7和MARCH10结构特征类似，均不含有跨膜域，其序列同源性仅存在于环指结构域[3,8,10]。

生物大数据技术在精子与卵子质量评估中的潜力

生物大数据技术在精子与卵子质量评估中的潜力概述：生殖健康是人类繁衍和生命延续的关键因素之一。

精子与卵子的质量评估对于成功的受孕和健康婴儿的诞生至关重要。

随着生物大数据技术的发展，我们可以利用大数据分析和人工智能等技术手段，深入研究精子和卵子的质量评估，为不孕不育症的治疗和辅助生殖技术的发展提供重要的科学依据。

一、精子质量评估精子质量是男性生殖健康的重要指标，对于成功的受孕至关重要。

传统的精液分析提供了一些基本指标，如精子浓度、活力和形态等，但这些指标并不能完全反映精子质量的真实情况。

通过生物大数据技术，我们可以分析并建立基于大样本数据的精子质量评估模型。

1. 基因组学研究：通过基因组学研究，可以了解精子的基因组变异情况和染色体异常。

染色体异常是导致不孕不育的常见原因之一，通过对大量精子样本的基因组学分析，可以揭示染色体异常与精子质量之间的关联，为精子质量评估提供更精确的指标。

2. 蛋白组学研究：蛋白质在精子的运动、受精过程中都扮演着重要角色。

通过蛋白质组学研究，可以分析精子中蛋白质的组成和变化，进一步了解精子质量与蛋白质表达的关系。

通过大数据分析和机器学习等方法，可以建立精子蛋白质组学模型，用于精子质量快速评估。

3. 转录组学研究：通过转录组学研究，可以分析精子中基因的表达情况和调控网络。

转录组学研究可以揭示精子质量与基因表达的关系，为不孕不育症的治疗提供新的靶点和策略。

基于大数据的转录组学模型可以准确预测精子质量，为辅助生殖技术的选择提供科学依据。

二、卵子质量评估卵子质量是女性生殖健康的重要指标，对于成功的受孕和健康婴儿的诞生至关重要。

传统的卵子质量评估主要依靠年龄和体外受精成功率等指标，但这些指标并不能完全反映卵子质量的真实情况。

通过生物大数据技术，我们可以深入研究卵子的质量评估。

1. 卵泡液研究：卵泡液是卵泡内液体，与卵子质量密切相关。

通过对卵泡液的蛋白质组学和代谢物组学研究，可以了解卵子的生物学特征和质量情况。

男性生殖道感染与免疫功能相关机制分析

男性生殖道感染与免疫功能相关机制分析引言男性生殖道感染是一种常见的疾病，它会给患者带来身体和心理上的双重困扰。

免疫功能在维护机体健康中起着重要作用，而男性生殖道感染与免疫功能之间存在着密切的联系。

随着对男性生殖道感染与免疫功能相关机制的研究逐渐深入，人们对于这种关系的认识也越来越清晰。

本文旨在分析男性生殖道感染与免疫功能之间的相关机制，并探讨免疫功能在男性生殖道感染中的作用。

通过对现有研究进展的总结和归纳，我们将揭示免疫功能在男性生殖道感染治疗中的潜在价值。

同时，我们还将介绍研究方法与实验设计，以期为进一步深入研究提供参考。

通过本文的研究，我们希望能够增加对男性生殖道感染与免疫功能相关机制的理解，为临床治疗提供新的思路和方法。

最终，我们的目标是改善男性生殖道感染患者的生活质量，并为预防和控制这一疾病做出贡献。

男性生殖道感染的概述男性生殖道感染是指细菌、病毒、真菌或寄生虫等微生物侵入男性生殖道并引起感染的一类疾病。

这些感染可以发生在尿道、前列腺、附睾、精囊和睾丸等部位，给患者带来不同程度的不适和症状。

