土壤中脂肪酶产生菌的筛选_鉴定及脂肪酶基因的克隆
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罗丹明 B 显色培养基 :将橄榄油与 2 %的聚乙 烯醇溶液按 1∶3 ( v / v)混合 , 4℃静置 1 h后于组织搅 拌机中高速匀浆 3 m in即得 ,加入量为每 100 m l培 养基中加入 12 m l橄榄油乳化液 。在配制好的初筛 培养基中加入 10 m l ( 0. 1 mg /m l)罗丹明 B 作为指 示剂 。
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生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2009年第 8期
榄油 ,蒸馏水 100 m l。121℃蒸汽灭菌 20 m in。 平板初筛培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 2 g, NaC l 0. 05
g,M gSO4 ·7H2O 0. 05 g, K2 HPO4 0. 1 g,琼脂 1. 2 ～ 1. 8 g,用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH 为 7. 0,灭菌后再加 入橄榄油聚乙烯醇乳化液 。
在上述反应条件下 ,以每分钟催化水解脂肪产 生 1μmol的脂肪酸所需要的酶量定义为 1 个脂肪 酶活力单位 (U ) ,单位为 U /m l。 11216 菌株生长曲线的绘制 用接种环挑取平板 上少许细菌 B2,接种到装有 250 m l LB 液体培养基 的 500 m l三角瓶中 ,此时 LB 液体培养基清澈无比 。 于 30℃, 150 r/m in 下摇床培养 。取刚接种时的样 品作为空白对照 。前 8 h每 2 h取样一次 , 8 h后每 隔 1 h取样一次 , 20 h后每隔 2 h取样一次 ,每次取 样 5 m l,取好的样品放在 4℃冰箱中保存 ,待取样时 间至 52 h后 ,将所有样品用可见分光光度计波长 600 nm 测定 OD 值 。以培养时间为横坐标 , OD 值 作纵坐标绘制生长曲线 。 11217 菌种鉴定 根据文献 [ 9 ]和 [ 10 ]的方法进 行特性 鉴 定 , 并 以《伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 (第 8 版 ) 》[ 11 ]作为分类参考 。并对活性较高的菌株 B2 进行 16S rDNA 特征片段进行 PCR及测序 。 11218 脂肪酶基因的克隆 脂肪酶基因的扩增及 纯化 : K1、K2 两对引物扩增体系 20 μl包括 : 10 × Taq DNA 聚合酶 buffer 2 μl,基因组 DNA 2 μl, 5′2
革 、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应 用 ,充分显示了其巨大的应用潜力 [ 3, 4 ] 。
目前国内外对野生微生物脂肪酶的研究与开发
较为活跃 。报道了新疆克拉玛依及石河子地区高脂 肪酶活性细菌菌株的筛选 [ 5～7 ]分离 、鉴定以及相应 脂肪酶基因的克隆等方面的研究结果 。
1 材料与方法
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN
2009年第 8期
土壤中脂肪酶产生菌的筛选 、鉴定及脂肪酶基因的克隆
玄国营 陈芳 李予霞 高剑峰
(石河子大学生命科学学院 ,石河子 832003)
摘 要 : 以橄榄油为惟一碳源进行富集培养 、以罗丹明 B为指示剂的平板进行初筛 ,摇瓶复筛得到产脂肪酶菌株 ;利用 滴定法 、平板扩散法以及转酯反应试验 ,最终筛选出具有较高转酯活性脂肪酶的菌株 B2。通过对 B2进行形态学观察 ,生理生 化测定以及 16S rDNA 特征片段比较分析 ,初步确定 B2为克雷伯氏菌属 ( Klebsiella sp. ) 。通过特定引物 PCR 扩增得到 B2菌 株两个脂肪酶基因 K1和 K2。利用丙酮法和 (NH) 2 SO4 沉降法得到 B2菌株体内的胞内酶 ,以叔丁醇为溶剂 ,催化棉籽油与甲 醇反应 ,经过薄层层析和高效液相检测产物为生物柴油 。
收稿日期 : 2009204230 基金项目 :兵团博士资金项目 作者简介 :玄国营 (19812) ,男 ,山东潍坊人 ,硕士生 ,从事生物能源及分子免疫和育种方面研究 ; E2mail: tutuwaityou@163. com 通讯作者 :高剑峰 ,男 ,教授 ,博士 , E2mail: 13519931689@163. com
2009年第 8期
玄国营等 :土壤中脂肪酶产生菌的筛选 、鉴定及脂肪酶基因的克隆
