5株植物乳杆菌的分离鉴定及耐受性比较研究

基金项目:沈阳市科学技术计划项目(Ｙ１９－３－０２７)
作者简介:孙小涵(１９９１ )ꎬ女ꎬ辽宁省沈阳人ꎬ硕士ꎬ主要从事动物肠道微生物菌群的研究ꎮ
∗通讯作者:吕福军(１９７６ )ꎬ男ꎬ辽宁沈阳人ꎬ博士ꎬ主要从事动物营养和酶制剂㊁微生态制剂等功能性饲料添加剂的研究ꎮ
５株植物乳杆菌的分离鉴定及耐受性比较研究
孙小涵㊀孙洪浩㊀陈秀秀㊀吕福军∗
(辽宁波尔莱特农牧实业有限公司ꎬ辽宁沈阳㊀１１０１２７)
㊀㊀摘㊀要:本试验旨在分离出抗逆性强的乳杆菌ꎮ从仔猪肠道中分离出的５株乳杆菌ꎬ利用生化试验和１６ＳｒＤＮＡ基因序列分析的方法鉴定菌株ꎬ通过细菌生长㊁产酸性能㊁耐受性等相关试验ꎬ确定所鉴定菌株的益生特性ꎮ结果表明ꎬ５个菌株经鉴定为植物乳杆菌(Ｌａｃｔｏｂａ￣ｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍꎬＬＰ)ꎬ分别命名为ＬＰ－０１㊁ＬＰ－０３㊁ＬＰ－０４㊁ＬＰ－１１和ＬＰ－２８ꎮ药敏试验发现
５株菌株大多对细菌细胞壁抑制剂敏感ꎬ如青霉素㊁哌拉西林和氨苄西林ꎻ对酸有很好的耐受性ꎬ其中ＬＰ１１在ｐＨ－２环境下表现出良好的生存能力ꎬ４小时活菌数仍提高１２.９５％ꎬ同时可以耐受０.３％胆汁ꎻ在人工胃肠液作用下ꎬＬＰ１１的存活率高达９５％ꎬ其他菌株对人工胃肠液也有明显的耐受性ꎬＬＰ０１和ＬＰ２８的存活率都在７０％以上ꎮ综上所述ꎬ从猪肠道中分离得到了植物乳杆菌ꎬ并具有良好的益生菌特性ꎮ
关键词:植物乳杆菌ꎻ益生菌ꎻ抗逆性
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ５ＳｔｒａｉｎｓｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ
ａｎｄＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＴｈｅｉｒＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ＳｕｎＸｉａｏｈａｎ㊀ＳｕｎＨｏｎｇｈａｏ㊀ＣｈｅｎＸｉｕｘｉｕ㊀ＬｕＦｕｊｕｎ
(ＬｉａｏｎｉｎｇＰｏｗｅｒｌｉｇｈｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＡｎｉｍａｌＨｕｓｂａｎｄｒｙＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｏ.ꎬ
ＬＴＤ.ꎬＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈｅｎｙａｎｇꎬＬｉａｏｎｉｎｇꎬ１１０１２７ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｉｓｓｔｕｄｙａｉｍｓｔｏｉｓｏｌａｔｅｔｏＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｗｉｔｈｓｔｒｅｓｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ.Ｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｓｏｆ
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｗｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅꎬｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄ１６ＳｒＤＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ.Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｍｏｎｇｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｓｐｅｃｉｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｒａｌｔｅｓｔｓｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｂａｃｔｅｒｉａｌｇｒｏｗｔｈꎬａｃｉｄｐｒｏｄｕｃ￣
ｔｉｏｎꎬｔｏｌｅｒａｎｃｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｆｉｖｅｓｔｒａｉｎｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ１ｎａｍｅｄｂｙＬＰ－０１ꎬＬＰ－０３ꎬＬＰ－０４ꎬＬＰ－１１ａｎｄＬＰ－２８.Ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｍｐｒｏｖｅｄｔｏｂｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｏｂａｃｔｅｒｉａｌｃｅｌｌ－ｗａｌｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｉ.ｅ.ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎꎬｐｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎａｎｄａｍｐｉｃｉｌｌｉｎａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｄｒｕｇｓｅｎｓｉｔｉｖｅｔｅｓｔ.Ｔｈｅｓｅｓｔｒａｉｎｓｍａｎｉｆｅｓｔｅｄｐｒｏｆｏｕｎｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏａｃｉｄｉｃ－ｓｔｒｅｓｓｗｈｅｒｅＬＰ１１ｅｘ￣ｈｉｂｉｔｅｄａｇｏｏｄｓｕｒｖｉｖａｌｐａｔｔｅｒｎａｔｐＨ－２ｆｏｒ４ｈꎬｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｔｉｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ１２.
