【论文】高效液相色谱法检测植物激素方法的建立

摘要
植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的几类微量有机物质。

也被称为植物天然激素或植物内源激素。

它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化。

由于它在植物体内含量甚微，一般水平为1000 ng/g鲜重，建立一种有效，简便的检测方法对于研究植物激素具有指导性意义。

目前植物激素的定性和定量分析主要以理化方法为主，理化测试法包括气相色谱法、液相色谱法、气象－质谱联用等。

本次研究是利用高效液相色谱法来检测植物体内的酸性激素，即吲哚乙酸IAA,吲哚三丁酸IBA，赤霉素GA3,以及脱落酸ABA。

以HPLC进行分析测试，非常适合用于分析那些不能汽化或者在易于裂解不稳定的物质，用HPLC分析植物激素（IAA、IBA、GA3、ABA），采用二极管阵列检测器检测，本次研究的前处理方法为固相萃取法。

通过本次实验，得到了一种简便易操作的前处理方法，找到了液相色谱的最佳工作条件，并通过检测实际样品，证明了该方法是一种有效可行的植物酸性激素的定性定量分析方法。

关键字：植物激素，提取，高效液相色谱。

Abstract
Plant hormone is several kinds of trace of organic matter that synthesized in the plant,and it have significant effect on plant growth. They separately or coordinatively regulate of plant growth, development and differentiation. Because it is a trace contect in plants and general level, 1000 ng / g in fresh weight. Therefore, the establishment of an effective and simple detection method for the study of plant hormones is very significant.Present plant hormones qualitative and quantitative analysis mainly based on physical and chemical methods, physical and chemical testing methods including GC, HPLC, GC-MS.
with high performance liquid chromatography, the acidic hormones of IAA, indole-3 butyric IBA, gibberellic acid GA3, and ABA in plants are detected. It is suitable for the analysis of those which do not vaporize easily at high temperatures by HPLC. Analysis of plant hormones (IAA, IBA, GA3, ABA), usually use UV monitor testing, and this study of pre-treatment method for solid phase extraction.
A simple and easy pre-treatment methods was established, and found the best conditions for liquid chromatography.With detecting the actual samples, Iit shows that it is the feasible and effective method of the acidic hormones analysis .
Key words: plant hormones, extraction, detection, HPLC.
目 录
第一章 前 言 (1)
1.1 植物激素的研究背景与意义 (1)
1.2 植物激素的种类及性质 (1)
1.2.1植物激素概述 (1)
1.2.2植物激素——生长素 (2)
1.2.3植物素——赤霉素 (3)
1.2.4植物激素——细胞分裂素 (4)
1.2.5植物激素——脱落酸 (4)
1.2.6植物激素——乙烯 (4)
1.3液相色谱法的研究 (5)
1.3.1液相色谱仪 (5)
1.3.2 液相色谱法的主要类型 (8)
第二章 实验材料与方法 (11)
2.1仪器与试剂 (11)
2.2 实验方法 (11)
2.2.1 芽样品激素含量的测定 (12)
2.2.2种子样品激素含量的测定 (12)
2.2.3 C18柱系统的处理及使用（需临时处理） (12)
2.2.4 高效液相色谱分析 (12)
2.2.5溶液的配制 (13)
2.2.6 标准曲线的测定 (14)
2.2.7 稳定性实验 (15)
2.2.8回收率的测定 (16)
2.2.9 检出限的测定 (16)
第三章 实验结果与讨 (17)
3.1标准曲线的绘制 (17)
3.1.1 IAA标准曲线的绘制 (17)
3.1.2 IBA标准曲线的绘制 (17)
3.1.3 ABA标准曲线的绘制 (18)
3.1.4 GA3标准曲线的绘制 (19)
3.2稳定性实验 (20)
3.3 实际样品激素含量测定 (21)
3.4回收率的测定 (22)
3.4.1 GA3回收率谱图 (22)
3.4.2 IAA回收率谱图 (23)
3.4.3 ABA回收率谱图 (24)
3.4.4 IBA回收率谱图 (24)
3.5 检出限的测定 (25)
第四章 结论 (27)
参考文献 (28)
致谢 (30)
第一章前言
1.1 植物激素的研究背景与意义
植物激素是存在于植物体内的具有调节植物生长发育作用的微量元素。

