Cav1.3钙离子通道在成年大鼠耳蜗的表达

Cav1.3钙离子通道在成年大鼠耳蜗的表达
陈金;冰丹;周良强;褚汉启;陈请国;杜智会;祁繁;刘云;孙彦博;李鹏军
【摘要】目的观察Cav1.3钙离子通道蛋白在成年大鼠耳蜗组织中的表达和分布,探讨其在听觉生理和病理中的作用.方法 35只成年SD大鼠随机分为A组(5只,分离耳蜗冰冻切片)、B组(10只,取耳蜗全部软组织及肾组织)、C组(20只,分离耳蜗基底膜、血管纹及螺旋神经节),采用免疫荧光染色方法检测Cav1.3钙离子通道蛋白在耳蜗组织中的分布,采用免疫印迹技术(Western blot,WB)以及逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检测Cav1.3钙通道蛋白在耳蜗组织中的表达.结果免疫荧光显示Cav1.3钙通道蛋白主要分布在成年大鼠耳蜗毛细胞、血管纹细胞,螺旋神经板缘细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、螺旋凸;RT-PCR以及Western blot的结果显示Cav1.3钙离子通道蛋白在耳蜗组织和肾脏中有均表达,其中耳蜗基底膜上最多,螺旋神经节次之,耳蜗侧壁血管纹的表达量与前两者相比相对较少.结论本研究初步揭示了Cav1.3钙离子通道蛋白在成年SD大鼠耳蜗中的表达具有一定的组织特异性,为进一步研究Cav1.3钙离子通道蛋白在听觉生理和病理中重要的作用提供了理论依据.%Objective To investigate the expression of Cav 1.3 calcium channel in adult rat cochlea and study its role in auditory physiology and pathology.Methods The sprague-dawley rats were used as experimental subjects.The distribution of Cav1.3 calcium channel in the cochlea was detected by immunofluorescence technique.The expression of Cav1.3 was measured with Western blot (WB) and RT-PCR.Results Immunofluorescence photographs revealed that Cav 1.3 calcium channel localized in the lateral wall membrane,hair cells,stria vascularis,spiral ganglion cell,spiral ligment,spiral prominence,and limbus
laminae spiralis.The results of WB and RT-PCR inform Cav1.3 calcium channel gene (CACNA1D) were measured in the cochlea and kidney.The expression of Cav1.3was mainly in the basilar membrane.Moderate expression was observed in the spiral ganglion and stria
vascularis.Conclusion The preliminary study revealed the distribution of Cav 1.3 calcium channel gene(CACNA1D)in adult rat cochle possesses tissue specificity,providing a theoretical basis for further research in auditory physiology and pathology.
【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》
【年(卷),期】2017(025)006
【总页数】4页(P630-633)
【关键词】耳蜗;Cav1.3钙离子通道;大鼠
【作者】陈金;冰丹;周良强;褚汉启;陈请国;杜智会;祁繁;刘云;孙彦博;李鹏军
【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外
科武汉430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉头颈外科武汉430030
【正文语种】中文
【中图分类】R339.16
Cav1.3钙离子通道蛋白是维持细胞内Ca2+浓度平衡的重要蛋白之一，它的主要
作用是控制胞内Ca2+内流和细胞膜的去极化，从而维持内耳细胞内Ca2+稳态以及神经递质的释放，保证神经冲动的传导及内耳正常生理功能的发挥。

Nemzou
等[1]研究发现Cav1.3在调控内耳毛细胞神经递质的释放、毛细胞的发育和功能中起着重要的作用，然而对于Cav1.3在耳蜗的表达和分布以及在听觉功能中的作用机制还有待进一步研究。

本研究拟通过免疫组织化学和免疫荧光技术观察Cav1.3
钙通道蛋白在成年SD大鼠耳蜗组织中的分布，运用分子生物学的方法了解
Cav1.3钙离子通道蛋白在其耳蜗不同组织间的表达，为更深入地研究Cav1.3在
内耳中所发挥的生理功能奠定基础。

1.1 实验动物及分组健康、耳廓反射正常的成年SD大鼠(体重200～300 g)35只，雌雄不限，随机分为A(5只)、B(10只)、C(20只)三组；动物由华中科技大学同济医学院动物学部提供，所有实验操作均得到华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理学委员会批准。

1.2 主要试剂和设备兔抗小鼠Cav1.3钙离子通道多克隆抗体 (Santa Cruz Biotechnology, USA)，DyLightTM488 山羊抗兔IgG (Multi-Sciences Biotech Co. Ltd, Hangzhou, China)，兔抗小鼠β-Actin抗体(博士德，武汉)，
EDTA(Sigma，USA)，Tissue-Tek O.C.T. Compoud(SAKURA，USA)，Propidium iodide (PI) (Sigma, St Louis, USA)，抗荧光衰减封片剂(普利莱，北京)，山羊血清封闭液 (博士德，武汉)，Trizol (Invitrogen,USA)，逆转录试剂盒
(TOYOBO, Japan)，HSTM TaqMix(东盛生物，广州)，琼脂糖(GENE TECH，西
班牙)，ECL 增强化学发光试剂(Pierce , USA)。

