绿色合成银纳米粒子及其在SERS中的应用

绿色合成银纳米粒子及其在SERS中的应用
杨必文;郭周义;刘智明;万明明;覃筱楚;钟会清
【摘要】采用无毒、绿色的酪氨酸作为还原剂和稳定剂,在碱性条件下还原硝酸银,经60℃恒温水浴处理20 min,成功地合成了银纳米粒子.混合溶液颜色由淡黄色变为棕黄色直观地呈现了银纳米粒子的生成.利用紫外可见吸收光谱(UV-Vis)和透射电子显微镜(TEM)对制备样品进行分析和表征.粒子的UV-Vis吸收在412 nm附近.TEM图像显示,银纳米粒子的形状近似球形,粒子直径在15～25 nm.分别以结晶紫(CV)和叶酸(FA)为探测分子,进一步研究了该银纳米粒子的表面增强拉曼散射(SERS)效应.实验结果表明,该合成方法不仅方便、快速、绿色环保,而且合成的银纳米粒子对CV和FA分子有很好的SERS效应.%In the present paper,we have successfully synthesized silver nancomparticles by reducing of silver nitrate in alkaline solution via 60 ℃ water ba th for 20 minutes with the use of tyrosine,a nontoxic and green macromolecule,as a reducing and stabilizing agent.The formation of silver nanoparticles was observed visually by color change of the solutions (from faint yellow to brown yellow).The morphologies of the Ag NPs were characterized by UV-Vis absorption spectroscopy and transmission electron microscopy (TEM).The UV-Vis absorption peak of silver nanoparticles located at 412 nrn.The TEM image of silver nanoparticles indicated that the diameters of nanospheres are mainly in the range 15～25 nm.In order to evaluate the SERS activity of the silver nancomparticles,crystal violet and folic acid were used as the Raman probe molecule.The experimental results indicated that there are two ascendancies,firstly,the approach is convenient and the reaction condition
is facile,secondly,tyrosine is a water-soluble,nontoxic and biodegradable macromolecule,which makes this approach provide a green strategy to prepare Ag NPs.Significantly,the synthesized Ag NPs exhibits good surface enhanced Raman scattering (SERS) activity as SERS substrates to detect crystal violet and folic acid in aqueous solution.
【期刊名称】《光谱学与光谱分析》
【年(卷),期】2013(033)007
【总页数】4页(P1816-1819)
【关键词】绿色合成;酪氨酸;银纳米粒子;表面增强拉曼散射;结晶紫;叶酸
【作者】杨必文;郭周义;刘智明;万明明;覃筱楚;钟会清
【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州 510631;华南师范大学生物光子学研究院,激光生命科学教育部重点实验室和中医药与光子技术国家中医药管理局三级实验室,广东广州510631
【正文语种】中文
【中图分类】O657.3
引言
表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）是一种基于
纳米尺度的粗糙表面、颗粒体系的特殊表面光学现象。

其高灵敏度和特异性，可以大大提高吸附在其表面检测分子的拉曼散射信号，自20世纪70年代发现以来已
被广泛地应用于环境污染物监测与分析［1］、疾病诊断和治疗［2］、化学品监
测［3］、食品安全检测［4，5］等领域。

SERS的增强机制主要是由活性衬底表
面等离子体共振引起的物理增强和活性衬底粗糙表面与吸附在其表面的检测分子之间的电子转移而产生的化学增强构成，其中，物理增强机制占主导地位［6，7］。

合适的SERS活性衬底对获得优质的拉曼增强信号十分关键，在SERS的研究中占据非常重要的地位。

金属纳米结构是SERS研究中常用的一类增强衬底，特别是银纳米结构已被深入研究［8］。

目前，金属银纳米粒子的制备方法很多，其中最常用的是液相合成法。

液相合成法主要是以金属盐类为基本原材料，通过各种不同的手段还原金属离子直接得到纳米粒子。

由于金属银纳米颗粒具有比表面积大、活性高、易聚集的特点，在合成过程中往往需要添加一些表面活性剂或稳定剂，从而得到形貌可控、分散均匀、性质稳定的纳米粒子［9，10］。

遗憾的是，这类表面活性剂或稳定剂一般具有毒性，从而限制它的应用范围。

所以，银纳米粒子的绿色合成已成为近些年来研究的新方向［11，12］（所谓绿色合成，其具有无毒、绿色
的还原剂和稳定剂、温和的反应条件以及简便的操作方法等特点）。

酪氨酸是组成蛋白质的20种必需氨基酸中的一种，是一种含有酚式羟基的芳香族极性α氨基酸。

在表面活性剂存在的情况下，以酪氨酸为还原剂已成功地应用于
金属纳米粒子的制备［13，14］。

本文采用酪氨酸作为还原剂和稳定剂，在没有任何表面活性剂存在的条件下，成功地合成了银纳米粒子。

并以结晶紫（CV）和叶酸（FA）为探测分子，研究该银纳米粒子的表面增强拉曼散射（SERS）效应。

1 实验部分
1.1 试剂与仪器
结晶紫购于天津福晨化学试剂厂，叶酸购于上海源聚生物科技有限公司，L－酪氨酸、硝酸银和氢氧化钠均购于国药化学试剂有限公司；整个实验过程用到的试剂均为实验室自制双蒸水。

