牛腹泻病毒的PCR检测方法

牛腹泻病毒的PCR检测方法

作者：林春丽张海波陈红霞等

来源：《兽医导刊》 2017年第4期

本研究是通过PCR 技术对新生牛是否带有牛病毒性腹泻病毒进行检验，排除其患病牛，制

备无病毒血清，进一步用于兽药的研制。

一、材料与方法

（一）材料

1. 主要试剂。RNAiso plus 购自Takara 公司；氯仿、无水乙醇、75% 酒精，DEPC 水、ddH2O、DNAMarker 购自TakaRa 公司；核酸染料购自百泰克有限公司；高速低温离心机购自Sigma 公司；PCR 扩增仪为美国伯乐公司，型号为S1000 ；凝胶成像仪。

2. 样品。共30 个样本包括：28 个未知样本均为新生牛初血清；空白对照；阴性对照和

阳性对照。

（二）方法

1.PCR 检测。PCR 技术，即聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是由Saiki 发明，其技术对世界生物医学的巨大推动作用，获得了1992 年的诺贝尔医学奖。由美

国PE-Cetus 公司的Kary BanksMulis 在1985 年建立的。这项技术可在试管内的经数小时反

应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研

究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。它不仅是DNA 分析最常用的技术，而且在DNA 重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。二、操作步骤。

（一）样品提取前准备

1. 器材准备。1 000μl 枪，200μl 枪，50μl 枪、1 000μl 枪头，200μl 枪头，75% 酒精棉，止血钳，EP 管，EP 管架等。

2. 提取步骤。

（1）取2 ml 无菌无酶EP 管，加入RNA Siso Plus（裂解液）900μL（加液过程中如枪

头接触到EP 管壁或其他物品，需更换枪头），再分别吸取待测血清样品、阳性对照、阴性对

照各200μL 于EP 管中，每加一次样品换一次枪头。轻轻上下颠倒摇匀，至底部无沉淀，颜色均一，冰盒中静置5min。将已检测样品放回-20℃冷冻保存。（阴性对照放在中间顺序）

（2）12 000 r/min、4℃，离心1 min。加入200μL的氯仿，上下颠倒20 次混匀，至颜

色均一为乳粉色，冰盒中静置8 min。

（3）12 000 r/min、4℃、离心15 min。在离心剩余2 min 时准备新1.5 ml 无菌无酶EP 管，加入800μl-20℃预冷的异丙醇。从离心机轻拿轻放取出EP 管。（离心后液体分为三层，底层为有机溶液层，中层蛋白质，上层上清液含RNA）。吸取400μl 上清液（分两次200μl 吸取，吸取上层液体时切勿碰触或吸取中层蛋白质），放入事先加好异丙醇的新1.5 ml EP 管中，轻轻上下颠倒20 次摇匀，-20℃静置20 min。

（4）12 000 r/min、4 ℃、离心15 min。离心机中EP 管摆放方向保持一致，以使沉淀在管底同一侧。若离心后不出沉淀继续-20℃放置10 ～ 20 min 后离心。弃上清，保留沉淀。沉

淀即为RNA 提取物，量很少，在倒上清液时注意，切勿将沉淀倒出。

（5）加入1 ml 75% 乙醇（DEPC 水配制，加乙醇过程中如枪头接触到EP 管壁或其他物品，需更换枪头），轻轻上下颠倒，洗涤沉淀，将沉淀悬浮起来即可。（6）7 500 r/min、4℃、离心5 min。弃上清，保留沉淀。用200μl 枪头将管底残余乙醇液体吸净，吸取一个样品换一个枪头，注意不要碰触和吸取到RNA 沉淀。

（7）EP 管中的RNA 在超净工作台中室温下自然干燥10 min。加入20μL 的无RNase 水（将水加到沉淀上），轻弹溶解沉淀，短期使用-20℃保存，长期使用保存于-70℃下。

（二）引物设计

根据Genebank 数据库，使用引物设计软件Primeier 5.0 设计BVDV 特异性引物如下。（三）电泳分析1. 制胶。称取1.35 g 琼脂糖粉放入锥形瓶中（注：倒入过程中避免琼脂糖粉末粘在锥形瓶壁上。）加入90 ml 1*TBE 溶液，微波炉加热无絮状物至完全溶解（注：至少沸

腾3 次），取出锥形瓶后，冷却至60℃左右，加入17μL 的核酸染料，摇至彻底混匀后倒入

带有梳子的胶槽中（轻轻混匀即可，避免气泡产生），冷却凝固40 min。

2. 电泳。

（1）将制好的胶放入电泳槽中，倒入1*TBE，液位高于胶面2 mm。

（2）用移液枪取20μl 6×Loading Buffer 于载玻片上，并取3μl 加至PCR 产物管中

反复吹打三次混匀后吸取10μl 混合液加入琼脂糖凝胶点样孔中，从左面第二个孔开始依次点

样品、阴性对照与阳性对照，最后取7μl marker 点于第一个孔中。

（3）将电泳仪正负极对应连接，开启电泳仪电源开关，在120V 电压下电泳50 min。将跑完的琼脂糖凝胶从电泳槽取出，放在凝胶成像仪中，进行观察。

三、结果判定

图2 未感染与感染样本对照

如图2，12 号为阴性对照，无明亮的；24 号为阳性对照，出现明亮的条带，证明实验成立。剩余样本在316 bp 处，8 号、9 号、10 号、11 号、20 号、21 号、23号出现明亮的条带，说明该样本血清样本染牛腹泻病毒。

四、影响PCR 检测因素

（一）dNTP 的质量与浓度

1.dNTP 的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系。dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性

失去生物学活性。在PCR 反应中，dNTP 应为50 ～ 200 umol/L，尤其是注意4 种dNTP 的浓

度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时( 偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。dNTP 能与Mg2+ 结合，使游离的Mg2+ 浓度降低。

2.Mg2+ 浓度。Mg2+ 对PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR 反应中，各种dNTP 浓度为200 umol/L 时，Mg2+ 浓度为1.5 ～ 2.0 mmol/L 为宜。