连续变倍体视显微镜 (XTS20, 北京福凯)，IX71 倒置式研究型显微镜(Olympus，Japan)，LightCycler System
2.0PCR 仪 (Roche, Mannheim, Germany)，Leica CM900 冰冻切片机(Leica，German)，紫外分光光度计 (Bio-Rad, USA)，GelDoc XR 凝胶成像系统 (Bio-Rad, USA)，SDS-PAGE 电泳仪 (Bio-Rad, USA)。

1.3 耳蜗标本的制备三组大鼠均经三溴乙醇麻醉后快速取出双侧耳蜗，A组耳蜗分离后经4% 多聚甲醛溶液固定后置于4 ℃冰箱过夜，10%的EDTA脱钙两周后见
耳蜗透明、质地柔软有弹性；将完全脱钙的耳蜗标本用0.1%PBS洗涤三次，室温下置入20%蔗糖溶液中24小时后浸入Tissue-Tek OCT Compoud包埋剂中过夜，-20 ℃沿蜗轴水平行冰冻切片，切片厚8 μm。

B组及C组的耳蜗在解剖显微镜下迅速从下鼓室打开听泡，用剪刀剪除鼓室外壁充分暴露耳蜗，用消毒预冷的PBS
缓冲液洗血迹，从蜗尖钻一小孔，用显微镊顺次剥离蜗壳，分离耳蜗软组织后将B 组大鼠耳蜗全部软组织和肾脏组织(阳性对照)分别收集于已消毒的EP管(等量两份)。

C组耳蜗完全分离基底膜、血管纹及螺旋神经节区组织并分别收集于已消毒的EP
管(等量两份)，液氮中速冻后置于-70 ℃低温冰箱冻存备用。

1.4 免疫荧光化学染色 A组耳蜗冰冻切片室温晾干后经0.01 M PBS溶液漂洗5 min后，滴加5%山羊血清封闭液封闭，室温孵育30 min，甩去多余血清后滴加Cav1.3多克隆抗体(1∶400)4 ℃冰箱过夜；37 ℃温箱复温30 min，经0.01 M PBS溶液适度漂洗后滴加FITC标记山羊抗兔IgG(武汉博士德，1∶200)，室温孵
育60 min，PBS溶液漂洗后PI染核，室温10 min，PBS溶液洗5 min×3次；
抗荧光衰减的封片剂封片；IX71倒置式研究型荧光显微镜(Olympus，Japan)下
观察照相，阴性对照用PBS代替一抗。

1.5 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription- polymerase chain reaction，
RT-PCR) 用Trizol法提取B组及C组大鼠的一份耳蜗各组织和肾脏组织(阳性对照)的总RNA，提取的RNA立即进行逆转录，取1 μl cDNA用于PCR反应，引
物序列分别为：CACNA1D(rat) F：5’CATCATGCTCAACACGCTCT 3’; R：
5’TATCAACGACGCTACCGACA 3’;GAPDH(rat) F：
5’GTCGGTGTGAACGGATTTGG 3’; R：5’GACTGTGCCGTTGAACTTGC 3’。

PCR反应条件为：预变性95 ℃ 5 min，变性94 ℃ 50 s，退火：
CACNA1D 58 ℃, GAPDH 62 ℃，延伸72 ℃ 1min，35个循环，终末72 ℃延
伸10 min即得PCR扩增后产物。

取5 μl PC R产物进行琼脂糖凝胶(2%)电泳，
80 V、60 mA电泳25 min后紫外灯下确认目的条带，采用GelDoc XR凝胶成像系统(BIO-RAD)成像。

1.6 Western blot检测分别提取B组及C组另一份耳蜗各组织及肾脏组织(阳性
对照)的蛋白，蛋白质提取后用紫外分光光度计测定标准和样本蛋白的吸光度(A)值,根据标准曲线计算各样本蛋白的浓度。

配制4%浓缩胶和7.5%的分离胶，150 V
恒压电压下SDS-PAGE凝胶电泳50 min，电泳完成后将蛋白质从SDS-PAGE凝
胶转移至NC膜上，转移电流为276 mA,转移时间为30 min。

将NC膜用5%的
脱脂奶粉/TBS封闭液室温封闭1小时后加入稀释的一抗(兔抗小鼠Cav1.3多克隆抗体，美国Santa Cruz公司，1∶800；β-Actin，博士德，1∶1 000)，4 ℃过夜，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(KPL，1∶3 000)，37 ℃孵育1小时后ECL显色，胶片显影定影后凝胶成像系统进行扫描照相，利用GelDoc XR 凝胶成像系统软件测算显色条带的灰度值并进行半定量分析。