超微量分光光度计（NanoDrop ND－1000，美国NanoDrop公司）；透射电子显微镜（JEM－2100HR，日本电子公司）；激光共焦显微拉曼光谱仪（InVia＋Plus，英国Renishaw 公司）。

拉曼光谱仪的分辨率为1cm－1，激光波长为514.5nm。

1.2 方法
1.2.1 银纳米粒子的制备
将20μL 浓度为200mmol·L－1的硝酸银水溶液滴加到4mL 浓度为0.5mmol·L －1的酪氨酸水溶液中，并用超声处理15min。

向混合液中加入浓度为0.1mol·L －1的氢氧化钠溶液，调节混合液的pH 值至12.0。

将混合液至于60℃恒温水浴锅20min，观察混合液的颜色变化。

反应结束后，离心洗净，用于后期的表征和SERS检测。

1.2.2 SERS实验
利用上述方法合成的银纳米粒子作为SERS活性衬底，在水溶液中检测结晶紫和叶酸分子的拉曼散射信号。

将50 μL浓度为1.0×10－7 mol·L－1的结晶紫水溶液和50μL 浓度为1.0×10－5 mol·L－1叶酸溶液分别与等量的银胶溶液混合，轻轻摇匀，室温下静置1h后，得到终浓度分别为5.0×10－8 mol·L－1，5.0×10－6
mol·L－1的CV 溶液和FA 溶液，并在室温下用于拉曼检测。

2 结果与讨论
光谱数据采用Origin8.5软件进行平滑、去基线等处理。

拉曼光谱探测时，每个样品分别扫描5次求平均值，曝光时间统一设为30s。

2.1 银纳米粒子的表征
酪氨酸同时含有—OH，—COOH、—NH2，使得其同时具有酸性和碱性性质。

酪氨酸化学结构式如图1所示。

在碱性的条件下，酪氨酸具有一定的还原性而用
于还原金属盐类。

以酪氨酸为基础物质作为还原剂，在表面活性剂存在的情况下，已经成功地用于金属纳米结构的制备。

当混合溶液的pH 值低于等电点（pI，5.7）时，酪氨酸质子化而带正电，使得—NH2部分转化为—NH＋3；而当混合溶液的pH 值高于等电点时，酪氨酸去质子化而带负电，使得—COOH 部分转化为—COO－和—OH 部分转化为—O－［14］，所以酪氨酸的电子供应能力具有pH 依赖性，将Ag＋还原成Ag0 的能力受到反应环境pH 值的影响。

实验发现，酪
氨酸与硝酸银之间的氧化还原反应直接发生在酪氨酸的—OH 与Ag＋之间［14］。

然而，当反应液的pH 值过高时，溶液中多余的OH－与Ag＋之间的直接结合形
成沉淀，而导致Ag0 生成量的下降；同时，合适的pH 值条件下，酪氨酸含有的—OH，—COOH，—NH2，能使酪氨酸吸附在Ag0 的表面而形成弧电子对，起到稳定剂的作用，而形成稳定的水溶性银纳米粒子［14］。

因此，反应溶液合适
的pH 值对银纳米粒子的制备至关重要，本文选用溶液的pH 值为12.0。

Fig.1 Chemical structure of tyrosine
金属纳米粒子的制备过程中，反应液颜色的变化，呈现了金属粒子的生成过程，并且混合液的最终颜色与生成的金属粒子的形貌、大小直接相关［14］。

将20μL
浓度为200 mmol·L－1的硝酸银水溶液与4mL 浓度为0.5mmol·L－1的酪氨酸
水溶液均匀混合后直接置于60 ℃恒温水浴，混合液的颜色没有任何变化。

然而，
随着氢氧化钠溶液的加入，反应液的颜色发生不同程度地变化。

当反应液的pH 值为12.0时，混合液的颜色由起初的淡黄色变成棕黄色。

此颜色的变化，表明了银
纳米粒子的生成。

图2为混合液在pH 值为12.0的条件下合成的银纳米粒子的紫外可见吸收光谱图。

其中图2a 为银纳米粒子刚生成时的紫外可见吸收光谱。

如图所示，银纳米粒子此时在412nm 处有很强的吸收峰（银粒子表面等离子体共振引起的吸收）。

一般来说，纳米级的银粒子在390～440nm 之间会有一处比较强的吸收峰，而且吸收峰的位置、峰形与粒子的形态密切相关。

所以，图2a的吸收峰位和峰形说明生成的银纳米粒子数量多，而且颗粒较小、分布相对均匀。

图2b为所制银纳米粒子放置7 周后的紫外可见吸收光谱图。

由图可知，吸收峰的峰形基本不变，只是峰位置发生了2nm 的红移。

峰位置的红移可能是长时间的放置，银纳米粒子发生了部分团聚造成的。

总的来说，该方法合成的银纳米粒子是稳定的。

Fig.2 UV－Vis absorption spectra of silver nanoparticles obtained in aqueous solution in the presence of L－tyrosine
Fig.3 TEM image of silver nanoparticles
图3是pH 值为12.0情况下合成的银纳米粒子的TEM图。