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Primer(10 pmol/L ) 1μl, 3′2Primer( 10 pmol/L ) 1μl, dNTP m ix ( 1. 25 mM ) 0. 8 μl, M gC l2 ( 25 mM ) 1. 2 μl, Taq DNA 聚合酶 ( 1 U /μl) 0. 5 μl, ddH2 O 11. 5 μl。引物 K1、K2 PCR 扩增反应条件 : 94℃预变性温 度 5 m in; 94℃变性温度 30 s; 54℃退火温度 50 s; 72℃延伸温度 60 s;反应 30个循环 ,延伸 7 m in后终 止反应 。扩增完毕用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 ,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化 。
菌水 中 稀 释 成 10 - 1 , 依 次 稀 释 到 10 - 7 , 取 10 - 2 , 10 - 6 , 10 - 7三个梯度各 200μl,分别涂布在罗丹明 B 显色培养基中 。30℃培养箱中培养 2～3 d。 11213 复筛方法 初筛培养后 ,在紫外灯波长为 365 nm 下观察 ,将变色圈较大的菌落划线分离纯 化 ,挑至肉汁胨斜面培养基上保藏 。将纯化好的菌 株转接到装有 30 m l复筛培养基的 250 m l三角瓶 中 , 150 r/m in, 30℃培养 48 h。 11214 脂肪酶提取 主要包括胞内酶粗提 [ 8 ]和胞 外酶提取 ,胞内酶用于酶活测定 。 11215 脂肪酶活力测定 ( 1 )平板扩散法检测酶 活 :在已制成的固体琼脂平板上用打孔器开孔 ,直径 为 3. 5 mm。打孔后将 30μl待测酶液加入孔中 ,置 于 30℃恒温培养箱中一定时间 ,定时观察孔周围的 变色情况 。 ( 2 )酸碱滴定检测酶活 : 将橄榄油乳化 液作为反应的底物 ,将乳化液与 pH7. 2的 Tris2C l缓 冲液以体积比为 4 ∶5 混合 ,作为反应液 。在反应液 加入 1 m l酶液启动反应 , 40 ℃反应 10 m in,加入 15 m l无水乙醇终止反应 ,再加 20 m l无菌水稀释体系 。 对照组中应在加酶液之前先加无水乙醇 。
关键词 : 生物柴油 克雷伯氏菌 脂肪酶 脂肪酶基因
The Screen ing, Identif ica tion and L ipa se Gene C lon ing of So il L ipa se Produc ing Stra in
Xuan Guoying Chen Fang L i Yuxia Gao J ianfeng
111 材料 11111 土样 土样采集于新疆克拉玛依油田 ,新疆 石河子汇昌粮油公司等地 ,共 25份土样 。 11112 培养基组成 富集培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 1 g, NaC l 0. 05 g, M gSO4 ·7H2 O 0. 01 g, K2 HPO4 0. 1 g。用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH 为 7. 0,再加入 1%橄
( College of L ife S cience of S h ihezi U niversity, Sh ihezi 832003)
Ab s trac t: U sing olive oil as sole carbon source in enrichment culture, and Rhodam ine B as indicator to screening, one lipase2 p roducing strain B2 w ith higher lipase activity were screened. B2 strain was identified as Klebsiella sp. according to morphological ob2 servation, determ ination of physiological and biochem ical. The part 16S rDNA was amp lified by PCR and sequenced. B y designing specific p rimers, two lipase genes K1 and K2 in B2 strain was amp lified by PCR and sequenced. The lipase can catalyze cotton oil and methanol into biodiesel, when tert2butyl alcohol as solvent and acetone and (NH) 2 SO4 sedimentation method involved in.
