核酸检测实验室的规范化管理

2. 标本制备区
▪ 下述操作在该区进行： 标本保存、核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩 增反应管和测定RNA时cDNA的合成。
▪ 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反 应混合液的反应管。
▪ 对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭 活程序。
▪ 样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取 方法。
（六）靶核酸的逆转录(RT)和扩增
1．靶RNA的逆转录 下述因素通常影响cDNA合成的效率：(1)逆转录效率的降低或
完样错误等；(2)用于逆转录的标本中存在逆转录或Taq酶的抑制 物(如酚、氯仿、血红素等)；(3)RNA酶的存在导致RNA的降解。
（九）质量控制
（一）标本的采集
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或构橼酸钠抗凝全血 或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样 本时，应使用一次性密闭容器，如真空采血管。当使用非密闭采 样系统时，如尿、分泌物和骨髓的采样，必须注意防止来自采样 者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性手套。
（三）各区操作注意事项
1. 试剂贮存和准备区
▪ 下述操作在该区进行： 储存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。
▪ 在本区的实验操作过程中，必须戴手套并经常更换。 ▪ 操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。 ▪ 严禁用嘴吸取液体，加样器和吸头等必须经高压处理。 ▪ 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。 ▪ 实验室及其设备的使用必须有日常记录。
3．进入各工作区域必须严格按照单一方向进行，即： 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应混合物配制和扩增 区 扩增产物分析区。
4．不同工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员 离开各工作区域时，不得将工作服带出。
（二）工作区域仪器设备配置标准
1．试剂贮存和准备区
2-8℃和-15℃冰箱；混匀器；微量加样器(覆盖1--1000μl)； 移动紫外灯(近工作台面)；消耗品： 一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)； 专用工作服和工作鞋；专用办公用品。
目前的商品试剂盒大部分没采用内标方法质控。因此，在测定血 清/血浆病原体核酸如HBV DNA、HCV RNA等时，应使用已知 的弱阳性血清/血浆作为质控样本，与待测临床标本等同处理提取 核酸及扩增，以判断逆转录及扩增检测的效果。
每一个PCR实验中都必须设有外加阴性质控（污染监测质控）， 为判断扩增过程中污染出现的阶段，阴性质控可包括如下几种： 即在样品制备的整个过程中所带的空白管、仅有扩增反应液但不 含扩增模板的反应管、阴性标本等。阴性标本可以评估PCR试验 的综合质量。
工作区的严格划分的目的即是为了预防污染。为避免以 前测定中所产生的扩增产物的污染，可设法将其破坏掉。如在扩增 反应中用dUTP取代部分dTTP，持续的长波紫外灯照射，不能用其来 替代严格的实验室设置和管理，尤其是这些方法不能防止外来非扩 增的天然DNA的污染。
4．去除污染的措施 : 次氯酸钠、紫外线照射、高压消毒
（八）扩增产物的分析
▪ 扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、 探针杂交、测序、分光光度法定量等，但临床PCR检验项目基本 上都使用探针杂交方法。
▪ 杂交检测时应严格遵守商品试剂盒确定的杂交程序盒杂交条件。
（九）质量控制
必须对DNA和RNA分析的各步进行质量控制，以避免假阳性和 假阴性，保证测定结果的准确性和重复性。由于核酸扩增测定的 高敏感性，所以标本制备、逆转录、扩增本身和产物分析中的每 一步都要求有质控措施。
4.扩增产物分析区
▪ 下述操作在本区内进行：扩增片段的测定。
▪ 本区是最主要的扩增产物污染来源，因此必须注意避免通过本
区的物品及工作服将扩增产物带出。
▪ 本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、
丙稀酰胺、甲醛或同位素等，应注意实验人员的安全防护。
▪ 本区如采用负压或减压情况下可减少扩增产物从本区扩散至前
核酸检测实验室的规范化管理
一、规范化设置及管理
(一) 临床基因扩增检验实验室区域设置原则
1．临床基因扩增检验实验室原则上分为四个分隔开的工作区域： 试剂贮存和准备区；标本制备区； 扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区。 （如使用全自动分析仪，区域可适当合并）
2．各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、 物品混用。
3.扩增反应混合物配制和扩增区
核酸扩增仪；微量加样器(覆盖1--1000μl) ； 可移动紫外灯(近工作台面)；消耗品（一次性手套、一次性吸水纸、 耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)； 专用工作服和工作鞋；专用办公用品.