2.1 Cav1.3钙离子通道蛋白的免疫组织化学检测结果在荧光显微镜下Cav1.3阳
性表达呈现绿色荧光，主要分布在小鼠耳蜗内外毛细胞的侧膜和顶膜、血管纹细胞，螺旋神经板缘细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、螺旋凸、螺旋神经节细胞的胞浆(图1)。

在荧光显微镜下Cav1.3阳性表达呈现绿色荧光，主要分布在小鼠耳蜗内外毛细胞的侧膜和顶膜、血管纹细胞、螺旋神经板缘细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、螺旋凸2.2 Cav1.3钙离子通道蛋白基因(CACNA1D)mRNA在耳蜗中的表达从图2可以
看出耳蜗和肾脏组织中均可以扩增出一条清晰的条带，大小为209 bp，内参GAPDH的大小为171 bp。

耳蜗各组织和肾脏的组织中均可以扩增出一条清晰的条带，大小为209 bp，内参GAPDH的大小为171 bp。

a.Marker 1标记物；b.耳蜗组织GAPDH；c.肾脏GAPDH；d.肾脏Cav1.3表达；e.基底膜Cav1.3表达；f.耳蜗侧壁Cav1.3表达；
g.螺旋神经节Cav1.3表达
2.3 Cav1.3蛋白印迹分析图3显示肾脏、全耳蜗组织以及分离的耳蜗侧壁、基底膜、螺旋神经节区组织均有Cav1.3蛋白的表达。

Cav1.3 钙离子通道蛋白的大小
为199 kDa，内参β-actin 的大小为43 kDa。

对蛋白电泳条带进行半定量分析可见：Cav1.3钙离子通道蛋白在内耳不同组织间的表达有一定的差异 (one-way ANOVA, F=18.425, df=3,P<0.001)，其中耳蜗组织中基底膜上最多
(1.639±0.181)，螺旋神经节区组织次之(1.413±0.130)，耳蜗侧壁(0.543±0.031)和前两者相比其表达的量相对较少；与耳蜗侧壁组织相比，基底膜上的Cav1.3的表达更丰富，差异有显著统计学意义(Tukey’s test, q=9.746,P<0.001)。

螺旋
神经节区组织和耳蜗侧壁组织Cav1.3钙离子通道蛋白的表达也有一定的统计学差异(Tukey’s test, q=7.732, P=0.002<0.05)，而基底膜和螺旋神经节区组织
Cav1.3钙离子通道蛋白的表达无统计学差异(Tukey’s test,
q=2.014,P=0.192>0.05)。

说明Cav1.3钙离子通道蛋白在内耳不同组织中的表达具有一定的组织特异性。

钙离子是一个重要的生物信号分子，调节众多的生化及生理过程，特别是细胞间的信息交流都与细胞内游离的Ca2+密切相关。

细胞内Ca2+浓度小量而快速的波动
调节细胞间生理信号的传递，Ca2+超载将诱导相关酶类的过度激活，导致自由基的过度释放，致使细胞发生过度损伤或DNA降解，最终导致细胞死亡。

在内耳，Ca2+参与了内耳机械转导、适应、调谐、受体电位的形成和神经递质的释放等多种生理过程[2,3]。

研究发现作为内耳的主要电压型钙离子通道，Cav1.3对毛细胞
的正常发育和突触信息传递至关重要[4,5]。

通过对Cav1.3钙离子通道基因敲除老鼠的研究发现，毛细胞Cav1.3 离子通道的缺失可以引起传导性聋和毛细胞的退变[6,7]；最新研究发现Cav1.3钙离子通道对于听力和心脏正常功能的发挥不可或缺[6～8]，Cav1.3钙离子通道哪怕仅仅一个亚基的功能缺失就足以导致人类的离子
通道疾病，目前这种疾病暂时称为感音神经性聋和窦房结功能异常综合征，其主要表现就是耳聋和窦房结功能的紊乱[6～8]。

由此可见，Cav1.3钙离子通道对于听
觉功能至关重要，其在内耳不同组织间的分布模式可能与内耳的钙离子稳态有关。

对于Cav1.3钙离子通道在哺乳动物内耳中的研究目前主要集中在其电生理特性上，而对于其在整个耳蜗中的具体分布模式及其意义还未完全阐明。

本研究结果显示Cav1.3钙离子通道在大鼠耳蜗不同组织间的表达有一定的特异性，与先前的研究[4,9]一样，本研究在耳蜗内、外毛细胞和螺旋神经节上检测到了Cav1.3钙离子通道蛋白的表达；此外，本研究还发现Cav1.3钙离子通道蛋白在耳蜗侧壁血管纹、螺旋韧带以及螺旋板缘细胞也有一定量的表达；RT-PCR和Western blot结果进一步证实了Cav1.3钙离子通道蛋白基因(CACNA1D)的组织特异性，Cav1.3钙离子通道蛋白主要表达在基底膜和螺旋神经节组织，螺旋韧带和血管纹等有一定量的表达。