Ke y wo rd s: B iodiesel Klebsiella sp. L ipase L ipase gene
脂肪酶 ( lipase, EC3. 1. 1. 3 ) ,又称三酰基甘油 酰基水解酶 , 广泛存 (在于动植物和微生物体内 。 脂肪酶不仅可水解三酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪 酸 (其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘 油 、甘油和游离脂肪酸 ) ,并且能催化水解反应的逆 反应酯化反应 [ 1 ] 。目前脂肪酶生产主要有提取法 和微生物发酵法 [ 2 ] 。由于微生物脂肪酶种类多 ,作 用温度及 pH 范围比动植物脂肪酶广 、底物专一性 高 ,并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂 ,因 此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来 源 。近年来 ,非水相酶学和界面酶学的研究进一步 拓展了脂肪酶的应用领域 、利用脂肪酶在有机相催 化的各种反应可以合成许多高价值产物 ,在食品 、皮
复筛培养基 : NaC l 1. 0 g,蛋白胨 1. 0 g,酵母膏
0. 5 g, H2 O 100 m l, pH7. 0 11113 扩增引物 利用 Primer5. 0引物设计工具 , 针对筛选到的菌株 ,在 GenB ank中 BLAST相应脂肪 酶基因的保守区域进行引物设计 ,共设计两对引物 , 分别是 K1 和 K2。 K1: F5′2GTGTCATGTGTCTCTGG AGC23′, R5′2TTAAAAATTGGCGCTGACCC23′; K2: F5′2ATGAAGCATCTATTTCGA 23′, R5′2TCACGGTTT2 GTCCGCCTG23′。由北京华大基因研究中心合成 。 11114 主要试剂 橄榄油 、聚乙烯醇 (聚合度 1750 ±50) 、Rhodam ine B 等购自上海国药集团 。 PCR 反 应所需的试剂购自 Fermentas公司 , pGM 6K高速冷冻离心机购自德 国 Sigma公司 , B io2Rad凝胶成像系统购自美国 B io2 Rad公司 , Agilent 1200 高效液相色谱仪购自美国 Agilent公司 , PCR 扩增仪购自美国 B io2Rad 公司 , B io2Rad电泳槽购自美国 B io2Rad公司 。 112 方法 11211 富集方法 将采集的土样各称 5 g溶于 10 m 无菌水中 ,充分摇匀 ,静置片刻 ,让较大土壤粒沉 淀后 ,取上层液体 1 m l于装有 20 m l富集培养基的 100 m l三角瓶中 , 30℃, 180 r/m in,振荡培养 2 d后 , 将富集培养基摇匀 ,取 1 m l转接到新的富集培养基 中 ,二次富集 ,同样条件下振荡培养 2 d 后 ,进行 3 次富集 。在培养的过程中 ,每 24 h要观察培养基的 pH下降情况 ,理论上 pH 下降越大越优 。用 6 mol/ L Na2 CO3 调至初始 pH 继续培养 。 11212 初筛方法 取富集菌液 1 m l加入到 9 m l无
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生物技术通报 B io techno logy B u lle tin
2009年第 8期
榄油 ,蒸馏水 100 m l。121℃蒸汽灭菌 20 m in。 平板初筛培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 2 g, NaC l 0. 05
g,M gSO4 ·7H2O 0. 05 g, K2 HPO4 0. 1 g,琼脂 1. 2 ～ 1. 8 g,用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH 为 7. 0,灭菌后再加 入橄榄油聚乙烯醇乳化液 。
在上述反应条件下 ,以每分钟催化水解脂肪产 生 1μmol的脂肪酸所需要的酶量定义为 1 个脂肪 酶活力单位 (U ) ,单位为 U /m l。 11216 菌株生长曲线的绘制 用接种环挑取平板 上少许细菌 B2,接种到装有 250 m l LB 液体培养基 的 500 m l三角瓶中 ,此时 LB 液体培养基清澈无比 。 于 30℃, 150 r/m in 下摇床培养 。取刚接种时的样 品作为空白对照 。前 8 h每 2 h取样一次 , 8 h后每 隔 1 h取样一次 , 20 h后每隔 2 h取样一次 ,每次取 样 5 m l,取好的样品放在 4℃冰箱中保存 ,待取样时 间至 52 h后 ,将所有样品用可见分光光度计波长 600 nm 测定 OD 值 。以培养时间为横坐标 , OD 值 作纵坐标绘制生长曲线 。 11217 菌种鉴定 根据文献 [ 9 ]和 [ 10 ]的方法进 行特性 鉴 定 , 并 以《伯 杰 氏 细 菌 鉴 定 手 册 (第 8 版 ) 》[ 11 ]作为分类参考 。并对活性较高的菌株 B2 进行 16S rDNA 特征片段进行 PCR及测序 。 11218 脂肪酶基因的克隆 脂肪酶基因的扩增及 纯化 : K1、K2 两对引物扩增体系 20 μl包括 : 10 × Taq DNA 聚合酶 buffer 2 μl,基因组 DNA 2 μl, 5′2
