胡萝卜汁和番茄汁作为天然前体应用发酵(徐鹏)

以胡萝卜汁和番茄汁作为天然前体用于提高缺陷假单胞NCIM2865辅酶Q10的产量
摘要：
辅酶Q10在电子运输系统中起着至关重要的作用，并已被广泛应用于食品和制药行业。

本文使用的统计方法和天然的前体用于提高缺陷假单胞菌NCIM2865中辅酶Q10的增长。

首先，辅酶Q10的生产方面的意义，通过Plackett-Burman设计识别。

第二，集中最为突出的因素及其相互关系用响应面法研究（RSN）。

在RSN优化培养基中进行发酵的辅酶Q10产量大大增加，从6.68毫克/升增加到15.58毫克/升。

用胡萝卜汁和番茄汁作为天然前体后辅酶Q10产量从15.58毫克/升分别增加到29.22毫克/升和24.35毫克/升。

1介绍：
辅酶Q10，维生素类脂溶性物质，是真核生物和原核生物中细胞膜结合电子传输系统的组成部分。

具有一支苯醌基官能团和全反式异戊二烯疏水链。

他已成功用于心血管疾病和支持性治疗线粒体呼吸疾病。

这说明了辅酶Q10具有抗氧化性和提高免疫功能。

常见的类胡萝卜素和辅酶Q10生产途径是牛儿基磷酸后他直接进入到类胡萝卜素的生产中，出了去辅酶Q10的6分子IPP。

这些报表表明，在胡萝卜和番茄中可能有充足的异戊二烯前体产生。

辅酶Q10可以通过三种方法之中的任何一种方法提取出来，即生物发酵法，化学合成，从动物体中提取。

取得生产辅酶Q10菌种，包括农杆菌，脱氮副球菌，红假单胞菌。

野生细菌生产辅酶Q10的量比重组大肠杆菌的量更大。

在一个天然前体介质中本报告为了提高辅酶Q10的生产，优化了先前的统计方法。

在本文中使用的有机体是一种野生的假单胞菌属NCIM2865。

2材料和方法：
2.1材料
所有介质和目前工作中使用的AR级有机溶剂都是购自印度孟买S.D.精细化工有限公司和印度孟买Hi-Media Limited。

发酵辅酶Q10标样是加拿大魁北克购买的。

胡萝卜和西红柿是从印度当地购买的。

2.2方法
2.2.1生物体和培养条件
发酵生产辅酶Q10菌种购买于印度普纳的国家工业为生物中心。

在30℃±2℃，琼脂培养基上培养，并维持在4℃。

种子在250ml含50ml培养基（2％葡萄糖，1％蛋白胨，1％酵母膏，0.5％氯化钠）的锥形瓶中培养。

温度为30℃±2℃，180rpm，24小时后接种。

2.2.2发酵
发酵在小林，长崎，歩川的报告上做了轻微的修改。

培养基组成为葡萄糖2％，1％蛋白胨，1％酵母提取物，0.12％碳酸钙，0.03％硫酸镁。

用1摩尔的氢氧化钠和1摩尔的盐酸调节PH至7.2±0.2。

10％种子培养基有2-4×108个细胞，接种到50ml发酵培养基中。

摇瓶在摇床中保持（2.54厘米中风和180rpm）30℃±2℃发酵96个小时。

2.2.3细胞干重的测定
将样品稀释50倍，与0.02摩尔的盐酸反应将不溶性的碳酸钙转换成可溶的氯化钙和二氧化碳。

发酵液的吸光度的测量在660μm下根据校准标准曲线估计细胞的干重。

2.2.4辅酶Q10的分析
将发酵液10ml，正丙醇12ml，20ml正己烷，10克的玻璃微珠添加混合，在商务搅拌器中搅拌5分钟从细胞中提取辅酶Q10。

第二次提取的溶剂相加6毫升的正己烷与水相混合，并在旋转蒸发仪上蒸干（步琪旋转蒸发仪R-124，瑞士Flawil）。

提取的辅酶Q10样品在二恶烷中溶解，并用HPLC和Sperisorb C18分析。

用100％乙醇在1毫升/分钟的流速下进行洗脱。

在用紫外检测器275μm下进行检测。

用一个真实的辅酶Q10作为标样，进行辅酶Q10产量的计算。

2.2.5丙三醇估算
发酵液中甘油的估算用比色法，由林奇和杨所发现。

甘油线性校准获得在0-25微克/毫升。

2.3用统计学方法进行发酵培养基的优化
2.3.1 Plackett-Burman设计的评价营养效果筛选最显著的发酵工艺参数影响到辅酶Q10的产量。

以前这些因素的优化使用一个因素一个时间的方法，共有11（n）个变量，包括9个营养上的和物理上的，12个实验研究了两个虚拟变量，评估的要素，如甘油（50，10g/l），酵母提取物（20,5g/l），牛肉膏（10,2g/l），磷酸二氢铵（10,1g/l），碳酸钙，硫酸镁（2,0.5g/l），微量元素溶液(1.5,0.5g/l),接种量（15，5％）和碳酸钙（2,0.5％），为了减少初步研究和其他因素如Nacl（10,1g/ml）包括研究生产辅酶Q10的意义。

