qPCR实时荧光定量PCR教学文案

qPCR实时荧光定量PCR
如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号 ,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。
Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反应管内的荧光 信号达到设定的域值时所经历的循环数。
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的增加而线性降 低,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。其中 横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要 获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的 起始拷贝数。
(2)TaqManቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的 荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。 当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭 基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶 切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可 接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子 形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
1.3 特点
一般PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭 （EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染 色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会 带来假阳性的污染。而荧光定量PCR克服了常规PCR的许 多缺点,有着如下显著的优点:
(1)特异性好。使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子 进行识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针 双重控制,特异性好、假阳性低。
(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、 荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术, 因此大大提高了其检测灵敏度。
(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩 增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接 对产物进行定量。
(4)操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测在 全封闭的同一管内检测,不需要开盖,降低了溴化乙锭的污 染。同时扩增和检测一步完成,不需要后期处理,不再需要 担心放射性污染。
(5)速度快、效率高。可在2-3小时完成多个样品的定量分析, 有效的减少了劳动量。
域值 → ↑
Ct
SYBR 染料
TaqMan 探针
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1.2 化学反应原理
依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的 化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:
(1) SYBR荧光染料:SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料 。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光 染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的 SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号 的增加与PCR产物的增加完全同步。