实验二、植物细胞骨架的观察

实验二、植物细胞骨架的观察
实验二、植物细胞骨架的观察
一、实验目的
观察植物细胞内网状的骨架结构。

二、实验原理
在真核细胞的细胞质中，存在着由蛋白质纤维构成的网状骨架系统。

Triton X-100是非离子去垢剂，用适当浓度的Triton X-100处理细胞，可将细胞的膜成分抽提掉，由于失去膜的保护和维系作用，细胞内其他可溶性成分也随之流失，这样一来水不溶性的细胞骨架系统蛋白质却被保留下来，而这被保留下来的蛋白质用考马斯亮蓝R250染色，便可在光学显微镜下观察它们——细胞骨架的网状结构。

为了更好地观察微丝束的结构，采用了戊二醛对细胞进行固定。

戊二醛是一种双交联剂，渗透快，交联能力强，对蛋白质的固定效果好，且不破坏细胞骨架的结构。

M-缓冲液洗涤细胞,可以提高细胞骨架的稳定性。

M－缓冲液和磷酸缓冲液作用都是维持细胞的渗透压
三、实验用品
显微镜、50ml烧杯、盖玻片、载玻片、滤纸、M-缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、1% Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝R250、3%戊二醛、洋葱鳞茎。

四、实验方法与步骤
1、撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约1平方厘米，置于装有PH6.8的磷酸缓
冲液（PBS）的50ml烧杯中，使其下沉。

2、用滤纸吸去磷酸缓冲液（PBS），用1% Triton X-100处理20-30分钟。

3、吸去Triton X-100，用M-缓冲液洗3次，每次10分钟。

4、用3%戊二醛固定10-15分钟。

5、用磷酸缓冲液（PBS）洗3次，用滤纸吸干。

6、用0.2%考马斯亮蓝R250染色20-30分钟。

7、用蒸馏水洗1-2次，将洋葱细胞置于载玻片上，加上盖片。

8、在光学显微镜下镜检。

五、作业
写出你的实验结果并绘成图。

附：药品配置
1、M—缓冲液（10×原液）
咪唑（50m mol） 34.04g MgCl.6H2O 1.02g EGTA （1m mol）3.80g EDTA（0.1m mol） 0.29g
巯基乙醇 0.78（0.7ml）
蒸馏水加至1000ml
用时稀释，取50ml（10×原液）加450ml蒸馏水。

2、磷酸缓冲液（PBS）
配方①：
NaCl 8.0g Na2HPO4.2H2O 1.42g
KCl 0.20g KH2PO4 0.20g
MgCl2.6H2O 0.10g CaCl2（无水） 0.10g
0.5%酚红 4ml
双蒸水加至100ml
用5%NaHCO3调PH值至6.8。

也可先配成10被浓缩液，使用时再稀释。

配方②：
6m mol/L PH6.5磷酸盐缓冲液
A液：NaH2PO4.2H2O 938mg/1000ml
B液：Na2HPO4.12H2O 2150mg/1000ml
取A液68.5ml，B液31.5ml，加蒸馏水100ml即为工作液。

加入0.5%酚红4ml。

3、1% Triton X-100
用M-缓冲液配制。

取1mlTriton X-100液加M-缓冲液至100ml。

4、0.2%考马斯亮蓝R250配制
考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml
冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml
5、3%戊二醛的配制
用磷酸缓冲液（PBS）配制。

取3ml戊二醛加PH7.0、（1/15）磷酸盐缓冲液至100ml。