９５％ａｎｄｔｏｌｅｒａｔｅｄ０.３％ｂｉｌｅ.Ａｆｔｅｒａｒｔｉｆｉｃｉａｌｇａｓｔｒｉｃｊｕｉｃｅａｎｄｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｊｕｉｃｅｔｒｅａｔｍｅｎｔꎬｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｖｉａｂｌｅｂａｃｔｅｒｉａｒｅａｃｈｅｄｍｏｒｅｔｈａｎ９５％.ＬＰ－０１ａｎｄＬＰ－２８ｄｉｓｐｌａｙｅｄｍａｒｋｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｇａｉｎｓｔ
ｔｒｙｐｓｉｎａｓｔｈｅｃｏｕｎｔｄｉｄｎｏｔｄｒｏｐｂｅｌｏｗ７０％.ＩｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇꎬＬａｃｔｏ￣ｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｗｉｎｅｉｎｔｅｓｔｉｎｅａｎｄｗｅｒｅｆｏｕｎｄｔｏｈａｖｅｇｏｏｄｐｒｏｂｉｏｔｉｃｐｒｏｐｅｒ￣ｔｉｅｓ.
ＫｅｙＷｏｒｄｓ:Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍꎻｐｒｏｂｉｏｔｉｃꎻｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
㊀㊀乳酸菌(ＬａｃｔｉｃａｃｉｄｂａｃｔｅｒｉａꎬＬＡＢ)在自然界中分布广泛ꎬ具有物种多样性ꎬ其中大多数物种能够在胃肠消化过程中存活ꎬ是已被证实的有效益生菌ꎮ它们被作为发酵剂培养物ꎬ增强食品的风味和口感ꎮ目前ꎬ已有研究表明嗜酸乳杆菌㊁布氏乳杆菌㊁干酪乳杆菌㊁唾液乳杆菌等乳杆菌可以在人和动物胃肠道内定植ꎬ并有益于维持肠道健康ꎮ植物乳杆菌是能够定植在人和动物体内定植的菌种之一ꎬ已被广泛用于发酵工业[３]ꎬ被认为是能够改善肠道健康ꎬ预防炎症性肠病和胃肠道感染的重要益生菌[４]ꎬ特别是在乳糖不耐受和降低胆固醇方面具有重要作用ꎮＭａｒａｇｋｏｕｄａｋｉｓ等人还发现植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对轮状病毒(ＲＶ)和传染性胃肠炎病毒(ＴＧＥＶ)具有抗病毒作用ꎮ
自２００６年ꎬ欧盟禁止使用抗生素作为生长促进剂ꎬ许多益生菌被用于畜牧养殖ꎮ益生菌作为抗生素的替代品在促进生长方面发挥重要作用ꎬ不仅不会引起药物反应ꎬ而且可在胃肠道中定植对致病菌起到竞争排斥的作用[７]ꎮ乳杆菌作为哺乳动物正常肠道微生物的重要共生菌ꎬ在猪肠道菌群构建的早期阶段同样占主导地位ꎮ但大多数乳杆菌的活力极弱ꎬ它们只能在特定的环境中存活ꎬ一旦这些环境发生改变ꎬ其自身将会灭亡ꎬ在复杂的肠道微生物中无法长时间占据主导地位ꎮ植物乳杆菌在胃肠道系统中常常会伴随各种不利环境的胁迫ꎬ因此ꎬ通过体外试验ꎬ以研究植物乳杆菌在机体消化道的生存能力ꎬ以突出其益生菌潜力ꎬ发挥植物乳杆菌最大的益生效果具有重要意义ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料
１.１.１㊀样品来源
仔猪肠道及新鲜粪便(法库康达生态农业有限公司)ꎮ
１.１.２㊀主要试剂
ＭＲＳ肉汤培养基㊁ＭＲＳ固体培养基㊁乳酸杆菌生化鉴定套盒购自北京陆桥技术股份有限公司ꎻ碳酸钙购自国药集团化学试剂有限公司ꎻ胆盐购自上海源叶生物科技有限公司ꎻ人工胃肠液购自北京雷根生物技术有限公司ꎻ乳酸(ＬＤ)测试盒购自南京建成生物工程研究所ꎮ
１.２㊀方法
１.２.１㊀富集
取５ｇ样品与１００ｍＬＭＲＳ肉汤培养基中富集ꎬ３７ħ培养３６－４８ｈꎮ
１.２.２㊀分离