它在不同植物体内的含量也大不相同。

它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发以及离体组织培养等方面，分别或相互协调地调控植物的生长、发育与分化[1]。

目前植物激素的定性和定量分析所采用的方法可概括为生物分析和理化分析方法。

虽然有些生物分析方法也有很高的灵敏度，但受检测手段的限制，定量分析的精度很低，特别是对于同类激素的不同种类往往缺乏分辨能力，分析时间又较长，使其发展受到限制。

现在则主要以理化方法为主，理化测试法包括气相色谱法、液相色谱法、气象－质谱联用等[1]，这里介绍高效液相色谱法（HPLC）。

以HPLC进行分析测试，无需将要分析的物质汽化，因此非常适合用于分析那些不以汽化或者在高温下易于破坏的物质，用HP LC分析植物激素（IAA、GA、ABA和CKs等），通常采用紫外监测器检测。

通过一定的前处理方法，使植物激素进行纯化和富集，再运用高效液相色谱法检测激素的含量，对研究植物生长具有重大意义。

1.2 植物激素的种类及性质
1.2.1植物激素概述
植物自身产生的、运往其他部位后能调节植物生长发育的微量有机物质称为植物激素。

人工合成的具有植物激素活性的物质称为生长调节剂。

已知的植物激素主要有以下5类：生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯，而油菜素甾醇也逐渐被公认为第六大类植物激素[1]。

它们都是些简单的小分子化合物，但它们的生理效应却非常复杂、多样。

所以，植物激素对植物的生长发育有重要的调节控制作用。

植物激素的化学结构已为人所知，有的已可以人工合成，如吲哚乙酸；有的还不能人工合成，如赤霉素。

目前市场上售出的赤霉素试剂是从赤霉菌的培养过滤物中制取的。

这些外加于植物的吲哚乙酸和赤霉素，与植物体自身产生的吲哚乙酸和赤霉素在来源上有所不同，所以作为植物生长调节剂，也称为外源植物激素[2]。

吲哚乙酸IAA吲哚三丁酸IBA
脱落酸ABA 赤霉素GA3
1.2.2植物激素——生长素
Charles.D.Darwin在1880年研究植物向性运动时，发现植物幼嫩的尖端受单侧光照射后产生的一种影响，能传到茎的伸长区引起弯曲。

1928年荷兰F.W.温特从燕麦胚芽鞘尖端分离出一种具生理活性的物质，称为生长素，它正是引起胚芽鞘伸长的物质[2]。

1934年荷兰F.克格尔等从人尿得到生长素的结晶，经鉴定为吲哚乙酸，促进橡胶树漆树等排出乳汁。

在植物中，吲哚乙酸通过酶促反应从色氨酸合成。

十字花科植物中合成吲哚乙酸的前体为吲哚乙腈，西葫芦中有相当多的吲哚乙醇，也可转变为吲哚乙酸。

已合成的生长素又可被植物体内的酶或外界的光所分解，因而处于不断的合成与分解之中[3]。

生长素在低等和高等植物中普遍存在。

生长素主要集中在幼嫩、正生长的部位，如禾谷类的胚芽鞘，它的产生具有“自促作用”，双子叶植物的茎顶端、幼叶、花粉和子房以及正在生长的果实、种子等；衰老器官中含量极少。

