印度梨形孢对烟草抗旱性的影响

印度梨形孢对烟草抗旱性的影响
惠非琼;刘剑;高其康;楼兵干
【摘要】为探明印度梨形孢对烟草抗旱性的影响,采用聚乙二醇(PEG 6000)人工模拟干旱胁迫条件进行盆栽试验.在干旱胁迫下,测定了烟叶中丙二醛(MDA)和脯氨酸(Pro)的含量、叶片相对电导率以及干旱相关基因的表达量.结果表明:印度梨形孢能定殖于烟草根部,并促进烟草地上部和地下部的生长.在干旱条件下,根部接种印度梨形孢的烟草缺水症状较轻,与未接种印度梨形孢的烟草相比,其烟叶中Pro含量显著升高,MDA含量和叶片相对电导率显著下降,干旱相关基因RD29A、ERD10A、RD26A、SDIR1、HAT、ERD1和DREB2A的表达量均明显上升.印度梨形孢提高烟草的抗旱能力,是通过降低烟草细胞生物膜的损伤程度、增强烟草的抗氧化防御能力、促进细胞渗透调节物质Pro的积累以及上调干旱胁迫相关基因的表达实现的.%To investigate the effect of Piriformospora indica on drought resistance of Nicotiana tabacum, a pot experiment was conducted by using polyethylene glycol (PEG) 6000 to simulate drought and the malondialdehyde (MDA) and proline contents, relative electrical conductivity and expression levels of drought-related genes in tobacco leaves under drought stress were analyzed. The results showed that P. indica could colonize in the roots of N. tabacum and promote the growth of both root and shoot of the plants. When P. indica-inoculated plants were under drought stress, the symptoms of water shortage were slighter, the proline content in leaves was significantly up-regulated, while the MDA content and relative electrical conductivity of leaves were significantly decreased comparing with those of un-colonized treatment. Quantitative
real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis indicated that the relative expression levels of drought-related genes RD29A, ERD10A,
RD26A, SDIR1, HAT, ERD1 and DREB2A were higher in leaves of colonized plants under drought stress. P. indica enhances the drought resistance of N. tabacum via reducing tobacco cell biological membrane damage degree, enhancing the antioxidant ability of tobacco, promoting the accumulation of osmotic substances proline and up-regulating the expression of drought-related genes.
【期刊名称】《烟草科技》
【年(卷),期】2017(050)012
【总页数】7页(P1-7)
【关键词】植物内生真菌;印度梨形孢;干旱;抗旱能力;烟草
【作者】惠非琼;刘剑;高其康;楼兵干
【作者单位】贵州中烟工业有限责任公司,贵阳市小河区开发大道96号550009;浙江大学生物技术研究所,杭州市余杭塘路866号310058;贵州中烟工业有限责任公司,贵阳市小河区开发大道96号550009;浙江大学农生环分析测试中心,杭州市余杭塘路866号310058;浙江大学生物技术研究所,杭州市余杭塘路866号310058【正文语种】中文
【中图分类】TS414
植物对干旱胁迫的反应包括感知胁迫压力、转导压力信号、激活各种应激相关基因
的表达和合成各种生理功能的蛋白［1］。

在干旱胁迫下，植物组织产生大量活性氧、细胞发生膜脂过氧化反应，导致体内积累多种有害物质。

丙二醛（MDA）是
膜脂过氧化产物，能改变细胞膜的渗透性，进而引起细胞内电解液外渗、电导率上升［2］。

丙二醛含量和相对电导率的高低是检测植物抗旱性的指标之一［3］，
其中丙二醛的含量能间接反映膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

植物对干旱胁迫最保守的应激反应是合成脯氨酸（Pro）、甜菜碱、糖类及其衍生物等渗透调节物质。

其中，Pro是最有效的渗透调节物质，其含量是衡量植物抗旱能力的重要指标［4］。

植物对干旱胁迫另一重要的反应是激活抗旱相关基因的表达和合成各种生理功能的蛋白。

Yang等［5］将干旱胁迫响应基因分为3类：一是转录调控因子，如DREBJ、AREB、NF-YB等；二是转录后对RNA和蛋白质进行修饰的基因，如磷酸化、去磷酸化基因；三是渗透调节因子或分子伴侣基因。

