miR-198通过调控盘状结构域受体2影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制

miR-198通过调控盘状结构域受体2影响肺癌细胞放疗抵抗
的分子机制
田映国;万小亚;金勇;陈丽;陈洪明;粟芙蓉;何裕;许琴;蒋成英;田雨
【摘要】目的旨在探讨miR-198通过调控盘状结构域受体2(DDR2)影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制.方法培养人正常胚肺细胞与肺癌细胞,通过克隆形成实验比较各种细胞对放疗的敏感性.双荧光素酶报告基因实验检测DDR2与miR-198的关系.RT-PCR和Western blot实验检测相关基因的表达水平.Transwell实验检测细胞迁移能力.结果人肺癌细胞株A549对放疗最不敏感,放疗抵抗细胞株A549-R 中miR-198表达显著低于其他细胞且DDR2表达显著高于其他细胞.DDR2是miR-198的直接靶基因,过表达miR-198显著抑制A549-R细胞中DDR2蛋白的表达水平,增强细胞对放疗的敏感性,同时显著抑制了细胞的迁移能力.结论 miR-198通过直接靶向DDR2调控肺癌细胞对放疗的抵抗作用.
【期刊名称】《中国医药生物技术》
【年(卷),期】2019(014)005
【总页数】6页(P430-435)
【关键词】miR-198;盘状结构域受体2;肺癌细胞;放疗抵抗
【作者】田映国;万小亚;金勇;陈丽;陈洪明;粟芙蓉;何裕;许琴;蒋成英;田雨
【作者单位】638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638400 四川,广安市武胜县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001
四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤
科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科;638001 四川,广安市岳池县人民医院肿瘤科
【正文语种】中文
目的旨在探讨 miR-198 通过调控盘状结构域受体2（DDR2）影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制。

方法培养人正常胚肺细胞与肺癌细胞，通过克隆形成实验比较各种细胞对放疗的敏感性。

双荧光素酶报告基因实验检测 DDR2 与 miR-198 的关系。

RT-PCR 和Western blot 实验检测相关基因的表达水平。

Transwell 实验检测细胞迁移能力。

结果人肺癌细胞株 A549 对放疗最不敏感，放疗抵抗细胞株 A549-R 中miR-
198 表达显著低于其他细胞且 DDR2 表达显著高于其他细胞。

DDR2 是 miR-198 的直接靶基因，过表达 miR-198 显著抑制 A549-R 细胞中 DDR2 蛋白的表达水平，增强细胞对放疗的敏感性，同时显著抑制了细胞的迁移能力。

结论 miR-198 通过直接靶向 DDR2 调控肺癌细胞对放疗的抵抗作用。

肺癌是目前最常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的首位[1]，且预后不良[2]，目前对于肺癌的治疗方法主要有手术、化疗和放疗等。

放疗
在控制持续性或复发性肿瘤生长、控制激素分泌中发挥着重要的作用[3]。

接受放
疗的患者局部复发和远处转移的发生率较低[4]，能显著延长患者生存期，降低死
亡率[5]。

因此放疗在临床情况下对恶性肿瘤的控制与姑息治疗具有重要的作用[6]。

但是放疗抵抗是影响患者生存率的关键因素[7]，因此寻找调控放疗抵抗的分子机
制迫在眉睫。

microRNA（miRNA）是一类长度在 18 ~ 22 个核苷酸的非编码小分子 RNA，
与靶标 mRNA 非编码区的 3'端结合[8]，阻止 mRNA 的翻译从而调控靶基因的表
达来影响相应细胞的生物学行为[9]，研究发现，miRNA 参与许多癌症和肿瘤进展，具有抑癌和致癌基因的功能[10]。

但 miR-198 通过靶向盘状结构域受体 2
（DDR2）影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制的研究未见报道，因此本研究通过检测miR-198 和 DDR2 在肺癌细胞中的表达及其与细胞生物学行为的关系，探讨miR-198 通过调控 DDR2 影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制。