低浓度的生长素有促进器官伸长的作用，从而可减少蒸腾失水。

超过最适浓度时由于会导致乙烯产生，生长的促进作用下降，甚至反会转为抑制。

不同器官
对生长素的反应不同，根最敏感，芽次之，茎的敏感性最差。

种子中较高的脱落酸含量是种子休眠的主要原因。

生长素能促进细胞伸长的主要原因，在于它能使细胞壁环境酸化、水解酶的活性增加，从而使细胞壁的结构松弛、可塑性增加，有利于细胞体积增大。

生长素还能促进RNA和蛋白质的合成，促进细胞的分裂与分化。

生长素具有双重性，不仅能促进植物生长，也能抑制植物生长。

低浓度的生长素促进植物生长，过高浓度的生长素抑制植物生长。

2,4－D曾被用做选择性除草剂。

生长素即吲哚乙酸可以人工合成。

生产上使用的是人工合成的类似生长素的物质如吲哚丙酸、吲哚丁酸、萘乙酸、2,4－D等，可用于防止脱落、促进单性结实、疏花蔬果、插条生根、防止马铃薯发芽等方面。

愈伤组织容易生根；反之容易生芽[3]。

1.2.3植物激素——赤霉素
1926年日本黑泽在水稻恶苗病的研究中，发现感病稻苗的徒长和黄化现象与赤霉素有关。

1935年薮田和住木从赤霉菌的分泌物中分离出了有生理活性的物质，定名为赤霉素(GA)。

从50年代开始，英、美的科学工作者对赤霉素进行了研究，现已从赤霉菌和高等植物中分离出60多种赤霉素，分别被命名为GA1，GA2等。

以后从植物中发现有十多种细胞分裂素，赤霉素广泛存在于菌类、藻类、蕨类、裸子植物及被子植物中。

商品生产的赤霉素是GA3、GA4和GA7。

GA3又称赤霉酸，是最早分离、鉴定出来的赤霉素，分子式为C19H22O6。

即6-呋喃氨基嘌呤[4]。

高等植物中的赤霉素主要存在于幼根、幼叶、幼嫩种子和果实等部位，由甲羟戊酸经贝壳杉烯等中间物合成。

后证明其中含有一种能诱导细胞分裂的成分，赤霉素在植物体内运输时无极性，通常由木质部向上运输，由韧皮部向下或双向运输。

赤霉素最显著的效应是促进植物茎伸长。

无合成赤霉素的遗传基因的矮生品种，用赤霉素处理可以明显地引起茎秆伸长。

目前在啤酒工业上多用赤霉素促进a－淀粉酶的产生，赤霉素也促进禾本科植物叶的伸长。

在蔬菜生产上，常用赤霉素来提高茎叶用蔬菜的产量。

一些需低温和长日照才能开花的二年生植物，干种子吸水后，用赤霉素处理可以代替低温作用，使之在第1年开花。

赤霉素还可促进果实发育和单性结实，打破块茎和种子的休眠，促进发芽。

干种子吸水后，胚中产生的赤霉素能诱导糊粉层内a－淀粉酶的合成和其他水解酶活性的增加，常用赤霉素来提高茎叶用蔬菜的产量。

促使淀粉水解，在蔬菜生产上，加速种子发芽。

1.2.4植物激素——细胞分裂素
这种物质的发现是从激动素的发现开始的。

由韧皮部向下或双向运输。

1955年美国人F.斯库格等在烟草髓部组织培养中偶然发现培养基中加入从变质鲱鱼精子提取的DNA，可促进烟草愈伤组织强烈生长。

后证明其中含有一种能诱导细胞分裂的成分，称为激动素。

第一个天然细胞分裂素是1964年D.S.莱瑟姆等从未成熟的玉米种子中分离出来的玉米素。

以后从植物中发现有十多种细胞分裂素，都是腺嘌呤的衍生物[4]。

高等植物细胞分裂素存在于植物的根、叶、种子、果实等部位。

根尖合成的细胞分裂素可向上运到茎叶，但在未成熟的果实、种子中也有细胞分裂素形成。

细胞分裂素的主要生理作用是促进细胞分裂和防止叶子衰老。

绿色植物叶子衰老变黄是由于其中的蛋白质和叶绿素分解；而细胞分裂素可维持蛋白质的合成，从而使叶片保持绿色，细胞分裂素还可促进芽的分化。