括号内为各自的最高值和最低值。

2.3.2 曲面法筛选影响其组成成分优化的条件
一旦采用从Plackett-Burman设计中获得的关键变量，为了增加辅酶Q10的产量，RSM会对四个独立的变量进行培养基优化。

从而获得数据进行回归分析设计实验。

实验设计通过生产和使用软件包装，
2.4使用胡萝卜汁和番茄汁作为天然前体
为了探索天然前提对长膜壳绦虫生产辅酶Q10的影响，在培养基中加入不同浓度的天然前体胡萝卜汁和番茄汁。

在榨汁机中使用洗干净并粉碎彻底的胡萝卜，加入重蒸馏水，这被认为是100％的胡萝卜汁。

用双层纱布过滤，取滤液然后煮10分钟，去除结块的然后再进行过滤。

使用RSM优化过的培养基溶解后加入滤液作为合成辅酶Q10的天然前体。

西红柿也一样。

3结果和分析
3.1 Plack-Burman设计的营养效果评价
采用Plack-Burman设计实验强调通过优化培养基的变量来实现更高的辅酶Q10产量的重要性。

在提高辅酶Q10产量中的变量中，其中有9各变量可能发挥着重要作用。

影响辅酶Q10产量的最显著四要素是甘油，酵母提取物，碳酸钙和硫酸镁。

没有一个虚拟变量在试验中对辅酶Q10生产产生影响。

3.2由RSN优化生产辅酶Q10
在被确定的四要素中，采用RSN进一步优化Plack-Burman设计，表一表示独立变量，辅酶Q10产量的设计和结果的编码值其中的三个实验模块。

用酵母提取物，甘油，碳酸钙，硫酸镁作为一个初始值的函数值，由二阶回归方程可得出辅酶Q10的产量水平。

可由下列公式算出：
CoQ10(mg/l)=-4.08-(0.19*甘油)+(1.39*酵母提取物)+(12.8*碳酸钙)+(15.41*硫酸镁)+(3.12e-0.03*甘油2)-（0.05*酵母提取物2）-（2.79*碳酸钙）-（77.89*硫酸镁2）+（8.62e-0.03*甘油*酵母提取物）-（0.097*甘油*碳酸钙）-（0.39*甘油*硫酸镁）-（0.13*酵母提取物*碳酸钙）+（1.37*酵母提取物*硫酸镁）+（4.73*碳酸钙*硫酸镁）
方差使用来确认模型的充足率，这使用了费希尔的统计分析进行了测试。

系数的估计值，平方和，自由度，F值和P值得总和列于表二。

很显然硫酸镁的线性方面是最明显的（P≤0.05）。

甘油，碳酸钙，酵母提取物这三条线是相互关联的，当P值小于0.05的系数时酵母提取物，碳酸钙和甘油这三条线相关性较高。

系数的相关性和差异性也给于表二。

R2的值0.9793是非常可靠的数学模型。

系数低表明变异（CV）值4.35％与处理进行比较的精确度。

计算值F43.98反应该模型的意义。

表一:在CCD矩阵中其相应的响应编码和实际的表格自主变量
表二：方差分析
A为甘油B为酵母提取物C为碳酸钙D为硫酸镁
从模型中获得四个组件的最佳浓度为40g/l甘油,17.72g/l酵母提取物,1.57g/l
硫碳酸钙,0.23g/l硫酸镁。

根据预测结果，为了验证最优化进行了实验。

辅酶Q10的最终产量为15.58±0.18㎎/l,这更接近用软件预测的结果。

3.3胡萝卜汁和番茄汁这下天然前体的影响
在这项研究中，胡萝卜和番茄汁被用作天然前体是因为他们富含聚苯焦磷酸盐，这项研究指出不同浓度的胡萝卜汁（100％，50％，25％）和番茄汁中辅酶Q10产量最佳在浓度为100％的胡萝卜汁，产量为27.86±0.2㎎/l。

辅酶Q10在番茄汁中产量比胡萝卜汁中要低。

两个细胞干重同时都比对照组明显要高，Natori and Nagasaki指出胡萝卜和番茄的提取物成份增强辅酶10形成亲水性的性质，是低分子量的。

他们还指出，这些成份在有机溶剂中不易提取和扩散，很容易透过半透膜。

相对于时间的生产概况，研究番茄汁和胡萝卜汁（100％）能够提高的最高辅酶Q10产量。

胡萝卜汁作为前提其甘油利用率比番茄汁作为前提要高。

96h后，其产量为29.22±0.51㎎/l辅酶Q10其细胞干重为5.72±0.05mg/l。

比用番茄汁做前体要高很多，番茄汁为前体时，只有24.35±0.012mg/l细胞干重4.9±0.04 g/l。

合成辅酶Q10的收益要比野生株假单胞菌高许多。

由于存在共同前提，可以归结为合成辅酶Q10和类胡萝卜素。

这证实了这种分析测定是前体是不稳固的方法。

增加各种前体可以进一步提高产量，通过工艺改进如分批发酵等，就像维生素和氨基酸。

这些研究都在进步。

图一天然前体培养缺陷假单胞菌，生产辅酶Q10细胞干重和甘油利用率关
系
4结论
使用统计法和天然前体综合的方法可以提高缺陷假单胞菌NCIM2865的辅酶Q10产量，研究表明使用胡萝卜汁和番茄汁作为天然前体生产辅酶Q10，结果是胡萝卜汁的效果要好。