柑橘原生质体融合技术简述

柑橘原生质体融合技术简述
文峰;苏文潘;陆家禛;罗燕春;张继;吕丽兰
【摘要】原生质体融合技术能打破柑橘传统育种中常遇到的问题,如远缘杂交不亲和、雌或雄性器官败育以及珠心胚干扰等问题的限制,实现核基因和胞质基因重组,为柑橘遗传育种提供了一条新的途径.柑橘作为原生质体融合技术中最为成功的作物之一,值得其他作物借鉴.本文详细阐述了柑橘原生质体在电场诱导作用下,采取“叶肉原生质体+胚性愈伤组织原生质体”的对称融合模式再生植株的整个技术过程,对于原生质体操作技术的初学者有一定借鉴作用.
【期刊名称】《农业研究与应用》
【年(卷),期】2016(000)005
【总页数】4页(P33-36)
【关键词】柑橘;原生质体;电融合;对称融合;非对称融合;再生
【作者】文峰;苏文潘;陆家禛;罗燕春;张继;吕丽兰
【作者单位】广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001;华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001;百色职业学院;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁530001【正文语种】中文
柑橘是世界第一大水果。

近年来，我国柑橘产业一直保持着持续稳定的发展，柑橘面积、产量均居世界首位［1］。

柑橘产业持续稳定的发展，不仅依赖于栽培技术
的不断提高，也依赖于推陈出新的新品种不断被选育。

柑橘具有遗传高度异质性、一些品种雌或雄器官败育、花期不遇、童期长的特点，且大多数品种具有珠心胚现象，使柑橘传统育种受到限制。

随着生物技术的兴起，原生质体融合技术为柑橘遗传育种提供了一条新途径。

原生质体融合技术能打破柑橘远缘杂交不亲和、有性杂交过程中遇到的性器官败育以及珠心胚干扰等问题的限制［2］，是有性杂交育种的补充。

这一技术不仅可以实现核DNA重组，也可使胞质基因实现重组，还能转移多基因编码的性状（如作物的产量、品质、抗逆、抗病虫等性状），可创造常规杂交育种不能创造的新种质资源。

因此，原生质体融合技术备受柑橘育种学家青睐。

原生质体融合能产生3种体细胞杂种类型：①综合了融合双亲全部遗传物质的对称杂种；②融合双亲或其中一方的部分遗传物质发生丢失的非对称杂种；③融合双亲一方核遗传物质完全丢失，只具有另一方核物质，但具有双方的细胞质遗传物质的胞质杂种。

自Ohgawara等［3］得到首例柑橘属间体细胞杂种植株以来，柑橘体细胞杂种或胞质杂种不断被创造，利用原生质体融合技术为柑橘遗传育种提供了大量可供选择和利用的创新种质资源。

柑橘作为原生质体融合技术中最为成功的作物之一，值得其他作物借鉴。

柑橘原生质体融合主要采用“叶肉原生质体+胚性愈伤组织原生质体”的模式，融合方式主要有对称融合和非对称融合2种，融合方法主要有聚乙二醇（PEG）化学诱导和电场诱导2种。

对称融合是指亲本原生质体在融和前未进行任何处理的一种融和方式；非对称融合是指在融和前，一方原生质体用射线照射处理，钝化其细胞核或使其丢失一部分染色体（称为供体），另一方原生质体不进过处理或经碘乙酰胺、碘乙酸、罗丹明6G等化学试剂处理（称为受体）的融合。

柑橘原生质体融合早期是采用PEG融合法。

该方法具有费用低的优点，但操作繁琐、融合率低且对细胞有毒害作用。

目前较多采用的是电场诱导融合。

该方法操作简单、融合率高
（双核异核体率可达15%以上）、对原生质体无毒害作用，并能促进细胞分裂、生长和植株再生［5］。

缺点是实验设备昂贵。

2.1 融合材料的准备
植物一般可以从茎尖、嫩叶、子叶、下胚轴、愈伤组织和悬浮培养物等分离出原生质体，但大多数成功的经验是先诱导出胚性愈伤组织，再建立胚性悬浮系，从胚性悬浮系分离出的原生质体有利于植株再生。