推测Cav1.3钙离子通道在耳蜗不同组织间的特异性表达与维持耳蜗钙离子的浓度的稳态有关。

内耳中，内淋巴是一种不同寻常的细胞外液，维持着高钾，低钠和低钙的离子状态[10]，内淋巴Ca2+浓度仅有20 μM，这和外淋巴液等其他细胞外液1～2 mM的Ca2+浓度相比很低[10]；要发挥正常的听觉功能，内淋巴的
钙离子浓度不能太高也不能太低，过高的钙离子浓度可以阻滞听觉信号的传导和微
音器电位的形成，反之，过低的钙离子浓度也可以抑制微音器电位的形成[11,12]；此外，瞬间缺氧或者利尿剂的使用可以引起内淋巴钙离子浓度迅速升高，伴随着钙离子浓度的升高，内淋巴电位(endocochlear potential，EP)出现大幅度下降[12]，通过内淋巴或椎动脉应用尼莫地平等可以抑制瞬间窒息引起的EP下降；相反，也有研究发现内淋巴钙离子的吸收部分是由EP梯度驱动的[13]。

由此进一步说明，Cav1.3在内耳组织的这种差异性表达可能与内耳听觉及钙离子稳态息息相关。

综上所述，本研究阐明了Cav1.3钙离子通道在大鼠耳蜗中的特异性表达模式，主要表达在内外毛细胞、螺旋神经节、螺旋韧带、血管纹和螺旋板缘细胞；耳蜗不同组织间Cav1.3钙离子通道的表达差异可能与内耳钙离子的稳态、EP的调节、内
耳的发育密切相关；但是对于其如何调节EP的详细机制需要进一步的研究；同样，对于其在非感觉上皮细胞上的表达意义也有待新的研究去探索。

本研究为进一步阐明Cav1.3钙离子通道在内耳听觉生理和病理中的作用机制提供了新的方向。

【相关文献】
1 Nemzou NRM，Bulankina AV， Khimich D, et al. Synaptic organization in cochlear inner hair cells deficient for the Cav1.3 (α1D) subunit of L-type Ca2+ channels[J]. Neuroscience,2006,141:1849.
2 Fettiplace R, Hackney CM. The sensory and motor roles of auditory hair cells[J]. Nature Rev Neurosci,2006,7:19.
3 Fuchs PA, Parsons TD. The synaptic physiology of hair cells[M]. In: Eatock RA, Fay RR, Popper AN,Eds.Vertebrate Hair Cells. Springer：New York, 2006.249～312.
4 Brandt A, Striessnig J, Moser T, et al. Cav1.3 channels are essential for development and presynaptic activity of cochlear inner hair cells[J]. J Neurosci,2003,23:10832.
5 Baig SM, Koschak A, Lieb A, et al. Loss of Cav1.3 (CACNA1D) function in a human channelopathy with bradycardia and congenital deafness[J]. Nat Neurosci,2011,14:77.
6 Inagaki A, Ugawa S, Yamamura H, et al.The Cav3.1 T-type Ca2+ channel contributes to voltage-dependent calcium currents in rat outer hair cells[J].Brain Res,2008,1201:68.
7 Platzer J, Engel J, Schrott-Fischer A, et al. Congenital deafness and sinoatrial node
dysfunction in mice lacking class D L-type Ca2+ channels[J]. Cell,2000,102:89.
8 Zuccotti A, Clementi S, Reinbothe T, et al. Structural and functional differences between L-type calcium channels: crucial issues for future selective targeting[J]. Trends Pharmacol Sci,2011,32:366.
9 Michna M, Knirsch M, Hoda JC, et al. Cav1.3 (alpha1D) Ca2+ currents in neonatal outer hair cells of mice[J]. J Physiol,2003,553:747.
10 Mammano F, Bortolozzi M, Ortolano S, et al. Ca2+ signaling in the inner ear[J]. Physiology (Bethesda),2007,22:131.
11 Ricci AJ, Fettiplace R.Calcium permeation of the turtle hair cell mechanotransducer channel and its relation to the composition of endolymph[J]. J Physiol,1998,506(Pt1):159.
12 Inui T, Mori Y, Watanabe M, et al. Physiological role of L-type Ca2+ channels in marginal cells in the stria vascularis of guinea pigs[J]. J Physiol Sci,2007,57:287.
13 Mori Y, Watanabe M, Inui T, et al. Ca2+ regulation of endocochlear potential in marginal cells[J]. J Physiol Sci,2009,59:355.。