人肺癌细胞 A549、人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292、人小细胞肺癌细胞NCI-H446 和人胚肺细胞WI-38 均购自中科院上海细胞研究所；DMEM 培养基、青霉素和链霉素、胎牛血清和胰蛋白酶等均购自美国Hyclone 公司；RT-PCR 试
剂盒、转染试剂等购自美国 Thermor Fisher 公司；引物由日本 Takara 公司合成；抗体购自美国 Abcam 公司。

1.2.1 细胞培养与转染人肺癌细胞 A549、人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292、人小细胞肺癌细胞 NCI-H446 和人胚肺细胞 WI-38采用 DMEM 培养基（含 1% 青霉素和链霉素、10% 胎牛血清），放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

用无血清的 DMEM 培养基稀释质粒，轻吹混匀，标记为 A 液；用无血清的DMEM 培养基稀释转染试剂，轻吹混匀，标记为 B 液；将 A 液轻轻加入B 液，
轻吹混匀，室温放置 15 min，形成转染复合物；在转染复合物中慢慢滴加待转染的细胞，轻晃混匀，放置在37 ℃、5% CO2培养箱中培养 24 ~ 48 h 后，检测
转染效率。

1.2.2 RT-PCR 检测法提取细胞总 RNA，调整统一浓度后用逆转录试剂盒按照说明进行逆转录反应，扩增引物见表 1，反应条件为94 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，40 个
循环。

结果用 F = 2-△△ct计算，实验重复 3 次。

1.2.3 克隆形成实验取对数生长的单层细胞，用胰蛋白酶消化后吹打成单个细胞，将细胞悬浮液在含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养。

将细胞悬浮液做梯度密
度稀释后接种于培养皿上，即 50、100、200 个细胞/皿，置于37 ℃、5% CO2
培养箱中培养 2 ~ 3 周。

当皿中出现肉眼可见的克隆时终止培养，弃去培养液，PBS 小心浸洗 3 次，干燥后，加纯甲醛固定 15 min，再用 PBS 清洗3 次，加入
结晶紫染色 10 ~ 30 min。

用 PBS 缓慢洗去染色液，空气干燥后用肉眼直接计算
克隆数（> 50 个细胞的为一个克隆）。

平板克隆形成率（%）= 形成克隆数/接种细胞数× 100%。

1.2.4 放射抵抗细胞株的建立体外培养人肺癌细胞株 A549，待细胞生长处于对
数生长期时，给予直线加速器产生的 6 MV X 射线进行垂直放射线照射，射线的
剂量分别为 2、4、6、8、10、12 Gy，每种梯度照射 2 次。

照射后继续于细胞培养箱中培养，密切观察细胞状态。

加入新鲜的培养基培养，待细胞状态恢复良好后，再进行下一次的照射，并根据浓度梯度逐渐加大放疗的剂量，直到建立具有稳定耐受放射线能力的人肺癌细胞株 A549，命名筛选出的细胞为 A549-R。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验生物信息预测 miR-198 基因序列上 DDR2的结
合片段，用 RT-PCR 对该片段进行扩增并插入到荧光素酶载体中，构建 WT
DDR2 3'UTR 野生质粒。

利用基因突变技术将 miR-198 和 DDR2 结合片段中的
部分基因突变，构建 Mut DDR2 3'UTR 突变质粒。

用 miR-198 mimic 和 DDR2 野生或突变质粒转染 A549-R 细胞，根据试剂盒说明书检测各组荧光素酶活性，
实验重复 3 次。

1.2.6 Western blot 检测法提取细胞总蛋白，BCA 法对提取的蛋白进行定量后
调整统一浓度。

用 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白片段后，转膜，5% 脱脂牛奶封
闭 1 h，TBST 漂洗 3 次，加一抗稀释液进行孵育，4 ℃过夜；TBST 漂洗 3 次，
加二抗稀释液孵育，室温 1 h；TBST 漂洗 3 次，用 ECL 发光液进行成像分析。