将抗旱相关基因转入到烟草中能提高烟草的抗旱性［3］。

将拟南芥DREB1A基因和rd29A启动子转
入烟草后，能提高烟草抵抗干旱和低温的能力［6］。

来自印度塔尔沙漠灌木根部的内生真菌印度梨形孢（Piriformospora indica）与
丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza fungi，AMF）的功能相似，可以在人工培养基上培养，能定殖于十字花科等非菌根植物的根部，并能促进植物的生长发育、提高植物的生物量、增强植物对生物和非生物胁迫的抗性［7］。

在干旱条件下，印度梨形孢能诱导拟南芥中抗旱相关蛋白的上调表达，提高拟南芥的抗旱性［8］，通过提高过氧化物酶的活性和干旱相关基因的表达可增强小白菜和水稻等植物的抗旱性［9-10］。

目前，有关印度梨形孢对烟草抗旱性影响的报道较少。

为此，初
步研究了印度梨形孢对烟草抗旱性的影响及其机理，为探明印度梨形孢在烟草抗旱方面的作用奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株与烟草品种
印度梨形孢（Piriformospora indica）由德国耶拿大学Ralf Oelmüller教授惠赠；供试烟草品种为中烟100，由中国烟草总公司郑州烟草研究院提供。

1.1.2 菌株的培养
（1）扩繁。

将印度梨形孢菌丝块置于KM培养基［11］上，于恒温（25 ℃）、
黑暗培养箱中培养7 d后，用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打孔，供转接用。

（2）转接。

将两块直径为0.5 cm的印度梨形孢菌丝块转接到直径为9 cm、装有约30 mL MS培养基［12］的平板上，菌丝块距离平板边缘约2 cm，使菌丝块
之间的距离尽可能最大。

置于恒温（25℃）、黑暗培养箱中培养7 d，供印度梨形孢与烟草共培养使用。

（3）对照试验。

将直径为0.5 cm的KM空白培养基置于MS培养基平板上作为
对照，KM培养基距平板边缘约2 cm，使两块培养基之间的距离尽可能最大。

置
于恒温（25℃）、黑暗培养箱中培养7 d，作为印度梨形孢与烟草共培养的空白对照。

1.1.3 植物材料的准备
参照惠非琼等［13］的方法进行烟苗的准备及印度梨形孢与烟草的共培养。

1.2 方法
1.2.1 干旱胁迫处理
（1）盆栽烟草培养。

印度梨形孢与烟草共培养30 d后，移栽烟苗进行盆栽培养（聚乙烯塑料盆高7 cm、内径9 cm）。

培养所用的基质成分为营养土∶蛭石∶珍珠岩=4∶2∶1。

置于相对湿度为 60%的温室中25℃光照培养16 h，22℃黑暗培
养8 h。

常规管理，30 d后进行模拟干旱胁迫试验。

（2）干旱试验。

采用20%的聚乙二醇（PEG 6000）溶液进行模拟干旱胁迫试验。

设1个对照和3个处理：对照（CC）是用200 mL自来水浇灌根部未接种印度梨
形孢的烟草；处理1（CP）是用200 mL 20%PEG 6000溶液浇灌未接种印度梨
形孢的烟草；处理2（PC）是用200 mL自来水浇灌接种印度梨形孢的烟草；处
理3（PP）是用200 mL 20%PEG 6000溶液浇灌接种印度梨形孢的烟草。

每个处理与对照共设5个重复。

所有植株置于相对湿度为60%的温室中，25℃光照培养16 h，22℃黑暗培养8 h。

于PEG 6000处理后0、3、6、9、24、48和72 h取烟草叶片，一份用于测定相关生理生化指标，另一份用液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中保存。

1.2.2 生理指标的测定
（1）丙二醛（MDA）含量的测定。

采用分光光度法进行测定。

称取0.3 g烟草叶片，剪碎，加入5 mL 5%三氯乙酸溶液和少量石英砂研磨成匀浆，8 000 r/min
离心15 min，上清液为丙二醛提取液。

取1 mL上清液于10 mL试管中，再加入2.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，摇匀。

将试管在100℃沸水中放置20 min后，取
出置于冰上，冷却后10 000 r/min离心5 min，取上清液待测。

以0.67%硫代巴比妥酸为空白，使用T6新世纪紫外/可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责
任公司）测定样品在532、600和450 nm处的吸光度。

