实验三血标本微生物学检验图文
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实验三
血标本的微生物学检验
1
• 实验目的： • 掌握血液标本的采集与处理、常见病原菌
及一般微生物学检验程序。 • 掌握葡萄球菌及链球菌的鉴定方法；熟悉
它们的生物学性状。
2
• 血液标本的采集与处理： • 血液标本应在病人发热1～2日或发热高峰采
集培养为宜。此时阳性率高。 • 采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，
• 35 ±1 ℃温箱内孵育12~18h后，在BA或CA上盲目传种 一次，如无菌生长继续培养到第7天，取出后接种于 BA，再在BA或CA上盲目传种一次经培养仍无细菌生 长，可报告为：“经7天培养无细菌生长”。对于亚 急性心内膜炎病人标本，应培养1个月，才能得出结 论。（可疑布鲁菌培养28天，可疑军团菌培养10天）
阳性 血清肉汤浑浊生长。 阴性 血清肉汤透明。 意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重 要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为阴 性（即耐盐能力较弱，不能在此培养基上 生长）。
19
六、药敏试验—β—内酰胺酶检测 原理：β—内酰胺酶是主要由金黄色葡萄球菌和淋病奈瑟菌等所产生的抗菌素灭活
酶。它能裂解青霉素类和头孢菌素类抗生素的基本结构β—内酰胺环，从而使其 丧失抗菌活性。细菌产生的β—内酰胺酶可将β—内酰胺类抗生素降解成酸性产 物。pH指示剂检测溶液pH变化即可知细菌对β—内酰胺类抗生素的敏感性。 方法： 1、取3支小试管，各加10万单位青霉素溶液0.05ml。 2、分别用接种环挑取β—内酰胺酶阳性对照菌、阴性对照菌和待测菌的菌落数个 于上述3支小试管中，制成浓稠菌悬液，37℃水浴1小时。 3、分别加入1小滴溴麝香草酚兰指示剂于试验菌液中，观察颜色变化。 结果判断： 阳性菌：溴麝香草酚兰指示剂呈黄色。 阴性菌：呈绿色。 注意事项： 1、试验菌必须是新鲜菌，细菌培养时间过长，酶失去活性，试验出现假阴性。 2、细菌悬液一定要非常浓，否则为阴性结果。 3、溴麝香草酚兰指示剂量宜少（10ul即可），量多不好观察结果，溶液显黄绿色。
纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附着于细菌表面，在 玻片上形成凝块；也可使试管中的血浆发生凝固。 玻片法：取兔或人血浆及生理盐水各一滴（或用接种环取 1—2环），分别滴于洁净载玻片上，用接种环从血平板 上挑单个菌落，分别与血浆和生理盐水混合，观察结果。 结果判断
阳性：被检菌与血浆产生颗粒性凝集而与生理盐水不 产生凝集。
8
• 如有菌生长，增菌肉汤会呈现不同生长现象， 若发生浑浊，多为G-杆菌；若均匀浑浊有绿 色荧光，则可疑为绿脓杆菌；上面澄清，下 面有沉淀，可疑为链球菌；若见自下而上的 溶血现象，可疑为溶血性链球菌；若呈现肉 冻样凝固现象，疑为葡萄球菌；若表面有灰 色菌膜，疑为枯草杆菌或类白喉杆菌。
9
目前L 型菌感染败血症亦有报告，主要是由于使 用抑制菌细胞壁合成的抗菌药物（青霉素 G 、氨基苄青霉素、苯唑青霉素、先锋霉素、万古 霉素和环丝霉素等）治疗过程中，失去细胞壁的菌 体继续繁殖感染所致。因此，结合临床，在多次培 养无菌生长的情况下要考虑L型细菌感染.