在组织培养中当它们的含量大于生长素时，愈伤组织容易生芽；反之容易生根。

可用于防止脱落、促进单性结实、疏花疏果、插条生根、防止马铃薯发芽等方面。

人工合成的细胞分裂素苄基腺嘌呤常用于防止莴苣、芹菜、甘蓝等在贮存期间衰老变质。

1.2.5植物激素——脱落酸
60年代初美国人F.T.阿迪科特和英国人P.F.韦尔林分别从脱落的棉花幼果和桦树叶中分离出脱落酸，其分子式为C15H20O4。

脱落酸存在于植物的叶、休眠芽、成熟种子中。

通常在衰老的器官或组织中的含量比在幼嫩部分中的多。

它的作用在于抑制RNA和蛋白质的合成，从而抑制茎和侧芽生长，因此是一种生长抑制剂，有利于细胞体积增大。

与赤霉素有拮抗作用。

脱落酸通过促进离层的形成而促进叶柄的脱落，在于它能使细胞壁环境酸化、水解酶的活性增加，还能促进芽和种子休眠。

种子中较高的脱落酸含量是种子休眠的主要原因。

经层积处理的桃、红松等种子，芽次之，因其中的脱落酸含量减少而易于萌发，脱落酸也与叶片气孔的开闭有关。

小麦叶片干旱时，保卫细胞内脱落酸含量增加，气孔就关闭，从而可减少蒸腾失水，根尖的向重力性运动与脱落酸的分布有关[4]。

1.2.6植物激素——乙烯
早在20世纪初就发现用煤气灯照明时有一种气体能促进绿色柠檬变黄
而成熟，这种气体就是乙烯。

但直至60年代初期用气相层析仪从未成熟的果实中检测出极微量的乙烯后，乙烯才被列为植物激素。

乙烯广泛存在于植物的各种组织、器官中，是由蛋氨酸在供氧充足的条件下转化而成的。

它的产生具有“自促作用”，即乙烯的积累可以刺激更多的乙烯产生。

乙烯可以促进RNA和蛋白质的合成，在高等植物体内，并使细胞膜的透性增加， 加速呼吸作用。

因而果实中乙烯含量增加时，已合成的生长素又可被植物体内的酶或外界的光所分解，可促进其中有机物质的转化，加速成熟[5]。

乙烯也有促进器官脱落和衰老的作用。

用乙烯处理黄化幼苗茎可使茎加粗和叶柄偏上生长。

乙烯还可使瓜类植物雌花增多，在植物中，促进橡胶树、漆树等排出乳汁。

乙烯是气体，在田间应用不方便。

一种能释放乙烯的液体化合物2-氯乙基膦酸已广泛应用于果实催熟、棉花采收前脱叶和促进棉铃开裂吐絮、刺激橡胶乳汁分泌、水稻矮化、增加瓜类雌花及促进菠萝开花等。

1.3液相色谱法的研究
液相色谱法是20世纪70年代急剧发展起来的一项高效、快速的分离分析技术。

液相色谱法是指流动相为液体的色谱技术。

在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度监测器，实现了分析速度快，分离效率高和操作自动化。

液相色谱是利用不同组分在相对运动、相互不溶的两相中（相对静止的一相称为固定相，另一个相对运动的相称为流动相）的吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离[6]。

高压：液相色谱以液体作为流动相，这种液体称为载体。

由于载液流经色谱柱时，受到阻力较大，为了使载液迅速通过色谱柱，必须对载液施加高压。

高速：液相色谱由于采用了高压，载液流速快，因而所需的分析时间较之经典液体色谱法少得多。

高效：液相色谱法的柱效很高，约可达3万塔板/m以上。

高灵敏度：由于采用高灵敏度的检测器，最小检测量可达 10-9g，而所需试样量较少。

1.3.1液相色谱仪
高效液相色谱与色谱相比，虽然气相色谱法具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。