4.扩增产物分析区
基本仪器设备如下： 微量加样器(覆盖1--1000μl) ； 可移动紫外灯；消耗品； 专用工作服和工作鞋；专用办公用品。
面区域的可能性
二、质量保证
临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩 增检验所有阶段，即测定分析前的标本采集处理、测定中 的核酸提取，扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。
（一）标本的采集 （二）标本的稳定化处理 （三）标本的运送 （四）标本的贮存 （五）标本的处理(核酸提取) （六）靶核酸的逆转录CFIT)和扩增 （七）污染 （八）扩增产物的分析
（三）标本的运送
标本采集后必须尽快送至实验室。 经过稳定化处理的标本可在常温下邮寄运送。 用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，须速冻
后，放在干冰中运送。
（四）标本的贮存
▪ 临床体液标本如血清／血浆等可于-70℃下长时间贮存。 ▪ 用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10 mmol／L
Tris—1mmol／L EDTA缓冲液(pH7.5—8.0)中4℃保存。 ▪ 用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃或液
2．标本制备区
1-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱；高速台式冷冻离心机； 混匀器；水浴箱或加热模块；微量加样器(覆盖1--1000μl)； 可移动紫外灯(近工作台面)；超净工作台；消耗品; 一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤芯)；
专用工作服和工作鞋；专用办公用品； 如需处理大分子DNA，应备有超声波水浴仪。
2．核酸的扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测的假阳性或假阴性结果，如扩
增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg2+浓度 不佳、患者标本或试剂受污染等。扩增仪孔中热传导的均一性极 为重要，必须定期对扩增仪的温度控制和加热模块中热传导的一 致性进行检查，以避免假阴性结果。
（七）污 染
在实际工作中，常见有以下几种污染类型：扩增片段的污染 （产物污染）、天然基因组DNA的污染、试剂污染（储存液或工 作液）以及标本间交叉污染（如气溶胶从一个阳性标本扩散到原 本阴性的标本）。临床基因扩增检验实验室中污染的最主要来源 是扩增产物的污染。 1．测定分析前的污染源 2．测定分析阶段的污染源 3．污染的避免
玻璃器皿在使用前应高压处理。
临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本建议进行抗凝 处理，并尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。如 未作抗凝处理，则抽血后，必须在1小时内分离血清。
（二）标本的稳定化处理
▪ 用于DNA扩增检测的标本，应及时送至实验室。
▪ 用 于 RNA 测 定 的 标 本 应 进 行 稳 定 化 处 理 ， 异 硫 氰 酸 胍 盐 (Guanidine thiocyanate，CITC)可使DNA酶和RNA酶立即失 活，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1：4的比 例加至含有5mol／L GITC的试管中，从而使血清(浆)中的RNA 酶不可逆失活。
3. 扩增区
▪ 下述操作在该区进行：DNA或RNA扩增。 ▪ 在巢式PCR测定中，通常第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢
式扩增由较高的危险性，第二次加样必须在本区内进行。 ▪ 不能从本区再进入任何“上游”区域，可降低本区的气压以避免
气溶胶从本区漏出。 ▪ 为避免气溶胶所致的污染，尽量减少在本区的走动。
谢谢
氮中贮存。 ▪ 用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃即可。 ▪ 用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。
（五）标本的处理(核酸提取)
标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步 骤，在使用商品核酸提取试剂提取临床标本中的核酸模板 前，应对其进行充分评价以验证其提取的有效性。
当靶核酸为RNA时，逆转录PCR测定失败的常见原因是标 本在运送前未经充分的稳定化处理及核酸提取试剂的RNA 酶的污染。故建议使用高质量的商品核酸提取试剂。