2.1.1 胚性悬浮系建立
胚性悬浮系的建立参照付春华［6］的方法进行。

从MT固体培养基上挑出颜色淡黄、颗粒细小、疏松、分散、生长旺盛的胚性愈伤组织到液体悬浮培养基
（MT+500 mg/L ME+1.5 g/L谷氨酰胺+40 g/L蔗糖）中进行悬浮培养。

每2周继代1次，培养条件为暗培养，28℃，转速115 r/min。

继代3次后用于原生质体分离。

2.1.2 叶肉亲本准备
先用1%NaOH浸泡成熟的柑橘种子5～10 min。

用自来水冲洗干净后，再用1%～3%NaClO表面消毒种子10～15 min。

无菌蒸馏水清洗种子3～6次后，将种皮剥去，接种在MT固体培养基上，播种30 d左右后取叶片用于分离叶肉原生质体。

2.2 原生质体分离与纯化
柑橘原生质体的分离和纯化参考Grosser和Gmitter［7］的方法，稍作修改。

2.2.1 愈伤组织原生质体酶解
用吸管吸取约1 g液体胚性悬浮系组织到60 mm×15 mm的无菌塑料培养皿中，吸干液体培养基后，加入0.7 mol/L EME培养基（MT+500 mg/L ME+0.7
mol/L蔗糖），约1.5 mL，再加入等体积的酶液（1.2%离析酶R-10+1.2%纤维素酶R-10+ 12.7%甘露醇+0.12%MES+0.36%CaCl2·2H2O+
0.011%NaH2PO4）。

暗培养条件下，转速30～40 r/min，酶解16～20 h。

2.2.2 叶肉原生质体酶解
先将约1.5 mL的0.6 mol/L EME培养基（MT +500 mg/L ME+0.6 mo1/L蔗糖）加入到无菌塑料培养皿中，再将切成1 mm左右条状的嫩叶片放入，最后再加入
等体积的酶液（1.5%离析酶R-10+ 1.5%纤维素酶R-10，其他成分和浓度与酶解悬浮系愈伤组织原生质体的酶液相同）。

暗培养条件下，静置酶解16～20 h。

将酶解好的愈伤组织和叶片组织分别经孔径为45 μm的不锈钢网筛过滤，滤液分
别转入10 mL的玻璃离心管，离心6 min，弃上清液，沉淀用1～1.5 mL
CPW13盐悬浮，然后用吸管缓缓转入预先加入了3～4 mL CPW26的离心管中，离心3 min，CPW 13和CPW 26中间界面形成一条清晰的原生质体带（愈伤原
生质体带为白色、叶肉原生质体带为绿色）。

用吸管轻轻将原生质体带吸出，用电融合液（0.7 mol/L甘露醇+0.25 m mol/L CaC12）悬浮，离心6 min。

纯化后
的愈伤组织原生质体和叶肉原生质体分别用电融合液悬浮，密度调整分别为
1×106个/mL和2×106个/mL。

上述离心力均为960 r/min。

2.3 原生质体活性侧定
柑橘中原生质体活性的测定通常用荧光素双醋酸酯（FDA）染色法。

参照付春华［9］的方法进行：将12 μl浓度为5 mg/mL的FDA加入到0.5 mL纯化后的原
生质体中，静止5 min后在荧光显微镜下（WIB激发光）观察，每个处理统计10个视野，取平均值。

原生质体活性（%）=WIB激发光下发出荧光的原生质体数/同一视野中原生质体
总数×100%。

2.4 原生质体电融合
2.4.1 电融合法的基本原理
融合小室在高频、不均匀的交流电场（AC）作用下，使原生质体两极的电场强度
不同，从而原生质体表面电荷偶极化而具有偶极子的性质，使原生质体沿电场线排列而运动。