烟叶中丙二醛浓度的计算公式：
式中：C 表示丙二醛的浓度，μmol·L-1；A532、A600、A450分别为532、600、450 nm处的吸光度。

烟叶中丙二醛含量的计算公式：
式中：Q表示丙二醛的含量，μmol·g-1；C表示丙二醛的浓度，μmol·L-1；V表示丙二醛提取液的体积，mL；W表示样品的质量，g。

（2）脯氨酸含量的测定。

采用分光光度法进行测定。

称取0.2 g烟草叶片，剪碎，
加入10 mL 3%磺基水杨酸和少量石英砂研磨成匀浆，过滤。

取1 mL滤液于10 mL的试管中，在试管中加入1 mL酸性茚三酮、1 mL冰醋酸后，将试管在100℃沸水中放置1 h后，再将其放在冰上冷却。

待冷却后，加入5 mL甲苯，剧烈摇晃10～15 s，在室温下放置20 min，取上清液待测。

用T6新世纪紫外/可见分光光度计测定其在520 nm处的吸光度。

根据绘制的Pro标准曲线计算烟叶中的Pro
含量。

（3）电导率的测定。

电导率的测定参考惠非琼等［13］的方法。

在25 mL的指
形管中加入10 mL ddH2O，再加入10片直径为1 cm的烟草叶片样品（避开主脉），将指形管放入真空干燥器内抽气，30 min后取出置于室温环境，每隔5 min振荡一次，共6次。

用DDS-11A型电导仪（上海今迈仪器仪表有限公司）
测定外渗液的电导值，记为R1。

再将试管放入沸水中煮沸20 min后取出置于室温，待冷却后摇匀，再次测定外渗液的电导值，记为R2。

试验重复3次。

1.2.3 干旱相关基因的表达分析
烟草样品总RNA的提取、去除RNA中的DNA、cDNA第一条链的合成、荧光定量PCR扩增体系等实验参考惠非琼等［13］的方法进行。

（1）烟草叶片总RNA的提取。

按照RNAiso Plus［宝生物工程（大连）有限公司］的说明书进行实验，电泳检测提取RNA的质量。

（2）去除RNA中的DNA。

在0.5 mL EP管中分别加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL、Total RNA 800 ng，再加入适量的RNase Free
ddH2O，使反应液总体积为10 μL。

轻轻混匀后，42℃反应2 min，4℃终止反应。

（3）cNDA第一条链的合成。

在本节（2）的反应液中加入4 μL
5×PrimeScript® Buffer 2、1 μL PrimeScript® RT Enzyme Mix Ι、1 μL RT
Primer Mix、4 μL DEPC-treated water，混匀，37 ℃孵育 15 min后，85℃加热5 s，4℃终止反应。

用ddH2O将反应混合液稀释至100 μL，-20℃保存。

根据已报道的植物干旱胁迫相关基因的序列设计基因特异引物［14］，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列见表1，Actin为内参基因。

表1 荧光定量PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers基因ID AY179605
At5g52310 At5g51070 AB049335 At4g27410 At5g05410 At3g55530
At5g56740引物名称Actin For Actin Rev RD29A For RD29A Rev ERD1 For ERD1 Rev ERD10A For ERD10A Rev RD26 For RD26 Rev DREB2A For DREB2A Rev SDIR1 For SDIR1 Rev HAT For HAT Rev引物序列
(5′→3′)AGCGGGAAATTGTTAGGGAG ATGACTTGTCCATCAGGCAG CGTGGTTAAAGTGTCAGGAAGAGCC AATCGCCATGGGCGCATACCAACC GGCTCTCCTCCTGGTTATGTTGGC TCCGGAGTGGTCGTGCACCGTA CATGTAAAATGTTGGTCTAATACTTTTGT CCACTAGCACTTAAGAGTCTACC ACCCACTCGAGCTGTACCCG CTCGTAGCCATGGAAGCTCC GGGGTAAATGGGTTGCTGAG TTGGCAACACTGTTCCCCG CCTTGCTGTCTCAACCATGGATC ACTTAGGCTCCAGCTGGCTCTT GCGTTTGACCACTCTTGGAGAC GATGTCACTGATCCTGACTGGC
（4）qRT-PCR反应。

在0.5 mL PCR反应管中分别加入5 μL SYBR® Premix Ex TagTM（2×）、0.2 μL PCR Forward Primer（10 μmol/L）、0.2 μL PCR Reverse Primer（10 μmol/L）、0.2 μL ROX Reference Dye（50×）、1 μL cDNA、3.4 μL ddH2O（灭菌）。

