13基因工程导论

…3‘ …3’ C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C
… 5’
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
连接多个平头双链DNA分子：
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
P-C-T-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-T-C-P
OH-G-A-C-C-T-C
… 5’
T4-DNA连接 酶
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G
… 5’
同裂酶：来源不同，识别顺序相同: HpaII和MspI 识别顺序为：CCGG，常为CCGG， C：
甲基化 甲基化碱基的敏感性差异： HpaII 敏感，
不能切割 MspI 反应中性，甲基化与否均切割 动物甲基化程度比较高。
同尾酶：来源不同，识别顺序不同，粘性末端相同
BamHI G↓GATCC
20 - 100 ml
酶
37 ℃ 1 - 1.5 hr
1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时
，水完解全1 mg 标准DNA所需的酶
量
限制性核酸内切
II 型限制性核酸内酶切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：
对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应
注意：
BamHI SmaI
1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小完时全，连接 1 mg l-DNA（Hind III片段）所需
的酶量
DNA连接酶
平头双链DNA片段的连接操作（T4-DNA连接酶
）
从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的
粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接
则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多
2. 基本概念
A 重组DNA技术的基本定义
重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的 基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一 种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定 遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程 序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的 三大基本元件。
OH-G-C-T-
C … 5’
退火 4-7 O℃H P
5‘ … G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C
… 5’
P OH
PstI等产生的3‘粘性末
端 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C
4. 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基
因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白
质工程
第三代基因工程
代谢信息途径的修饰重构
途
径工程 第四代基因工程 基因组或染色体的转移 基因
组工程
5. 理论基础
19世纪中 孟德尔 豌豆杂交试验 遗传因子 经典
遗20传世学纪初 摩尔根 果蝇杂交实验 基因 基因
5‘ …3‘ GCTACATGGATCCCGGGTTCGCAT… 5‘ …3…’GCCGTAATCGATTAGCCTAGGGCCCAAGCGTA G3‘A……TCC5CG’ CAGTGGTGATCTCCTGACGAT…3’ GGCCCAAGCGTA…5’ 5‘ …GCTACATGGATCCC G3‘G…GCTGTCATGGCTAATC…C3T’AGGG
…3‘ …3’ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C
… 5’
DNA连接酶
DNA连接酶的反应条
件
Tris-
50 - 100 mM pH 7.5
HMCgCl l2 ATP DTT Volum eT T
10
m0.5M- 1 m5 mMM 10 - 20 ml 4 - 15 ℃ 4 - 16 hr
第十三章 基因工程导论
第一节 基因工程的概述
1. 产生思想 基因－分离－自由组 合 －连锁互换－精 细结构 －基因表达 －基因调控
世界上有6000万人患糖 尿病，400万人用胰岛素
通过这个过程可以 得到试管牛奶、无 壳鸡蛋…….
您相信吗？
1000磅猪或牛胰腺＝200L发酵液＝10g胰岛素 50万只羊下丘脑＝9L发酵液（人生长激素抑制素） 1200L人血液＝1L发酵液（干扰素）
限制性核酸内切
II 型限制性核酸内酶切酶酶解反应的操作
II 型核酸内切酶的多酶联合酶解： 对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方 法： 使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同 时低酶盐解酶先切，然后补加盐，高盐酶再 切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶 再切0.1倍体积的 5 M NaAc pH 52.45倍体积的冰冷乙醇 冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、 干燥
限制性核酸内切 影响限制性核酸内酶切酶活性的因素
DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、 NaCl等 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶 加大反应总体积
延长反应时间
限制性核酸内切
影响限制性核酸内酶切酶活性的因素
DNA样品的甲基化程 度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤
提高平头末端连接效率的方法包括：
加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连 接加）大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞 机加会入10% PEG8000，促进大分子之间的有 效加作入用单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶 I（ DNA pol I ） 大肠杆菌DNA聚合酶 I 的基本性质：5‘→3‘的DNA聚合酶活
6. 基因工程的基本原理
提高外源基因的剂量——分子遗传学
原筛选理修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启
动子增、强子、操作子、终止子、上游调控序
列等
——分子遗传学原
修饰构建蛋白质生物理合成的翻译调控元件，如：
SD序列、mRNA非编码区、密码子
等
——分子遗传学原
基因工程菌（微型生理物反应器）的增殖及稳定
… 5’
P OH
PvuII等产生的平头末端
5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C
… 5’