革 、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应 用 ,充分显示了其巨大的应用潜力 [ 3, 4 ] 。
目前国内外对野生微生物脂肪酶的研究与开发
较为活跃 。报道了新疆克拉玛依及石河子地区高脂 肪酶活性细菌菌株的筛选 [ 5～7 ]分离 、鉴定以及相应 脂肪酶基因的克隆等方面的研究结果 。
1 材料与方法
·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO G Y BULL E T IN
2009年第 8期
土壤中脂肪酶产生菌的筛选 、鉴定及脂肪酶基因的克隆
玄国营 陈芳 李予霞 高剑峰
(石河子大学生命科学学院 ,石河子 832003)
摘 要 : 以橄榄油为惟一碳源进行富集培养 、以罗丹明 B为指示剂的平板进行初筛 ,摇瓶复筛得到产脂肪酶菌株 ;利用 滴定法 、平板扩散法以及转酯反应试验 ,最终筛选出具有较高转酯活性脂肪酶的菌株 B2。通过对 B2进行形态学观察 ,生理生 化测定以及 16S rDNA 特征片段比较分析 ,初步确定 B2为克雷伯氏菌属 ( Klebsiella sp. ) 。通过特定引物 PCR 扩增得到 B2菌 株两个脂肪酶基因 K1和 K2。利用丙酮法和 (NH) 2 SO4 沉降法得到 B2菌株体内的胞内酶 ,以叔丁醇为溶剂 ,催化棉籽油与甲 醇反应 ,经过薄层层析和高效液相检测产物为生物柴油 。
收稿日期 : 2009204230 基金项目 :兵团博士资金项目 作者简介 :玄国营 (19812) ,男 ,山东潍坊人 ,硕士生 ,从事生物能源及分子免疫和育种方面研究 ; E2mail: tutuwaityou@163. com 通讯作者 :高剑峰 ,男 ,教授 ,博士 , E2mail: 13519931689@163. com
2009年第 8期
玄国营等 :土壤中脂肪酶产生菌的筛选 、鉴定及脂肪酶基因的克隆
141
Primer(10 pmol/L ) 1μl, 3′2Primer( 10 pmol/L ) 1μl, dNTP m ix ( 1. 25 mM ) 0. 8 μl, M gC l2 ( 25 mM ) 1. 2 μl, Taq DNA 聚合酶 ( 1 U /μl) 0. 5 μl, ddH2 O 11. 5 μl。引物 K1、K2 PCR 扩增反应条件 : 94℃预变性温 度 5 m in; 94℃变性温度 30 s; 54℃退火温度 50 s; 72℃延伸温度 60 s;反应 30个循环 ,延伸 7 m in后终 止反应 。扩增完毕用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物 ,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化 。
菌水 中 稀 释 成 10 - 1 , 依 次 稀 释 到 10 - 7 , 取 10 - 2 , 10 - 6 , 10 - 7三个梯度各 200μl,分别涂布在罗丹明 B 显色培养基中 。30℃培养箱中培养 2～3 d。 11213 复筛方法 初筛培养后 ,在紫外灯波长为 365 nm 下观察 ,将变色圈较大的菌落划线分离纯 化 ,挑至肉汁胨斜面培养基上保藏 。将纯化好的菌 株转接到装有 30 m l复筛培养基的 250 m l三角瓶 中 , 150 r/m in, 30℃培养 48 h。 11214 脂肪酶提取 主要包括胞内酶粗提 [ 8 ]和胞 外酶提取 ,胞内酶用于酶活测定 。 11215 脂肪酶活力测定 ( 1 )平板扩散法检测酶 活 :在已制成的固体琼脂平板上用打孔器开孔 ,直径 为 3. 5 mm。打孔后将 30μl待测酶液加入孔中 ,置 于 30℃恒温培养箱中一定时间 ,定时观察孔周围的 变色情况 。 ( 2 )酸碱滴定检测酶活 : 将橄榄油乳化 液作为反应的底物 ,将乳化液与 pH7. 2的 Tris2C l缓 冲液以体积比为 4 ∶5 混合 ,作为反应液 。在反应液 加入 1 m l酶液启动反应 , 40 ℃反应 10 m in,加入 15 m l无水乙醇终止反应 ,再加 20 m l无菌水稀释体系 。 对照组中应在加酶液之前先加无水乙醇 。
关键词 : 生物柴油 克雷伯氏菌 脂肪酶 脂肪酶基因
The Screen ing, Identif ica tion and L ipa se Gene C lon ing of So il L ipa se Produc ing Stra in
Xuan Guoying Chen Fang L i Yuxia Gao J ianfeng
111 材料 11111 土样 土样采集于新疆克拉玛依油田 ,新疆 石河子汇昌粮油公司等地 ,共 25份土样 。 11112 培养基组成 富集培养基 : (NH4 ) 2 SO4 0. 1 g, NaC l 0. 05 g, M gSO4 ·7H2 O 0. 01 g, K2 HPO4 0. 1 g。用 6 mol/L Na2 CO3 调 pH 为 7. 0,再加入 1%橄