反应条件为：95℃ 2 min预变性；95℃ 5 s；60℃31 s，35个循环。

1.2.4 数据分析
采用SPSS19.0统计软件进行数据处理及分析。

2 结果
2.1 印度梨形孢对烟草生长的影响
印度梨形孢与烟苗在培养皿中共培养21 d后，根部接种印度梨形孢烟苗的生物量、主根长度、侧根数量、根和茎的鲜质量、干质量明显高于未接种的烟草，其中根和茎的鲜质量约是未接种烟草的2倍（图1a，表2）。

把烟苗移栽到聚乙烯塑料盆
中进行盆栽培养后，印度梨形孢仍能促进烟草的生长（图1b，表3）。

2.2 干旱胁迫对烟草生长的影响
用PEG 6000溶液模拟干旱胁迫48 h后，对照烟草（CP）叶片边缘卷曲、褪绿，而接种印度梨形孢的烟草叶片微下垂，褪绿不明显（图2a）。

随PEG 6000处理
时间的延长（72、96 h后），对照烟草（CP）叶片卷曲、褪绿加剧，而接种印度梨形孢的烟草干旱症状没有明显加剧（图2b和图2c）。

图1 印度梨形孢对烟草的促生作用Fig.1 Growth-promoting effects of P.indica on N.tabacum+P.indica为根部接种印度梨形孢的烟草；-P.indica为根部未接种印度梨形孢的空白对照；红色箭头指的是烟草侧根
表2 共培养21 d后烟草植株的生物学特性①Tab.2 Biological characteristics of N.tabacum on the 21st day after co-culture注：①同列数据后标有不同大写字母者表示差异达到极显著水平（P＜0.01）。

下同。

处理-P.indica+P.indica主根
长/mm 31.3±0.20B 37.2±0.27A侧根数量/条11.4±0.28B 17.2±0.28A根鲜质量/mg 44.9±0.41B 83.5±0.18A茎鲜质量/mg 41.6±0.18B 95.9±0.11A根干质量
/mg 2.2±0.03B 3.0±0.05A茎干质量/mg 3.6±0.03B 5.9±0.05A
表3 盆栽培养30 d后烟草植株的生物学特性Tab.3 Biological characteristics of N.tabacum on the 30th day after transferring into pot处理-
P.indica+P.indica株高/cm 4.08±0.37B 9.32±0.08A叶片数/片6.3±0.16B
8.3±0.17A最大叶长/cm 5.95±0.19B 6.88±0.18A最大叶宽/cm 13.60±0.16B
22.27±0.16A叶鲜质量/g 9.48±0.15B 12.63±0.18A叶干质量/g 1.05±0.16B 1.71±0.17A
图2 干旱处理后烟草植株表型上的差异Fig.2 Different phenotypes of tobacco after drought treatmentCC为对照植株水处理；CP为对照植株干旱处理；PC 为接种印度梨形孢的植株水处理；PP为接种印度梨形孢的植株干旱处理。

下同2.3 干旱胁迫对烟草叶片丙二醛（MDA）含量的影响
干旱胁迫前，接种印度梨形孢烟草叶片中的MDA含量略低于未接种印度梨形孢的烟草，但差异不显著。

在PEG 6000溶液处理24、48和72 h后，接种与未接种印度梨形孢烟草叶片中的MDA含量都升高，但未接种印度梨形孢烟草叶片中的MDA含量显著高于接种印度梨形孢的烟草（图3）。

图3 干旱处理后烟草叶片中丙二醛含量的变化Fig.3 Malondialdehyde content in tobacco leaves after drought treatment柱状图上不同小写字母表示在0.05水平上的差异显著性。

下同
2.4 干旱胁迫对烟草叶片脯氨酸含量的影响
干旱胁迫前，各处理烟草叶片中Pro含量无明显差异。

干旱处理24、48和72 h 后，接种与未接种印度梨形孢烟草中的Pro含量都升高，接种印度梨形孢烟草叶片中的Pro含量显著高于未接种印度梨形孢的烟草（图4）。

表明干旱胁迫下，印度梨形孢能促进烟草对Pro的积累。

图4 干旱处理后烟草叶片中脯氨酸含量的变化Fig.4 Proline content in tobacco leaves after drought treatment
2.5 干旱胁迫对烟草叶片相对电导率的影响
正常情况下，接种与未接种印度梨形孢烟草叶片的相对电导率无显著差异。