PvuII 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-A-G-OH
P-C-T-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-T-C-P
OH-G-A-C-C-T-C
核酸内切酶的缓冲液性质：
高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH 值 会等使，一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异 性 所，谓即的Star activity现象：即星号 反 Ec应oR I在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列， 但 油在浓甘度超过5%（v/v）时，也可切割 55‘‘PAuAPTTuA3’TPyPy3’或者
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与 构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到 基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的 分离纯化过程。
3. 基本用途
分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信 息资源 大规模生产生物活性物 质 设计、构建生物的新性状甚至新 物种
性5‘→3‘的核酸外切酶 活3‘→性5‘的核酸外切酶活 3‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5性’ 5‘ … C-G-A-G-T-OH
… 5’
EcoRI等产生的5‘粘性
末端
5‘ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C
… 5’ EcoRI 37 5‘ A-
G3‘ … 3C’-G-A-C-T-T-A-A-P
生产
——生化工程学原
7. 基因工程的支撑技术
核酸凝胶电泳技 术核酸分子杂交技 术细菌转化转染技 术DNA序列分析技 术寡核苷酸合成技 术基因定点突变技 术聚合酶链反应（PCR）技 术
第二节 限制性核酸内
限制性核酸内切酶的发现切及酶其生物功能
识别双链DNA分子中的特定序列，并切割 D主N要A存双在链于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA 的细入菌侵 的限制与修饰作用
nick OH P 5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C
… 5’
P OH nick
DNA连接
酶
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C
… 5’
hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同 1968表年达，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分 离出Hind II和Hind
限制性核酸内切 限制性核酸内切酶酶的命名
属名
种名 株名
Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆
限制性核酸内切 II 型限制性核酸内酶切酶的基本特性
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对碱基序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧
识别切割序列呈典型的旋转对称型－回文结构
EcoR I的切割位
EcoR I的识别序
点
列
5‘ … G C T G A A T T C G A G
… 3‘ …3’ C G A C T T A A G C T C
学1944年 艾弗瑞 肺炎双球菌转化实验 遗传物质
DNA
分子遗传
1953年 沃森-克瑞克 DNA双螺旋结构学 分子生
1物9学73年 伯格-杰克森-考恩-鲍耶 DNA分子体
外拼接
基因工
5.理论基础－理论上的三大发现
（1）40年代发现了生物的遗传物质是DNA。 （2）50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复 制机理 （3）60年代确定了遗传信息的传递方式。
Bcl T↓GATCA
限制性核酸内切
II 型限制性核酸内酶切酶酶解反应的操作
大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条
件：Tris-
50 mM pH
HMCgCl l2 NaCl
710.5 m0 -M150
0 - 50 mM 低盐 酶100 mM 中盐
DTT
m1 mMM
酶150 mM 高盐
Volum eT T
N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但 BBagml IIH、IS、au3A I不受影
大肠响杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或 5‘CC中T的G胞G3嘧’序啶列C5位上引入甲基，受其影响的酶有 哺乳E动co物R中II等的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲 基
限制性核酸内切 影响限制性核酸内酶切酶活性的因素
限制性核酸内切 限制性核酸内切酶酶的类型
主要特性
I型
II 型
III 型
限制修饰
多功
单功
双功
蛋白结
异能源三聚
同能源二聚
异能源二聚
构 辅助因 AT体P Mg2+
体 Mg2
AT体P Mg2+
子 识别序 列 切割位
STAGMAN8TGC TAACN6GTG 距C识别序列1kb
旋转+对称序 SAMGAGC
列
CCAGCA
识别序列内或附 距G识别序列下
点
处 随机性切 近 特异性切 游 24-26bp
割 SAM：S－腺苷甲割硫氨酸
处
DNA连接酶
DNA连接酶的种类 两种：DNA连接酶，来源于大肠杆菌 T4－DNA连接酶，来源于T4－噬菌体
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键
DNA连接酶
DNA连接酶的基本性质
修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G A-C-G-G-C-C-T-C
… 5’
P OH nick
T4-DNA连接 酶
5‘ … G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G
… 5’ PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH
P-G-G-A-
G3‘ … 3C’-G-A-G-P
OH-A-C-G-T-C-C-T-
C … 5’
退火 4-7
℃
OH P
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G
…3‘ …3’ C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C
菌d株 H i n d III H i n d
III
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内 切酶
EcoRI Escherichia coli
E co R I
发现的序号
大肠杆菌抗药性质粒
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶的分类： 分类依据
1）依据识别序列与切割位点是否一致 2）所需辅助因子 分为三类：I型酶、二型酶、三型酶