意义：本试验用于鉴别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性；后 者为阴性。
注意事项：
1、本试验不适宜用血平板上的菌落，因红细胞内含有此酶， 会出现假阳性。
2、应使用新鲜培养菌，因陈旧培养物可失去酶活性。
3、H2O2浓度过高，产生假阳性。
15
2、血浆凝固酶试验：（葡萄球菌属细菌属内鉴别试验） 原理：金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的
阴性：二者均不凝集。 意义：血浆凝固酶试验是鉴定致病性葡萄球菌和非致病性
葡萄球菌的重要试验之一，前者多为阳性，后者为阴性。
16
五、生化鉴定 1、葡萄球菌鉴定：
将1#、2#、3#、4#标本中葡萄球菌划线接种 于高盐甘露醇平板 上，置35℃培养18—24小时。 原理：葡萄球菌属细菌能耐高盐（2.5%氯化钠）， 且致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培 养基由红色变为黄色（高盐甘露醇平板的指示 剂为酚红）。 结果判断
10万单位溶于pH7.4 0.05M磷酸盐缓冲液的 青霉素、0.05%溴麝香草酚兰溶液、产β—内 酰胺酶阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性 菌（柠檬黄色葡萄球菌）、革兰染色液等。
12
• 实验方法：
• 一、分离培养
•
用无菌方法将已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、
4#分别划线接种于血平板上，置35℃培养18—24小时。
革兰阳性球菌金黄色葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌肺炎链球菌化脓链球菌草绿色链球菌肠球菌革兰阳性杆菌结核分枝杆菌产单核李斯特菌阴道加特纳菌革兰阴性球菌脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌卡他布兰汉菌革兰阴性杆菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌克雷伯杆菌肠杆菌变形杆菌沙雷菌沙门菌不动杆菌嗜肺军团菌嗜血杆菌真菌念球菌曲霉菌隐球菌球孢子菌厌氧菌拟杆菌产气荚膜梭菌常见病原体
10
• 检验程序：
• 球菌
革兰阳性
•
• - 玻片凝固酶
触酶
+
微球菌
金黄色葡萄球菌
• 链球金黄菌色葡ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ萄球菌
• -
试管凝葡固酶萄糖发酵
新生霉素敏感
+ 表皮葡萄球菌
腐生葡萄球菌
11
• 实验器材： • 1、标本：已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、
4#。 • 2、培养基：BA、高盐甘露醇平板。 • 3、试剂：生理盐水、3%过氧化氢、人血浆、
20
• 实验结果：
• 结果报告： • 1#标本检出 • 2#标本检出 • 3#标本检出 • 4#标本检出
21
• 实验讨论：
• 作业： 1、查5篇关于血标本检验常见病原菌文献，
例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。 2、查5篇关于血标本检验结果假阳性的文献，
例出文献名及每篇文献中的假阳性率，并 分析原因。
阳性：培养基由红色变为黄色。 阴性：培养基仍为红色。
意义：致病性葡萄球菌可呈阳性，非致病性葡萄 球菌为阴性。
17
2、链球菌鉴定： 将1#、2#、3#、4#标本中链球菌划线接种于七叶苷斜面、6.5%NaCl肉汤培养基 上，置35℃培养18—24小时。
1）七叶苷分解试验 原理：肠球菌能水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁
的Fe3+起反应，形成黑色沉淀，使培养基变黑色。 结果判断：
阳性 培养基变黑色。 阴性 培养基不变。 意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为 阴性。
18
2）6.5%NaCl生长试验： 原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在
6．5%NaCl血清肉汤培养基中生长呈浑浊。 结果判断：
• 采集时应以无菌手续由静脉取血5～10ml，儿童1～5ml，
立即注入适当的液体增菌培养瓶内（培养基与血液的比
例为10:1），并迅速轻摇，使充分混匀，以防凝固，并
有利于细菌生长。（疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉
或股动脉采血为宜）
4
• 作厌氧菌培养时，抽血后应立即接种厌氧培养基 中，避免接触空气，并尽快送往细菌室放入温箱， 避免温度对细菌生长不利。
•
增菌培养
• 硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养;如检测沙门
氏菌用胆汁葡萄糖肉汤，如检测厌氧菌用 硫乙醇酸钠肉汤）
• 需氧培养（BA） CO2培养（CA观） 察细菌厌氧生培长养（情BA）况
观察菌落形态、涂片染色镜检
•
直接涂片染色 血清学鉴定 生化鉴定
直接药敏试验
分离培养 药敏试验
确定病原菌
7 发报告
• 接种于增菌肉汤培养基后，立即置35 ±1 ℃温箱内孵 育，每天取出一次观察有无细菌生长，应特别注意观 察肉汤内有无混浊、沉淀、菌膜、色素、血液变色、 指示剂变色等现象，并记录之。连续观察7天。
3
• 入院前两周内接受抗菌药物治疗的患者，连续3d，每天 采2 份。（如果病人曾服用磺胺类药物，应在每50 ml 培 养基内加对氨苯甲酸2.5 mg ， 以防止磺胺类药物对细菌 的抑制作用。如果病人已用青霉素治疗，应在培养基中 加入青霉素酶100 U／50 ml （青霉素酶不耐热，应在临 用时加入）。若病人已用其他抗生素治疗时，可用硫酸 镁肉汤增菌。）