而高效液相色谱法，只要求试样
能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。

对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于 400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的 75% ～ 80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析[6]。

一、高压泵
液相色谱分析的流动相（载液）是用高压泵来输送的。

由于色谱柱很细（1～6mm） ，填充剂粒度小（目前常用颗粒直径为5～10µm） ，因此阻力很大，为达到快速、高效的分离，必须有很高的柱前压力，以获得高速的液流。

对高压输液泵来说，一般要求压力为 150～350×105Pa，关键是要流量稳定，因为它不仅影响柱效能，而且直接影响到峰面积的重现性和定量分析的精密度， 还会引起保留值和分辨能力的变化；另外，要求压力平稳无脉动，这是因为压力的不稳和脉动的变化，对很多检测器来说是很敏感的，它会使检测器的噪声加大，仪器的最小检测量变化；对于流速也要有一定的可调范围，因为载液的流速是分离条件之一[6]。

二、 梯度洗提装置（gradient elution）
液相色谱法中的梯度洗提，和气相色谱法中的程序升温一样，给分离工作带来很大的方便，现在已成为完整的液相色谱仪中一个重要的不可缺少的部分。

所谓梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性[6]， 通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。

应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，由于峰形的改善，还可以提高最小检测量和定量分析的精度。

梯度洗提可以采用在常压下预先按一定的程序将溶剂用高压泵增压以后输入色谱柱， 这叫做低压梯度，也称外梯度；也可以将溶剂用高压泵增加以后输入色谱系统的梯度混合室，加入混合后送入色谱柱，即所谓高压梯度或称内梯度系统。

三、 进样装置
在液相色谱中，进样方式及试样体积对柱效有很大的影响。

要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样“浓缩”地瞬时注入到色谱柱上端柱担体的中心成一个小点。

如果把试样注入到柱担体前的流动相中， 通常会使溶剂以扩散形式进入柱顶，就会导致试样组分分离能力的降低[7]。

目前，符合要求的进样方式主要有以下两种。

注射器进样装置的进样方式同气相色谱法一样， 试样用微量注射器刺过装有弹性隔膜的进样器， 针尖直达上端固定相或多孔不锈钢滤片， 然后迅速按下注射器芯，试样以小滴的形式到达固定相床层的顶端。

高压定量进样阀是通过进样阀（常用六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相流动的一种进样装置。

进样体积是由定量管的体积严格控制的，所以进样准确，重
现性好，适于作定量分析。

要换不同体积的定量管，可调整进样量。

四、 色谱柱
色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。

常用的填料为硅胶，可用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。

其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即 ODS 柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

目前、商品色谱柱有普通型、快速型、氨基酸柱、凝胶色谱柱和凝胶过滤专用柱。

为符合GLP要求，已有色谱柱识别器问世[8]。

近年来，由于柱切换技术的发展，使难以分析的痕量毒物和体内药物，经预处理、定性定量融为一体的系统处理，均能快速简便地进行分析。

五、检测器
检测器用于连续检测色谱柱流出的物质， 进行定性定量分析。

要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。

近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了 LC 的应用。

1.紫外光度检测器
紫外光度检测是液相色谱法广泛使用得检测器， 它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度和吸光度的关系遵守比尔定律。

紫外光度检测器有固定波长（单波长和多波长）和可变波长（紫外分光和紫外可见分光）两类。

紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度可达 10-9g/ml，因而即使是那些对紫外光吸收较弱的物质，也可用这种检测器进行检测。

此外，这种检测器对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提，其结构较简单，缺点是不适用于对紫外光完全不吸收的试样，溶剂的选用受限制（紫外光不透过的溶剂如苯等不能用）[8]。