取１ｍＬ富集的菌液置于１０ｍＬＭＲＳ肉汤培养基(ｐＨ３.０)中ꎬ３７ħ培养１２ｈ后ꎬ取１ｍＬ置于１０ｍＬ０.２％胆盐ＭＲＳ肉汤培养基中ꎬ３７ħ培养１２ｈꎬ稀释后涂ＣａＣＯ３ＭＲＳ平板ꎬ挑选产酸能力强ꎬ生长快的菌落进行划线分离ꎮ１.２.３㊀菌种鉴定
将分离菌株接种于ＭＲＳ肉汤培养基中ꎬ用３７ħ培养１８－２４ｈꎬ进行形态学鉴定ꎮ根据«伯杰氏细菌鉴定手册»对筛选的菌株ꎬ用乳酸杆菌生化鉴定套盒进行生理生化鉴定及１６ＳｒＤＮＡ分子生物学鉴定ꎬ由华大基因科技有限公司进行菌种鉴定ꎮ将测序的结果在美国国家生物信息中心(ＮＣＢＩ)数据库中进行ＢＬＡＳＴ分析ꎬ采用ＭＥＧＡ５.０软件构建系统发育树ꎮ
１.２.４㊀植物乳杆菌的产酸速度和产酸能力测定将菌株按２％的接种量接种于２００ｍｌ无菌ＭＲＳ肉汤培养基中ꎬ３７ħ培养ꎬ分别在０㊁４㊁８㊁１２㊁１６㊁２０㊁２４㊁２８㊁３２㊁３６㊁４０㊁４４㊁４８ｈ处取样ꎬ测ＯＤ６００值ꎬ并记录个时间段的ｐＨ值ꎬ４８ｈ测定乳酸浓度ꎬ每株菌做３个重复ꎮ乳酸的浓度用乳酸(ＬＤ)测试盒测定ꎮ
１.２.５㊀药敏试验
在ＭＲＳ肉汤培养基中按２％接种己活化的菌种ꎬ传２代ꎬ取活化后的菌液进行耐药性试验ꎮ体外药敏性试验使用Ｋ－Ｂ纸片扩散法ꎬ吸取１０８ＣＦＵ/ｍＬ的菌液２００μＬ均匀涂布于固体ＭＲＳ培养基上ꎬ待菌液被吸收后ꎬ将药敏纸片均匀贴在ＭＲＳ固体培养基表面ꎬ３７ħ培养ꎬ判定其耐药性ꎮ
１.２.６㊀耐酸试验ｐＨ
根据Ｍａｒａｇｋｏｕｄａｋｉｓ等人所描述的方法ꎬ将供试菌株接种于ＭＲＳ肉汤培养基中ꎬ活化培养２４－３６ｈꎬ１００００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎꎬ收集菌体ꎮ用无菌ＰＢＳ(ｐＨ－７.４)洗涤两次ꎬ获得菌体ꎮ将菌体用ｐＨ为２.５和６.４的ＭＲＳ肉汤培养基进行重悬ꎬ３７ħ培养ꎬ使用平板计数法在培养０ｈ㊁４ｈ活菌计数ꎬ计算存活率ꎮ
存活率(％)＝(４ｈ的活菌数/０ｈ的活菌数)ˑ１００
１.２.７㊀耐胆汁的试验
将培养好的菌液用ＰＢＳ重悬ꎬ菌株按２％(１０８ＣＦＵ/ｍＬ)接种到含０.３％和０.５％胆汁的ＭＲＳ肉汤培养基中ꎬ３７ħ培养５小时后ꎬ通过平板法记录５ｈ前后活菌数ꎬ计算存活率ꎮ计算方法同１.２.６ꎮ１.２.８㊀耐人工胃肠液试验
离心㊁冲洗获得菌体ꎬ用等体积的人工动物胃液重悬菌体ꎬ模拟胃液的消化作用ꎬ３７ħ８０ｒｐｍ培养４ｈ后ꎬ把人工胃液离心ꎬ获取消化处理过后的菌体ꎬ随后用相同体积的人工动物肠液重悬ꎬ培养条件同胃液ꎬ过夜培养１２ｈꎬ取样计活菌数ꎬ计算存活率ꎮ计算方法同１.２.６ꎮ
２㊀结果
２.１㊀菌种筛选及鉴定结果
从健康的仔猪肠道和新鲜粪便中共筛选出１２株有溶钙圈菌落ꎬ形态学鉴定表明ꎬ有９株是革兰氏阳性杆菌ꎮ根据«伯杰氏细菌鉴定手册»对菌株进行生理生化试验鉴定ꎬ有５株符合植物乳杆菌生理生化特性ꎬ如表１ꎮ将５株菌株用１６ＳｒＤＮＡ序列扩增测序ꎬ序列用ＧｅｎＢａｎｋ的ＢＬＡＳＴ进行比对ꎮ图１结果表明ꎬ这５株菌株均属植物乳杆菌属ꎬ与植物乳杆菌(ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍꎬＬｐ)有９９％的相似性ꎮ分别命名为植物乳杆菌０１(Ｌｐ０１)ꎬ植物乳杆菌０３(Ｌｐ０３)ꎬ植物乳杆菌０４(Ｌｐ０４)ꎬ植物乳杆菌１１(Ｌｐ１１)ꎬ植物乳杆菌２８(Ｌｐ２８)ꎮ
表１㊀５株植物乳杆菌分离菌生化鉴定结果
菌株编号七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖ＬＰ０１＋＋＋＋＋＋＋ｄＬＰ０３＋＋＋＋＋＋＋＋ＬＰ０４＋＋＋＋＋＋＋＋ＬＰ１１＋＋＋＋＋＋＋ｄＬＰ２８＋＋＋＋＋＋＋＋㊀㊀注: ＋ ９０％菌株阳性ꎻ － ９０％菌株阴性ꎻ ｄ １１％－８９％菌株阳性ꎮ