22
14
四、鉴别试验
1、触酶试验（过氧化氢酶试验）：
原理：葡萄球菌产生的触酶（过氧化氢酶），能催化过氧化 氢分解成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
方法：用接种环挑取待检菌菌落，置于洁净载玻片上，滴加 3%H2O2溶液1滴，1分钟内观察结果。
结果判断
阳性：产生大量气泡。
阴性：不产生气泡或缓慢产生少量气泡。
从不同部位采集血液标本，做2次血培养； 心内膜炎急性病例，在抗生素治疗前，从不 同部位采血3次做血液培养；亚急性心内膜 炎病例，第一天24h内，相隔1h连续采集3次 血标本培养，若24～48h全部阴性，再采集 2～3次血标本培养。 • 对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到 来之前0.5～1h 采集血液，或于寒战或发烧 后1h进行。
革兰阳性杆菌 结核分枝杆菌、产单核李斯特菌、阴道加特纳菌
革兰阴性球菌 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌
革兰阴性杆菌 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克雷伯杆菌、肠杆菌、变形杆菌、沙雷菌、 沙门菌、不动杆菌、嗜肺军团菌、嗜血杆菌
真菌
念球菌、曲霉菌、隐球菌、球孢子菌
厌氧菌
拟杆菌、产气荚膜梭菌
6
• 检验程序：血标本（无菌采集）
• 二、直接涂片染色
•
取上述1#、2#、3#、4#标本分别作涂片、革兰氏
染色、镜检。（要求绘图并描述）
13
三、结果观察 1、菌落形态描述：
1#标本： 2#标本： 3#标本： 4#标本： 2、菌体形态观察： 分别取1#、2#、3#、4#标本的血平板培养物涂 片、革兰染色、镜检。 。（要求绘图并描述）
• 采血后应该立即送检，如不能立即送检，可室温 保存（25 ℃ ），切勿冷藏。
• 采血和接种时应严格注意无菌操作，避免污染杂 菌。
• 培养对营养要求较高的细菌用肝浸液或胰胨肉汤 等。
5
常见病原体：
种类
病原菌
革兰阳性球菌
金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、草绿 色链球菌、肠球菌
血标本的微生物学检验
1
• 实验目的： • 掌握血液标本的采集与处理、常见病原菌
及一般微生物学检验程序。 • 掌握葡萄球菌及链球菌的鉴定方法；熟悉
它们的生物学性状。
2
• 血液标本的采集与处理： • 血液标本应在病人发热1～2日或发热高峰采
集培养为宜。此时阳性率高。 • 采血培养应该尽量在使用抗菌药物之前进行，
• 35 ±1 ℃温箱内孵育12~18h后，在BA或CA上盲目传种 一次，如无菌生长继续培养到第7天，取出后接种于 BA，再在BA或CA上盲目传种一次经培养仍无细菌生 长，可报告为：“经7天培养无细菌生长”。对于亚 急性心内膜炎病人标本，应培养1个月，才能得出结 论。（可疑布鲁菌培养28天，可疑军团菌培养10天）
阳性 血清肉汤浑浊生长。 阴性 血清肉汤透明。 意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重 要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为阴 性（即耐盐能力较弱，不能在此培养基上 生长）。
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六、药敏试验—β—内酰胺酶检测 原理：β—内酰胺酶是主要由金黄色葡萄球菌和淋病奈瑟菌等所产生的抗菌素灭活
酶。它能裂解青霉素类和头孢菌素类抗生素的基本结构β—内酰胺环，从而使其 丧失抗菌活性。细菌产生的β—内酰胺酶可将β—内酰胺类抗生素降解成酸性产 物。pH指示剂检测溶液pH变化即可知细菌对β—内酰胺类抗生素的敏感性。 方法： 1、取3支小试管，各加10万单位青霉素溶液0.05ml。 2、分别用接种环挑取β—内酰胺酶阳性对照菌、阴性对照菌和待测菌的菌落数个 于上述3支小试管中，制成浓稠菌悬液，37℃水浴1小时。 3、分别加入1小滴溴麝香草酚兰指示剂于试验菌液中，观察颜色变化。 结果判断： 阳性菌：溴麝香草酚兰指示剂呈黄色。 阴性菌：呈绿色。 注意事项： 1、试验菌必须是新鲜菌，细菌培养时间过长，酶失去活性，试验出现假阴性。 2、细菌悬液一定要非常浓，否则为阴性结果。 3、溴麝香草酚兰指示剂量宜少（10ul即可），量多不好观察结果，溶液显黄绿色。
纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附着于细菌表面，在 玻片上形成凝块；也可使试管中的血浆发生凝固。 玻片法：取兔或人血浆及生理盐水各一滴（或用接种环取 1—2环），分别滴于洁净载玻片上，用接种环从血平板 上挑单个菌落，分别与血浆和生理盐水混合，观察结果。 结果判断
阳性：被检菌与血浆产生颗粒性凝集而与生理盐水不 产生凝集。
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• 如有菌生长，增菌肉汤会呈现不同生长现象， 若发生浑浊，多为G-杆菌；若均匀浑浊有绿 色荧光，则可疑为绿脓杆菌；上面澄清，下 面有沉淀，可疑为链球菌；若见自下而上的 溶血现象，可疑为溶血性链球菌；若呈现肉 冻样凝固现象，疑为葡萄球菌；若表面有灰 色菌膜，疑为枯草杆菌或类白喉杆菌。
9
目前L 型菌感染败血症亦有报告，主要是由于使 用抑制菌细胞壁合成的抗菌药物（青霉素 G 、氨基苄青霉素、苯唑青霉素、先锋霉素、万古 霉素和环丝霉素等）治疗过程中，失去细胞壁的菌 体继续繁殖感染所致。因此，结合临床，在多次培 养无菌生长的情况下要考虑L型细菌感染.