由图可知，该方法合
成的银纳米粒子形状近似球形，粒子直径分布在15～25nm，与紫外可见吸收光
谱的实验结果相符合。

2.2 银纳米粒子的SERS活性
结晶紫作为生物常用染色剂，因具有高毒性和致癌变等特点，被多个国家列为水产养殖的禁用药物。

由于CV 具有独特的强荧光性质，加之拉曼信号本身很弱，使得很难获取优质的拉曼散射光谱。

所以，将SERS技术应用于水产品及及其代谢物中结晶紫含量的检测，具有重大意义［15］。

本文将CV 水溶液与等量的银溶液均
匀混合，室温下进行拉曼光谱检测，结果如图4所示。

为了排除Tyr的信号干扰，
检测了无探针分子时SERS基地的拉曼散射光谱，如图4a所示。

由图4a可知，
在无探针分子的银胶中检测不到任何信号，说明该银胶中无多余的Tyr，对探测分子CV 的信号无任何影响。

其中，图4b为浓度为5.0×10－8 mol·L－1的CV 水
溶液拉曼光谱图。

由于CV 分子的散射截面小以及强的噪声干扰，在5.0×10－8 mol·L－1的CV 水溶液中无法获得清晰的拉曼散射图谱。

然而，与银溶液均匀混
合后，终浓度为5.0×10－8 mol·L－1的CV 的某些特征峰得到了明显的增强，如图4d 所示。

其中位于731，807，1 177cm－1的特征峰（C—H 键振动）；位
于1 294，1 536，1 585，1 620cm－1的特征峰（芳香环的振动）；位于1
369cm－1的特征峰（N 环伸缩振动）；位于913cm－1的特征峰（放射状芳香
环骨架振动）［15］。

同时，与CV 分子的普通拉曼光谱图4c相比较，CV 分子
的SERS谱特征峰的位置无明显变化，而谱线强度明显增强。

结果说明，该方法合成的银纳米粒子在低浓度结晶紫溶液的检测中具有很好SERS效应。

Fig.4 a normal Raman spectrum of silver nanoparticles；b Raman spectrum of 5.0×10－8 mol·L－1 aqueous solution of CV；c normal Raman spectrum of CV solid；dSERS spectrum of CV（5.0×10－8 mol·L－1）adsorbed on
the silver nanoparticles
为了进一步检验该方法合成的银纳米粒子的SERS效应，将其应用于水溶液低浓度叶酸分子的检测。

叶酸是一种低分子量的B族维生素，是人体不可或缺的一种营
养物质。

近年来，由于它在载药和癌症的治疗方面的潜力而受到广泛的关注。

SERS在叶酸检测与分析中的应用，将为叶酸的实验室研究以及临床应用打开新局面［16］。

将制备好的银胶溶液与叶酸溶液等量均匀混合，室温下进行拉曼检测，结果如图5所示，其中图5a为浓度为5.0×10－7 mol·L－1的FA 溶液的普通拉
曼光谱图，图5b为终浓度为5.0×10－7 mol·L－1的FA 溶液的SERS 谱。

比较
图5a 与图5b 可知，610，690，928，991，1 175，1 339，1 505，1 590，1
618cm－1处的特征峰得到了显著增强，因此说明该方法合成的银纳米粒子对叶酸分子具有非常好的SERS效应。

Fig.5 a Raman spectrum of 5.0×10－6 mol·L－1 aqueous solution of FA；b SERS spectrum of FA（5.0×10－6 mol·L－1）adsorbed on the Ag nanoparticles
拉曼检测结果表明，该方法合成的银纳米粒子作为SERS活性衬底很好地增强了吸附在其表面的结晶紫和叶酸分子的拉曼散射信号，实现了对结晶紫和叶酸的低浓度检测。

综上所述，以酪氨酸为还原剂和稳定剂，在合适的pH值环境条件下，成功地合成了尺度合适、分散较均匀、稳定的银纳米粒子，获得了SERS活性衬底。

3 结论
利用绿色、无毒的酪氨酸作为还原剂和稳定剂，在没有任何表面活性剂存在的条件下，成功地制备出银纳米粒子，获得了SERS活性衬底。

利用紫外可见吸收光谱（UV－Vis）和透射电子显微镜（TEM）对合成的粒子进行分析和表征，并以结晶紫和叶酸作为目标分子研究了它的SERS活性。

结果表明，本方法合成的银纳米粒子为球形颗粒、大小相对均匀且稳定性好。

为金属纳米粒子的绿色合成，提供新思路。

SERS图谱表明该方法合成的银纳米粒子形成的衬底具有很好的SERS活性，实现了对结晶紫和叶酸的低浓度检测，在生物医学领域具有一定的潜在应用价值。

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