图１㊀５株植物乳杆菌１６ＳｒＤＮＡ基因系统进化树图２㊀５株植物乳杆菌的生长曲线及产酸速度的变化
２.２㊀产酸速度和产酸能力测定
由图２可见ꎬ５株植物乳杆菌生长速度和产酸无明显差异ꎬ从２－４ｈ进入对数生长期ꎬ１６－２０ｈ后开始趋于平稳生长ꎮ发酵液在初始阶段(０
~４小时)ｐＨ没有明显变化ꎬ从６ｈ开始明显降
低ꎬ２０－２４ｈ发酵液ｐＨ达到４.０左右ꎮ由表２可知ꎬＬＰ２８的产酸能力最高ꎬ培养４８ｈ乳酸含量可达８８.３１ｍｍｏｌ/Ｌꎮ
表２㊀５株植物乳杆菌乳酸含量
菌株编号ＬＰ０１ＬＰ０３ＬＰ０４ＬＰ１１ＬＰ２８乳酸(ｍｍｏｌ/Ｌ)
４７.１７ʃ０.１６
５９.４９ʃ０.４５
６９.５９ʃ０.４０
７１.６８ʃ０.４８
８８.３１ʃ０.１１
２.３㊀药敏试验
如表３所示ꎬ５株植物乳杆菌对新霉
素㊁庆大霉素㊁卡那霉素㊁丁胺卡那㊁杆菌肽
均有抗性ꎮ但对青霉素㊁土霉素㊁哌拉西林㊁氨苄西林㊁红霉素㊁头孢类等抗生素易感ꎮ
表３㊀５株植物乳杆菌的药敏试验结果
敏感度ＬＰ－２８ＬＰ－０１ＬＰ－０３ＬＰ－０４ＬＰ－１１药品名称敏感度ＬＰ－２８ＬＰ－０１ＬＰ－０３ＬＰ－０４ＬＰ－１１杆菌肽－－－－－头孢呋辛＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋头孢他啶＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋头孢曲松＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋土霉素＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋头孢哌酮＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋青霉素＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋丁胺卡那－－－－－苯唑西林＋＋＋＋＋＋庆大霉素＋＋＋＋－氨苄西林＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋卡那霉素－－－－－羧苄西林＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋新霉素＋＋＋＋＋哌拉西林＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋四环素＋＋＋＋＋＋头孢氨苄＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋多西霉素＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋头孢唑啉＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋米诺环素＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋头孢拉定
＋＋＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
＋＋
红霉素
＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋＋＋
＋＋＋
㊀㊀注:表中 － 表示不敏感ꎬ ＋ 表示低敏ꎬ ＋＋ 表示中敏ꎬ ＋＋＋ 表示高敏ꎮ
２.４㊀耐酸试验
表４数据表明ꎬ５株菌株在ｐＨ－２下４
小时具有良好的生存能力ꎬ其中ＬＰ１１在
ｐＨ２.０的酸性条件下生存能力最强ꎬ４ｈ后仍保持在正常生长状态ꎬ活菌数提高１２.