原生质体串连成珍珠串、平行排列后，再加以直流脉冲（DC）作用，
原生质体的细胞膜发生可逆性的电击穿，相接触的原生质体发生融合。

整个融合过程时间很短。

2.4.2 电融合过程
柑橘原生质体融合参照Guo and Deng［8］的方法，稍作修改。

采用日本岛津公司SSH-2型（Shimadzu Somatic Hybridizer-2，Japan）的细胞融合仪，融合
小池为FTC-04，其容积为1.6 mL、电极距离为0.4 cm。

融合前，融合小池先用
电融合液洗涤1～2次。

将调整了密度的愈伤原生质体和叶肉原生质体等体积混合，混合后，愈伤原生质体和叶肉原生质体的比例是1：2。

吸取约1.6 mL混匀了的
含双亲原生质体的电融合液到融合小池中，在小池中央滴几滴融合液保湿，封口静置5～10 min后融合，融合参数为：交变电场强度（AC）100 V/cm，交变电场
作用时间60 s，直流脉冲强度（DC）1250 V/cm，直流脉冲作用时间45 μs，直流脉冲间隔时间0.5 s，直流脉冲次数5次。

融合后静置8～15 min，这样利于融合原生质体变圆。

融合后的融合产物用吸管轻轻吸出到离心管中，用BH3液体培
养基离心洗涤，离心力960 r/min，离心6～8 min。

原生质体沉淀用BH3液体培养基悬浮，密度调整到（0.5～1）×105个/mL。

2.5 融合产物培养再生
原生质体培养采用液体浅层培养方法。

用吸管将密度为（0.5～1）×105个/mL的融合产物移至无菌塑料培养皿中，每皿1.5 mL左右，封口后暗培养，温度28℃。

培养3～10 d后，原生质体再生细胞壁，并开始第1次分裂。

培养约20～30 d 后，原生质体分裂成多细胞团，此时需加入几滴0.6 mol/L BH3和0.3 mol/L EME培养基，降低培养基的渗透压，促进细胞分裂。

此后1～2星期再加1次。

当原生质体长成肉眼可见的约1～2 mm的小细胞团时，将小细胞团挑出，放在甘
油固体培养基（MT+20 mL甘油）或EME500（MT+500 mg/L ME+50 g/L蔗糖）或乳糖固体培养基（MT+乳糖50mg/L）上，然后在固体培养基上覆盖薄薄
一层BH3液体培养基，在光下进行固-液双层培养诱导胚状体的发生。

长出的球形胚、心形胚及时转入EME1500固体培养基（MT+1500 mg/L ME+50 g/L蔗糖）上，发育到子叶期的胚状体转移到生芽培养基（MT+ 0.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L KT+0.1 mg/LNAA+30 g/L蔗糖）上诱导生芽，再生的芽长至2～3 cm长时，用手术刀切下转移到生根培养基（1/2 MT+0.1 mg/L IBA+0.5 mg/L NAA+0.5 g/L 活性炭+20 g/L蔗糖）中生根。

培养土先经高温高压灭菌。

用自来水洗净再生苗的根部培养基。

将再生苗移入穿有透气孔的1次性塑料杯中，并用有透气孔的塑料杯罩上。

培养1个月左右，待长
出2～3片新叶后带土转移到培养钵中，并用有透气孔的塑料杯罩上。

约2～3周后，植株长出新叶时拿去塑料杯。

随着生物技术的发展，原生质体融合技术已经是常规杂交育种的补充手段，是作物育种中重要的组成部分。

柑橘是原生质体融合中最为成功的作物之一。

文章详细阐述了柑橘原生质体从分离、纯化、融合、培养，到再生完整植株的技术过程，对原生质体操作技术的初学者有一定借鉴作用。

致谢：研究得到国家自然科学基金（31401438）、农业部热带作物种质资源保护项目（13RZZY-39）资助。

【相关文献】
［1］梁武军，解凯东，谢宗周，等.三倍体葡萄柚实生后代多倍体的发掘与SSR遗传鉴定［J］.果
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［2］解凯东，王晓培，谢宗周，等.4个柑桔体细胞杂种砧木资源的种子特性评价［J］.中国南方
果树，2013，42（5）：53-55.
［3］Ohgawara T，Kobayashi S，Uchimiya H，Ishii S.Somatic hybrid plants obtained by
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