意义：本试验用于鉴别葡萄球菌和链球菌，前者为阳性；后 者为阴性。
注意事项：
1、本试验不适宜用血平板上的菌落，因红细胞内含有此酶， 会出现假阳性。
2、应使用新鲜培养菌，因陈旧培养物可失去酶活性。
3、H2O2浓度过高，产生假阳性。
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2、血浆凝固酶试验：（葡萄球菌属细菌属内鉴别试验） 原理：金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的
阴性：二者均不凝集。 意义：血浆凝固酶试验是鉴定致病性葡萄球菌和非致病性
葡萄球菌的重要试验之一，前者多为阳性，后者为阴性。
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五、生化鉴定 1、葡萄球菌鉴定：
将1#、2#、3#、4#标本中葡萄球菌划线接种 于高盐甘露醇平板 上，置35℃培养18—24小时。 原理：葡萄球菌属细菌能耐高盐（2.5%氯化钠）， 且致病性葡萄球菌多能发酵甘露醇产酸，使培 养基由红色变为黄色（高盐甘露醇平板的指示 剂为酚红）。 结果判断
10万单位溶于pH7.4 0.05M磷酸盐缓冲液的 青霉素、0.05%溴麝香草酚兰溶液、产β—内 酰胺酶阳性菌（金黄色葡萄球菌）和阴性 菌（柠檬黄色葡萄球菌）、革兰染色液等。
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• 实验方法：
• 一、分离培养
•
用无菌方法将已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、
4#分别划线接种于血平板上，置35℃培养18—24小时。
革兰阳性球菌金黄色葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌肺炎链球菌化脓链球菌草绿色链球菌肠球菌革兰阳性杆菌结核分枝杆菌产单核李斯特菌阴道加特纳菌革兰阴性球菌脑膜炎奈瑟菌淋病奈瑟菌卡他布兰汉菌革兰阴性杆菌大肠埃希菌铜绿假单胞菌克雷伯杆菌肠杆菌变形杆菌沙雷菌沙门菌不动杆菌嗜肺军团菌嗜血杆菌真菌念球菌曲霉菌隐球菌球孢子菌厌氧菌拟杆菌产气荚膜梭菌常见病原体
10
• 检验程序：
• 球菌
革兰阳性
•
• - 玻片凝固酶
触酶
+
微球菌
金黄色葡萄球菌
• 链球金黄菌色葡ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ萄球菌
• -
试管凝葡固酶萄糖发酵
新生霉素敏感
+ 表皮葡萄球菌
腐生葡萄球菌
11
• 实验器材： • 1、标本：已增菌模拟血液标本1#、2#、3#、
4#。 • 2、培养基：BA、高盐甘露醇平板。 • 3、试剂：生理盐水、3%过氧化氢、人血浆、
20
• 实验结果：
• 结果报告： • 1#标本检出 • 2#标本检出 • 3#标本检出 • 4#标本检出
21
• 实验讨论：
• 作业： 1、查5篇关于血标本检验常见病原菌文献，
例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。 2、查5篇关于血标本检验结果假阳性的文献，
例出文献名及每篇文献中的假阳性率，并 分析原因。
阳性：培养基由红色变为黄色。 阴性：培养基仍为红色。
意义：致病性葡萄球菌可呈阳性，非致病性葡萄 球菌为阴性。
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2、链球菌鉴定： 将1#、2#、3#、4#标本中链球菌划线接种于七叶苷斜面、6.5%NaCl肉汤培养基 上，置35℃培养18—24小时。
1）七叶苷分解试验 原理：肠球菌能水解七叶苷，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与培养基中的枸橼酸铁
的Fe3+起反应，形成黑色沉淀，使培养基变黑色。 结果判断：
阳性 培养基变黑色。 阴性 培养基不变。 意义： 此试验是鉴定肠球菌和其他链球菌的重要试验。肠球菌为阳性，其他链球菌为 阴性。
18
2）6.5%NaCl生长试验： 原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在