９５％ꎮ
表４㊀５株植物乳杆菌耐酸试验结果(ｐＨ－２)
菌株编号ＬＰ０１ＬＰ０３ＬＰ０４ＬＰ１１ＬＰ２８存活率ｐＨ－１０.５１％１.０８％１.０２％１.７６％０.４５％存活率ｐＨ－２
９７.１５％
８２.８１％
８２.０２％
１１２.９５％
８１.０３％
２.５㊀耐胆汁试验
如表５所示ꎬ在０.３％胆汁中ꎬ５株植物乳杆
菌生长良好ꎬ这表明这些菌株对胆汁的具有一定
的耐受性ꎮＬＰ１１表现出较高的耐受性ꎬ在０.５％胆汁中ꎬ存活率可达５８.９４％ꎬ明显高于其他４株植物乳杆菌ꎮ
表５㊀５株植物乳杆菌耐胆汁试验结果
菌株编号
ＬＰ０１
ＬＰ０３
ＬＰ０４
ＬＰ１１
ＬＰ２８
０.３％胆盐存活率６６.５４％５８.０９％５７.７４％７９.０６％６０.８１％０.５％胆盐存活率
３１.７６％
２６.１７％
０.０３％
５８.９４％
２８.０５％
２.６㊀耐人工胃肠液试验胃肠道中的恶劣环境不仅是ｐＨ和胆盐等
因素造成的ꎬ胃肠液中各种消化酶ꎬ如胃蛋白酶㊁胰蛋白酶等ꎬ都对微生物有较强的抑制和致死作用ꎮ在体外模拟胃肠道实验ꎬ研究植物乳杆菌的生存能力ꎮ如表６所示ꎬ植物乳杆菌在胃液培养４ｈ及肠液过夜处理后ꎬ活菌数虽有不同程度的下降ꎬ但各菌株对胃肠道的耐受能力很强ꎬ在胃肠道内能够一直保持较高的菌浓度ꎬ都在１０９ＣＦＵ/ｍ以上ꎬ可以在肠道内发挥作用ꎮ
表６㊀５株植物乳杆菌耐人工胃肠液试验结果
菌株编号进入胃液前
菌液活菌数
胃液处理４ｈ后
菌液活菌数
胃液处理４ｈ
后存活率
肠液过夜处理１２ｈ
菌液活菌数
肠液过夜处理
１２ｈ存活率
ＬＰ０１４.２ˑ１０９４.０２ˑ１０９９５.７１％３.３８ˑ１０９８０.４８％ＬＰ０３１.６５ˑ１０１０１.３５ˑ１０１０８１.８２％５.５５ˑ１０９３３.６４％ＬＰ０４１.３５ˑ１０１０１.１１ˑ１０１０８２.２２％７.２ˑ１０９５３.３３％ＬＰ１１３.７ˑ１０９４.２４ˑ１０９１１４.５９％３.５５ˑ１０９９５.９５％ＬＰ２８１.２７ˑ１０１０１.０２ˑ１０９８０.３１％８.９ˑ１０９７０.０８％
３㊀讨论
本研究的重点是评价所筛选植物乳杆菌的一些益生菌属性ꎮ首先ꎬ根据乳杆菌的生化鉴定表明ꎬ５株植物乳杆菌均具有一定的生物活性ꎬ与植物乳杆菌同源性为９９％ꎮ评价一个益生菌的基本标准之一是在不利条件下的生存潜力ꎬ我们对植物乳杆菌进行了体外试验ꎬ模拟猪的消化道内环境ꎬ研究植物乳杆菌在宿主的内环境的作用下的益生功能ꎮ