( College of L ife S cience of S h ihezi U niversity, Sh ihezi 832003)
Ab s trac t: U sing olive oil as sole carbon source in enrichment culture, and Rhodam ine B as indicator to screening, one lipase2 p roducing strain B2 w ith higher lipase activity were screened. B2 strain was identified as Klebsiella sp. according to morphological ob2 servation, determ ination of physiological and biochem ical. The part 16S rDNA was amp lified by PCR and sequenced. B y designing specific p rimers, two lipase genes K1 and K2 in B2 strain was amp lified by PCR and sequenced. The lipase can catalyze cotton oil and methanol into biodiesel, when tert2butyl alcohol as solvent and acetone and (NH) 2 SO4 sedimentation method involved in.
Ke y wo rd s: B iodiesel Klebsiella sp. L ipase L ipase gene
脂肪酶 ( lipase, EC3. 1. 1. 3 ) ,又称三酰基甘油 酰基水解酶 , 广泛存 (在于动植物和微生物体内 。 脂肪酶不仅可水解三酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪 酸 (其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘 油 、甘油和游离脂肪酸 ) ,并且能催化水解反应的逆 反应酯化反应 [ 1 ] 。目前脂肪酶生产主要有提取法 和微生物发酵法 [ 2 ] 。由于微生物脂肪酶种类多 ,作 用温度及 pH 范围比动植物脂肪酶广 、底物专一性 高 ,并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂 ,因 此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来 源 。近年来 ,非水相酶学和界面酶学的研究进一步 拓展了脂肪酶的应用领域 、利用脂肪酶在有机相催 化的各种反应可以合成许多高价值产物 ,在食品 、皮
复筛培养基 : NaC l 1. 0 g,蛋白胨 1. 0 g,酵母膏
0. 5 g, H2 O 100 m l, pH7. 0 11113 扩增引物 利用 Primer5. 0引物设计工具 , 针对筛选到的菌株 ,在 GenB ank中 BLAST相应脂肪 酶基因的保守区域进行引物设计 ,共设计两对引物 , 分别是 K1 和 K2。 K1: F5′2GTGTCATGTGTCTCTGG AGC23′, R5′2TTAAAAATTGGCGCTGACCC23′; K2: F5′2ATGAAGCATCTATTTCGA 23′, R5′2TCACGGTTT2 GTCCGCCTG23′。由北京华大基因研究中心合成 。 11114 主要试剂 橄榄油 、聚乙烯醇 (聚合度 1750 ±50) 、Rhodam ine B 等购自上海国药集团 。 PCR 反 应所需的试剂购自 Fermentas公司 , pGM 6K高速冷冻离心机购自德 国 Sigma公司 , B io2Rad凝胶成像系统购自美国 B io2 Rad公司 , Agilent 1200 高效液相色谱仪购自美国 Agilent公司 , PCR 扩增仪购自美国 B io2Rad 公司 , B io2Rad电泳槽购自美国 B io2Rad公司 。 112 方法 11211 富集方法 将采集的土样各称 5 g溶于 10 m 无菌水中 ,充分摇匀 ,静置片刻 ,让较大土壤粒沉 淀后 ,取上层液体 1 m l于装有 20 m l富集培养基的 100 m l三角瓶中 , 30℃, 180 r/m in,振荡培养 2 d后 , 将富集培养基摇匀 ,取 1 m l转接到新的富集培养基 中 ,二次富集 ,同样条件下振荡培养 2 d 后 ,进行 3 次富集 。在培养的过程中 ,每 24 h要观察培养基的 pH下降情况 ,理论上 pH 下降越大越优 。用 6 mol/ L Na2 CO3 调至初始 pH 继续培养 。 11212 初筛方法 取富集菌液 1 m l加入到 9 m l无