1.2.7 Transwell 小室实验将 Transwell 小室放入 24 孔板内，上室接种转染
miR-198 mimics 或 miR-198 NC 后的 A549-R 细胞悬液200 μl，下室加 600
μl 含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，培养 12 h 后，棉签擦去微孔膜上室的
细胞，PBS 小心冲洗小室，4% 多聚甲醛固定迁移并黏附到小室微孔膜下面的细胞20 min，1% 结晶紫染色 20 min，PBS 冲洗小室，将下室置于显微镜下随机选择5 个不同视野记录穿透膜的细胞数，求平均值，重复 3 次。

采用 SPSS21.0 统计学软件，计量资料以表示，用P < 0.05 表示差异有统计学意义。

人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292、人小细胞肺癌细胞 NCI-H446 和人肺癌细胞 A549 经不同剂量放射处理后，平板克隆形成实验分析结果（图 1）显示，相比于 A549 细胞，NCI-H292 和NCI-H446 细胞对放疗更为敏感。

如图 2 所示，与人正常胚肺细胞 WI-38 相比，人肺癌细胞 A549、人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292、人小细胞肺癌细胞 NCI-H446 和人肺癌细胞 A549 放射抵抗细胞 A549-R 的 miR-198 的表达量均显著降低（P < 0.05），且放射抵抗细胞 A549-R 中 miR-198 的表达量显著低于人肺癌细胞 A549（P < 0.05）。

如图 3 所示，与人正常胚肺细胞 WI-38 相比，人肺癌细胞 A549、人肺癌细胞（淋巴结转移）NCI-H292、人小细胞肺癌细胞 NCI-H446 和人肺癌细胞 A549放射抵抗细胞 A549-R 的 DDR2 的表达量均显著升高（P < 0.05），且放射抵抗细胞 A549-R 中 DDR2 的表达量显著高于人肺癌细胞 A549（P < 0.05）。

通过生物信息学网站发现 DDR2 可能是 miR-198 的潜在靶基因。

为了验证这一结果，本研究做了双荧光素酶报告基因实验，结果如图4A所示，miR-198 可以结合 DDR2 3'UTR，并且 miR-198 可以负调控 DDR2 的表达。

Western blot 检测结果（图 4B）显示，过表达 miR-198 显著抑制 A549-R 细胞中 DDR2 蛋白的表达水平，抑制 miR-198 的表达显著促进 A549-R 细胞中 DDR2 蛋白的表达。

RT-PCR 检测结果如图 5A 所示，过表达 miR-198 可显著促进 A549-R 细胞中miR-198 的表达（P < 0.05）。

平板克隆形成实验分析结果如图 5B 所示，在不同剂量的放射处理下，过表达 miR-198 可增强 A549-R 细胞对放疗的敏感性；过
表达 DDR2 可增强 A549-R 细胞对放疗的抵抗作用；同时过表达 miR-198 和DDR2，A549-R 细胞对放疗的敏感性介于单独过表达 miR-198 和 DDR2，即miR-198 通过调控 DDR2 影响肺癌细胞的放疗抵抗作用。

如图 5C 所示，A549-R 细胞中过表达 miR-198 后再给予 8 Gy 放射后显著抑制
了细胞的迁移能力（P < 0.05），但过表达 DDR2 后再给予 8 Gy 放射后显著促
进了细胞的迁移能力（P < 0.05）。

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症相关发病率和死亡率的主要原因，对人类生命安全造成巨大的威胁[11-12]，目前对于肺癌的治疗主要为放化疗，但是
化疗抵抗和肿瘤耐药是治疗肺癌的难点也是影响预后的关键因素[13]。

因此本研究通过建立具有稳定耐受放射线能力的人肺癌细胞株 A549-R，探讨影响肺癌细胞放疗抵抗的分子机制。

DDRs是一种跨膜酪氨酸酶受体，有 DDR1 及 DDR2两个家族成员，研究发现DDR2 是肿瘤血管新生的关键调节者[14]，DDR2 在胃癌细胞中高表达来促进胃癌细胞的增殖、迁移等恶性生物学行为[15]等。