植物乳杆菌具有广泛的益生特性ꎬ可供开发利用成为新的益生菌发酵食品[９]ꎮ但益生菌在摄入后ꎬ必须要经受住胃的强酸性环境ꎬ以及消化酶的作用ꎬ及外来抗生素等物质的干扰ꎬ并在高浓度胆汁中存活ꎬ才能在肠道内定植发挥作用ꎬ这是益生菌在消化的初始阶段至关重要的ꎮ因此ꎬ一个有效的益生菌必须能够在酸性环境和高浓度的胆汁中生长[１２]ꎮ通过药敏试验显示ꎬ植物乳杆菌对常用于细胞壁抑制剂的药物敏感ꎬ如青霉素㊁哌拉西林和氨苄西林等ꎬ同时对头孢类和红霉素也及其敏感ꎮＬＰ０１和ＬＰ１１对新霉素㊁庆大霉素和卡那霉素等９种抗生素有抗性ꎬ也可作为植物乳杆菌候选菌株ꎮ
Ｗａｎｇ等人[１３]从断奶仔猪中分离到的植物乳杆菌的在ｐＨ－２时存活率迅速下降ꎬ但在ｐＨ－３时可以存活ꎮ我们在耐酸性试验中发现ꎬ５株植物乳杆菌对ｐＨ－１的酸性环境很敏感ꎬ几乎无法存活ꎮ但在ｐＨ－２时ꎬ４ｈ后有较好的存活率ꎬ表明即使在禁食条件下ꎬ益生菌也有可从猪胃中成功转运到肠道ꎮ尤其ＬＰ１１在ｐＨ－２的酸性条件下ꎬ不仅保持较好的活性ꎬ还可以保存生长特性ꎮ５株植物乳杆菌在ｐＨ－２时整个过程中存活率达到８０％以上ꎬ表明有大量菌株有足够的机会到达肠道ꎬ以有效地发挥益生菌的作用ꎮ另一项类似的研究报告了３０种乳杆菌ꎬ包括嗜酸乳杆菌㊁植物乳杆菌㊁副乳杆菌㊁鼠李糖杆菌ꎬ在
ｐＨ－３可维持３小时的活力ꎬ但在ｐＨ－１时仅一个小时菌株活力明显下降ꎮ还有一项类似的研究也表明ꎬ植物乳杆菌在ｐＨ－２和ｐＨ－３时在２－６小时内表现出良好的存活率ꎬ虽然随着培养时间的增加ꎬ数量略有减少ꎬ活菌数在ｐＨ－２下降到５０％以下[１４]ꎮ
胆汁耐受性是益生菌的另一个关键特性ꎬ因为它决定了益生菌在小肠中的生存能力ꎬ从而调节益生菌发挥功能作用[１５]ꎮ植物乳杆菌能耐受高浓度胆汁表明其具有良好的益生菌特性ꎮ在我们的研究中发现０.３％和０.５％胆汁并没有完全抑制植物乳杆菌的生长ꎮ但与本研究一样ꎬ当胆汁盐浓度增加时ꎬ益生菌生物活力的逐渐下降[１６]ꎮ造成这一现象的原因可能是益生菌与胆盐[１７]结合所致ꎮ所以ꎬ为了维持益生菌在肠道内的活性ꎬ需要持续不断的给机体补充益生菌ꎬ以发挥其益生作用ꎮ
益生菌进入机体后ꎬ胃液及肠液都是益生菌顺利抵达肠道的阻碍ꎮ益生菌要到达肠道末端发挥益生功能ꎬ除了必须通过胃液的酸性环境ꎬ还要抵抗胃蛋白酶的作用ꎬ以及复杂的胃肠道环境ꎬ因此许多学者在益生菌的胃肠道抗逆性上做了大量研究ꎮ我们模拟胃肠道试验结果表明ꎬ有
４株植物乳杆菌在整个胃肠道消化期内可以保持５０％以上的存活率ꎮＬＰ１１存活率达到９５％以上ꎬ保证了益生菌在胃肠道转运过程中ꎬ它们的生长和存活将不受消化液的影响ꎮ由此可见ꎬＬＰ－１１在耐酸碱和消化液等抗逆性上ꎬ与其他４株植物乳杆菌相比ꎬ具有明显益生优势ꎬ更加适用微生态制剂的生产和应用ꎮ为了将益生菌候选菌株进一步用于商业应用ꎬ后面将进行体内研究ꎬ以了解它们在动物机体中的有益作用ꎮ
参考文献
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