用PEG 6000溶液模拟干旱胁迫24 h后，未接种印度梨形孢烟草的相对电导率快速升高，而接种印度梨形孢的烟草无显著变化。

干旱胁迫48 h后，接种与未接种印
度梨形孢烟草叶片的相对电导率都上升，但未接种印度梨形孢烟草的相对电导率显著高于接种印度梨形孢的烟草。

干旱胁迫72 h后，未接种印度梨形孢烟草的相对电导率仍显著高于接种印度梨形孢的烟草，是接种印度梨形孢烟草的1.8倍（图5）。

图5 干旱处理后烟草叶片相对电导率的变化Fig.5 Relative electrical conductivity of tobacco leaves after drought treatment
2.6 干旱胁迫下干旱相关基因的表达分析
qRT-PCR结果（图6）表明，用PEG 6000溶液模拟干旱胁迫前，接种和未接种
印度梨形孢烟草中的转录因子（RD26A、DREB2A、HAT）及干旱相关蛋白基因（RD29A、ERD1、ERD10A、SDIR）的表达量差异不大。

干旱胁迫3 h后，
RD29A、RD26A和DREB2A基因的表达量在接种和未接种印度梨形孢的烟草中
无显著差异，而在干旱胁迫6 h后，接种印度梨形孢烟草中的表达量显著高于未接种印度梨形孢的烟草。

在干旱胁迫处理3 h后，ERD1、ERD10A、SDIR、HAT基因的表达量在接种印度梨形孢的烟草中快速升高，且显著高于未接种印度梨形孢的烟草。

3 讨论
图6 干旱相关基因的表达量Fig.6 Relative expression levels of drought-related genes in tobacco leaves
非生物逆境对细胞造成损伤的重要途径就是氧化胁迫，改变膜系统的结构和功能，破坏其渗透性和选择性，导致细胞内电解液外渗，引起电导率上升［2］。

MDA
是反映氧化胁迫的一个生理指标，与植物膜系统的氧化程度成正比，其含量可用于评价植物受氧化胁迫的强度及膜损伤程度［3］。

干旱胁迫下，接种和未接种印度梨形孢烟草中MDA的含量和相对电导率均有所上升。

在接种印度梨形孢的烟草中，MDA的含量和相对电导率显著低于未接种印度梨形孢的烟草。

可能由于在干旱胁
迫下，接种印度梨形孢烟草膜系统的受损程度轻于未接种印度梨形孢的烟草，印度梨形孢增强了烟草的抗氧化防御系统。

逆境下，植物会产生大量的渗透调节物质来缓解细胞脱水所造成的渗透胁迫，Pro 是最常见的渗透调节物质之一［4］。

在非生物胁迫条件下，植物体内游离Pro大量积累，维持内环境的稳定，缓解细胞失水对其结构和功能的损伤，帮助植物适应非生物胁迫［14］。

干旱胁迫下，印度梨形孢能促进烟草叶片中Pro的积累，表明印度梨形孢可能通过促进渗透调节物质的积累来帮助烟草维持正常的生命活动，提高烟草对干旱胁迫的抵抗能力。

植物干旱胁迫相关基因的上调表达能提高植物对干旱胁迫的耐受性。

因此，可利用基因工程改造技术，赋予植物更高水平的抗旱能力［15］。

与基因工程提高植株抗旱性相比，将印度梨形孢定殖于植株根部进而提高植株抗旱性的方法具有明显优势：①印度梨形孢-植株互作体系的构建容易实现。

②印度梨形孢可同时作用于植株的多个抗旱基因，提高抗旱相关基因的表达。

干旱胁迫下，接种印度梨形孢的烟草叶片中的RD29A、ERD1、RD26A、DREB2A、SDIR1、HAT和EDR10A基因都上调表达，提高了烟草的抗旱性。

③对寄主无副作用。

4 结论
①培养皿和盆栽试验表明印度梨形孢能定殖于烟草根部，促进烟草的生长。

②利用聚乙二醇（PEG 6000）人工模拟干旱胁迫条件的盆栽试验表明，在干旱胁迫下，印度梨形孢通过降低烟草细胞膜的损伤程度、促进细胞渗透调节物质的积累、提高烟草中干旱相关基因的表达，从而增强烟草的抗旱能力。

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