本研究发现，DDR2 在 A549-R 细
胞中显著上调表达，过表达 DDR2 可增强 A549-R 细胞对放疗的抵抗作用，提示DDR2 可能是肺癌细胞发生发展的促进因子，有望成为肺癌放疗抵抗治疗的潜在
分子靶点。

有研究发现，miR-198 通过靶向目标基因影响多种肿瘤的发生发展[16]，比如
miR-198 通过靶向含 CUB 结构域蛋白 1（CDCP1）蛋白在乳腺癌中发挥抑癌作
用[17]，miR-198 通过靶向甲基鸟嘌呤 DNA 甲基转移酶（MGMT）增强替莫唑
胺对胶质母细胞瘤的敏感性[18]，长链非编码 RNA SChLAP1 通过靶向 miR-198 和促进丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）通路加速前列腺癌的增殖和转移[19]等。

在本研究中，我们发现在 A549 和 A549-R 细胞中 miR-198 显著下调表达，过表达 miR-198 可以显著降低 A549-R 细胞中 DDR2 的表达，提示 miR-198 可能是
肺癌放疗抵抗抑制因子，同时 DDR2 可能是 miR-198 的潜在靶基因。

我们进一步通过生物信息学网站确定了 DDR2 可能是 miR-198 的潜在靶基因的假设，紧接着我们采用双荧光素酶报告基因实验证实了这一假设的真实性。

为了确定miR-198 通过调控 DDR2 影响肺癌细胞放疗抵抗的作用，本研究发现过表达
miR-198 可增强 A549-R 细胞对放疗的敏感性且显著抑制了细胞的迁移能力；过
表达DDR2 可增强A549-R 细胞对放疗的抵抗作用且显著促进了细胞的迁移能力，这些数据表明 miR-198 通过调控 DDR2 影响肺癌细胞的放疗抵抗作用。

miRNA 与靶标 mRNA 通常发生不完全结合，并且结合的位点是 mRNA 的非编码区的 3'端，且它不会降解靶标 mRNA，只是阻止 mRNA 的翻译，从而调节与生长发育
有关的基因[20-22]。

以上提示 miR-198 与靶基因 DDR2 mRNA 的 3'端非编码区结合削弱了肺癌细胞对放疗的敏感性，通过过表达 miR-198 可增强 A549-R 细胞对放疗的敏感性。

综上所述，miR-198 在肺癌细胞中异常低表达，DDR2 在肺癌细胞中异常高表达，miR-198 通过调控 DDR2 影响肺癌细胞放疗抵抗作用。

本研究揭示了肺癌细胞放疗抵抗的部分分子机制，为肺癌放疗治疗提供了新的靶点。

Objective To investigate the molecular mechanism of miR-198 regulating the radiotherapy resistance of lung cancer cells by regulating DDR2. Methods Human normal lung cancer cells and lung cancer cells were cultured, and the sensitivity of various cells to radiotherapy was examined by colony formation experiments. Dual luciferase reporter assay was used
to detect the relationship between DDR2 and miR-198. The expression levels of related genes were detected by RT-PCR and Western blot. The transwell assay was applied to measure cell migration ability.
Results Human lung cancer cell line A549 was the least sensitive to radiotherapy among the tested cell lines. The expression of miR-198 in radiotherapy-resistant cell line A549-R was significantly lower than that in other cells and the expression of DDR2 was clearly higher than that in other cells. DDR2 is a direct target gene for miR-198. Overexpression of miR-198 significantly deceased the level of DDR2 protein in A549-R cells, enhanced the sensitivity of cells to radiotherapy, and significantly inhibited cell migration ability.
Conclusions miR-198 regulates the resistance of lung cancer cells to radiotherapy by directly targeting DDR2.
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