常见的男性生殖道感染包括尿道炎、前列腺炎、附睾炎、精囊炎和睾丸炎等。

这些感染常常与不洁性行为、性伴侣变换频繁、性器官损伤以及免疫功能低下等因素有关。

症状表现为尿频、尿急、尿痛、排尿困难、阴囊不适、性欲减退等。

男性生殖道感染对患者的生活质量产生了很大的影响，并可能导致不育、性功能障碍等严重后果。

因此，对男性生殖道感染的研究和治疗具有重要意义。

本文将从免疫功能的角度对男性生殖道感染进行分析，探讨免疫功能与男性生殖道感染的关系，并进一步研究免疫功能调节机制在男性生殖道感染治疗中的应用前景。

通过深入了解男性生殖道感染的概述，我们可以更好地理解其病因和发病机制，为改善男性生殖道感染的治疗提供新的思路和方法。

免疫功能与男性生殖道感染的关系免疫功能在维持机体健康中发挥着重要作用，并与男性生殖道感染之间存在密切的关系。

蛋白质组学在附睾研究中的应用

Ｍｉ。。ｈｎａｇＡｒｕｔｒｌＵｉｒｔ，ｈｎａｇ１０６，ｈａｕｈｎＣｎｅｆｒＡｉａｉａｅＣｎｎ（ＳｅｙｎｇｉｌａｎｖｓｙＳｅｙｎ１１１Ｃｉ；ｓｕｅｔｏｎｍｌｓｓｏ — ｃｕｅｉｎＦｒＤｅ
ｔｅｔｒｅｓｆｒｃｎｒｃｐｉｎｏｙｐｏｉｅｉｓｇｔｔｈｅｕｉｕｅｐｎｉｉｉｅｆｔｅｅｉｉｙｓｉｏｂａｇｔｏｏｔａｅｔｏｒｍａｒｖｄｎｉｈｏｔｎｑｅｒｓｏｓｂｌｔｓｏｈｐｄｄｍｉｎｉ
附睾作为男性生殖系统中的一个重要的附属性器官，是精子成熟和贮存的场所。精子从睾丸中产生后，并不具备受精能力并且缺乏运动性，它需要经过一根高度盘绕折叠的狭长的附睾管逐渐成熟。通常将附睾分成头（ａｕ）体（ＯＵ）ｃｐｔ、ＣＹＳ和尾（ａｄ）ｐｃｕａ三部分（１，图）头部和体部主要负责精子的成熟，而尾部则行使贮存精子的功能。附睾基因表达呈现出高度的区域性。附睾头部已被证明是蛋白合成和分
ｓｅｍｔｒｔｎａｄｓｏａｅｎｔｇｎｘｒｓｉｎｉｈｇｌｅｉｎｓｅｉｃ，Ｓｔｍａｂｎｉｅｐｒｍａｕａｉｎｔｒｇ，ａｄｉｅｅｅｐｅｓｏｓｉｈｙｒｇｏ —ｐｃｆｏｓｉＯｉｙｅａｄａｌｍｏｅｒｐｏｅｍｉｓｓｅｉｌｒｄｆｅｅｔｒｔｏｃｔｄ．Ｔｉｐｐｒｉｅｒｅｔｄｃｉｎｏｄｌｒｔｏｃ，ｅｐｃａｌｆｉｒｎｉｐｏｅｍｉｓｓｕｙｈｓａｅｖｓａｂｆｎｒｕｔｆｏｆｙｏｌａｇｉｉｏｏ

利用H4和SAX-2蛋白质芯片技术筛查少精子症患者精浆标志物

利用H4和SAX-2蛋白质芯片技术筛查少精子症患者精浆标志物杨欢;张杰;张炜;龙文;张孝斌【期刊名称】《中华男科学杂志》【年(卷),期】2006(12)1【摘要】目的:通过蛋白质组学技术筛查少精子症患者精浆中特异性生物标志物。

方法:用H4和SAX-2蛋白质芯片结合SELD I-TOF-MS对20例少精子症患者及20例生育男性精浆样本进行检测,比较两者间蛋白质图谱表达差异。

结果:在H4蛋白质芯片上,少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比,有1处蛋白质峰明显增高,差异有显著性(P<0.05),其相对分子质量(Mr)为11 507.4,有1处蛋白质峰明显降低,差异有显著性(P<0.05),其Mr为11 022.9;在SAX-2蛋白质芯片上,少精子症患者精浆与生育男性精浆蛋白质图谱相比有1处蛋白质峰明显增高,差异有显著性(P<0.05),其Mr为16 751.6。