6．5%NaCl血清肉汤培养基中生长呈浑浊。 结果判断：
• 采集时应以无菌手续由静脉取血5～10ml，儿童1～5ml，
立即注入适当的液体增菌培养瓶内（培养基与血液的比
例为10:1），并迅速轻摇，使充分混匀，以防凝固，并
有利于细菌生长。（疑似细菌性心内膜炎时，以肘动脉
或股动脉采血为宜）
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• 作厌氧菌培养时，抽血后应立即接种厌氧培养基 中，避免接触空气，并尽快送往细菌室放入温箱， 避免温度对细菌生长不利。
•
增菌培养
• 硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养;如检测沙门
氏菌用胆汁葡萄糖肉汤，如检测厌氧菌用 硫乙醇酸钠肉汤）
• 需氧培养（BA） CO2培养（CA观） 察细菌厌氧生培长养（情BA）况
观察菌落形态、涂片染色镜检
•
直接涂片染色 血清学鉴定 生化鉴定
直接药敏试验
分离培养 药敏试验
确定病原菌
7 发报告
• 接种于增菌肉汤培养基后，立即置35 ±1 ℃温箱内孵 育，每天取出一次观察有无细菌生长，应特别注意观 察肉汤内有无混浊、沉淀、菌膜、色素、血液变色、 指示剂变色等现象，并记录之。连续观察7天。
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• 入院前两周内接受抗菌药物治疗的患者，连续3d，每天 采2 份。（如果病人曾服用磺胺类药物，应在每50 ml 培 养基内加对氨苯甲酸2.5 mg ， 以防止磺胺类药物对细菌 的抑制作用。如果病人已用青霉素治疗，应在培养基中 加入青霉素酶100 U／50 ml （青霉素酶不耐热，应在临 用时加入）。若病人已用其他抗生素治疗时，可用硫酸 镁肉汤增菌。）
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四、鉴别试验
1、触酶试验（过氧化氢酶试验）：
原理：葡萄球菌产生的触酶（过氧化氢酶），能催化过氧化 氢分解成水和初生态氧，继而形成氧分子出现气泡。
方法：用接种环挑取待检菌菌落，置于洁净载玻片上，滴加 3%H2O2溶液1滴，1分钟内观察结果。
结果判断
阳性：产生大量气泡。
阴性：不产生气泡或缓慢产生少量气泡。
从不同部位采集血液标本，做2次血培养； 心内膜炎急性病例，在抗生素治疗前，从不 同部位采血3次做血液培养；亚急性心内膜 炎病例，第一天24h内，相隔1h连续采集3次 血标本培养，若24～48h全部阴性，再采集 2～3次血标本培养。 • 对间歇性寒战或发热应在寒战或体温高峰到 来之前0.5～1h 采集血液，或于寒战或发烧 后1h进行。
革兰阳性杆菌 结核分枝杆菌、产单核李斯特菌、阴道加特纳菌
革兰阴性球菌 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌
革兰阴性杆菌 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、克雷伯杆菌、肠杆菌、变形杆菌、沙雷菌、 沙门菌、不动杆菌、嗜肺军团菌、嗜血杆菌
真菌
念球菌、曲霉菌、隐球菌、球孢子菌
厌氧菌
拟杆菌、产气荚膜梭菌
6
• 检验程序：血标本（无菌采集）
• 二、直接涂片染色
•
取上述1#、2#、3#、4#标本分别作涂片、革兰氏
染色、镜检。（要求绘图并描述）
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三、结果观察 1、菌落形态描述：
1#标本： 2#标本： 3#标本： 4#标本： 2、菌体形态观察： 分别取1#、2#、3#、4#标本的血平板培养物涂 片、革兰染色、镜检。 。（要求绘图并描述）
• 采血后应该立即送检，如不能立即送检，可室温 保存（25 ℃ ），切勿冷藏。
• 采血和接种时应严格注意无菌操作，避免污染杂 菌。
• 培养对营养要求较高的细菌用肝浸液或胰胨肉汤 等。
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常见病原体：
种类
病原菌
革兰阳性球菌
金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、草绿 色链球菌、肠球菌