为了扩大应用范围和提高选择性，可应用可变波长检测器。

2.示差折光检测器
示差折光检测器是借连续测定流通池中溶液折射率的方法来测定试样浓度的检测器。

溶液的折光率是纯溶剂（流动相）和纯溶质（试样）的折射率乘以各物质的浓度之和[9]。

因此溶有试样的流动相和纯流动相之间折射率之差，表示试样在流动相中的浓度。

3.电导检测器
电导检测器属电化学检测器，是离子色谱法中使用最广泛的检测器。

其作用原理是根据物质在某些介质中电离后所产生电导变化来测定电离物质含量。

电导池内的检测探头是由一对平行的铂电极组成，将两电极构成电桥的一个检测臂。

电桥可用直流电源，也可用高频交流电源[11]。

电导检测器的影响因受温度的
影响较大，因此要求严格控制温度。

一般在电导池内放置热敏电阻器进行监测。

4.荧光检测器
荧光检测器是一种很灵敏和选择性好的检测器。

许多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，例如多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物等，许多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类化合物都可用荧光检测器检测，其中某些不发射荧光的物质亦可通过化学衍生转变成能发出荧光的物质而得到检测[11]。

1.3.2 液相色谱法的主要类型
根据分离机制的不同，液相色谱法可分为下述几种主要类型：液－固色谱法、液－液色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、空间排阻色谱法等。

一、 液－固色谱法
流动相为液体， 固定相为吸附剂。

这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。

其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。

如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子将相应减少。

显然，分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附力强，保留值就大[12]。

液－固色谱法适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高的选择性。

凡能用薄层色谱法成功地进行分离的化合物，亦可用液－固色谱法进行分离。

缺点是由于非线性等温吸附常引起峰的拖尾现象[13]。

二、 液－液色谱法
流动相和固定相都是液体。

从理论上说，流动相和固定相之间应互不相溶，两者之间有一个明显的分界面。

试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异因而溶质在两相间进行分配[14]。

当达到平衡时，物质的分配同样服从于下式：
式中 K是分系数，k 是容量因子，Cs 和 Cm是溶质在固定相和流动相中的浓度，Vm 和 Vs 分别为流动相和固定相的体积。

液分配色谱法与气－液分配色谱法之间有相似之处，即分离的顺序决定于分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大；但也有不同之处，气相色谱法中
流动相的性质对分配系数影响不大， 而液相色谱法中流动相的种类对分配系数却有较大的影响[15]。

在液－液色谱法中，一般为了避免固定液的流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相， 即流动相的极性小于固定液的极性， 这种情况称为正相液－液色谱法。

反之，若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液－液色谱法，这是因为后者的出峰顺序正好与正相液－液色谱相反的缘故。

但是在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果[16]。

三、 离子交换色谱法
色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。

凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

被分析物质电离后产生的离子与树脂上带相同电荷的离子（反离子）进行交换而达到平衡[17]。

离子交换色谱法主要用来分离离子或可解离的化合物，它不仅应用于无机离子的分离，例如稀土化合物及各种裂变产物，还用于有机物的分离，20世纪 60年代前后，已成功地分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛地应用。

四、 离子对色谱法
种强极性的有机酸、有机碱的分离分析是液相色谱法中地重要课题。

利用吸附或分配色谱法一般需要强极性的洗脱液，并容易发生严重的拖尾现象。

利用离子交换色谱法需要选择合适的 pH条件，此外以高分子材料为基体的树脂性填料一般不能耐受高压，传质性能也较差。

若利用离子对色谱法，则分离效能高，分析速度快，操作简单[18]。

因此近年来这种方法发展十分迅速。

离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。

用于阴离子分离的对离子是烷基铵类，如氢氧化四丁基铵，氢氧化十六烷基三甲铵等；用于阳离子的对离子是烷基磺酸类，如己烷磺酸钠等
五、 空间排阻色谱法
空间排阻色谱法以凝胶为固定相。

它的分离机理与其它色谱法完全不同。

它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。

溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。

分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。

色谱柱内填充以凝胶，对于一定的凝胶，它具有一定大小的空穴分布。

试样进入色。