结论:少精子症患者精浆中特异性蛋白质的发现,对探究由少精子症引起的男性不育机制及其临床筛查皆具重要意义。

【总页数】4页(P39-42)【关键词】少精子症;精浆;生物标记物;蛋白质芯片;蛋白质组学【作者】杨欢;张杰;张炜;龙文;张孝斌【作者单位】武汉大学人民医院泌尿外科;武汉大学人民医院生殖医学中心【正文语种】中文【中图分类】R698.2【相关文献】1.蛋白质芯片检测少精症患者精浆的临床意义 [J], 杨欢;张杰;张炜;龙文;张孝斌2.应用蛋白质芯片飞行时间质谱仪研究弱精子症患者精浆差异蛋白表达 [J], 徐建新;朱涛;吕胜启;方登攀3.TMT筛查与生物信息学分析少精子症患者精子差异表达蛋白质 [J], 努尔比亚·阿力甫; 马文静; 西尔艾力·买买提; 张盼盼; 蒋丹丹; 童卓云; 白生宾; 阿地力江·伊明4.应用蛋白质芯片CM10检测弱精子症患者精浆标志物 [J], 徐建新;吕胜启;朱涛;方登攀5.严重少精子症患者与正常生育男性精浆蛋白质群比较分析 [J], 白洁;孙玲;朱红;张立文;马俊龙;丛玉隆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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Ｉ型受体缺陷。谷氨酸在哺乳动物中枢神经系统内是一种主要的兴奋性神经递质，受体Ｎ其Ｒ由Ｎ１亚Ｒ
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和学习记忆方面起决定作用 ¨ 其受体的ＡＡ亚，ＭＰ型易受不同功能组成影响并调节ｃａｒｌｈｉ赖性胞ｔｎ依吞，有助于各种形式突触可塑性 ¨ 。新发现一种主
重要如同学习和建立新记忆所需要的一样。ｎＲＥ，ＤｕｒＳ，ＭｃｎｓＪｅ１ｈｅｒＪＭａｕＲ，ｔａ．ＥｘｒｓｉｎｏｌｉｌｐｅｓｏｆｍｕｔｐｅＵＮＣ
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梢动作电位时ｃ浓度升高可激活ＣＭ腺苷酸环化ａａ
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ｏｙｏｉ．Ｎｕｏ，０２３（）：９６１ｃｔｓｅｒｎ２０，４４５９— １ｓ
９
Ｈａ，ＲｈｅＪｎＷｅＳ，ＭａｉｖＡ，ｅ１ｘｍｏｔ．Ｎ —ｇｙｏｙａｉｎｉｅｓｎｉｌｆｒａｌｅｓｌｔｓｓｅｔａｏｏ
亚型及钙调素储积池，能在学习、忆和神经可塑可记性方面起重要作用Ｊ。
ｖｓｕａｒｅｉｇｏｎｐｏｇｎＩｅｉｌｔｇｔｆｙａｔａｍｉ．Ｎｅｒｎ２０，４（）５— ｃｒａｎｓｔｕｏ，０４１１：８
９９ＳｇｔｕｉＳ，Ｈａ，ＢｕｚＳ，ｅ１ＳｎｐｏａｍｉＩｓａｐａｍａｍｅ — ａｎＷｔｔａ．ｙａｔｔｇｎＶＩｌｓｍａ
医研杂２９月学究志０年５第３卷第５０８期
其他涉及突触可塑性的突触蛋白有ＧＰ一４、Ａ３ＣＭＫｌ谷氨酸受体和神经颗粒素ｎｕｏｒｎｎａＩ、ｅｒｇａｉ。突触前蛋白ＧＰ一３是一种生长相关磷酸化蛋白，Ａ４其磷酸盐是ＰＣ一个亚型与学习记忆有关，神经元Ｋ在生长发育、突再生和神经元出芽方面高度表达，轴成熟神经元内其基因表达很可能对突触结构重建功能